一チャネルセル付パッチクランプ法

Summary

ここで説明するには、セルに接続されたパッチクランプ技術を用いて1イオンチャネルから現在の記録の長いストレッチを取得するための手順です。この方法は、リアルタイムで、観察するための生体信号の基礎となる開閉チャネルコンフォメーションのパターンを可能にする。これらのデータは、邪魔されずに生体膜におけるチャネルのプロパティをお知らせ。

Abstract

イオンチャネルタンパク質は、生体膜を通過高速通信用の汎用デバイスである。それらが生成するイオン流束の時間的なシグネチャは、各チャネルタンパク質ならびにその生成および制御される機構の固有の性質に依存しており、現在の研究の重要な領域を表す。イオンチャネルタンパク質の操作動力学に関する情報は、単一の分子によって生成される電流の長いストレッチを観察することによって得ることができる。リガンド依存性イオンチャネル、NMDA受容体に対する1チャネルセル付きパッチクランプ電流記録を取得するためのプロトコルがここに記載され、皮質ニューロンでHEK293細胞においてネイティブまたは異種発現。また、機械刺激感受性チャネルPIEZO1の例を提示することによって、関心のある他のイオンチャネルにメソッドを適応させる方法についても提供される。この方法は、チャネルのコンダクタンス特性とOPEの時系列に関するデータを提供することができますこのように健康と病気にそれらの機能を理解するために貢献し、チャネルの活性化機構を構成しているN-クローズコンフォメーション。

Introduction

生体膜を横切る高速通信は、一般にチャネルと呼ば膜タンパク質を形成するオリゴマーの細孔にほぼ排他的に依存している。これらのタンパク質は、活性化信号、ゲーティングメカニズム、コンダクタンス特性において大きく異なっている。細孔がイオンに対して選択的であるチャネルタンパク質をイオンチャネルとして分類される;それらの活性化は、膜を横切るイオン電流を生成し、その応答は、電気生理学的技術を使用して、即座に高解像度で記録することができる。活性化信号は、濃度勾配、機械的および電気的な力、および温度などの化学的および物理的入力の幅広いまたがる。従って、さらなるゲートさリガンドへのイオンチャネルを分類する機械受容電圧は、ゲート、または敏感型を加熱する。この記事では、プロトコルは、パッチクランプ技術を用いて、リガンド依存性チャネル、NMDA受容体、および機械受容チャネル​​、PIEZO1から1チャンネル活性を記録するために記載されている。0;

パッチクランプ電気生理学は、単一分子^1,2の観察を可能にするのに十分な感度最初の最も広く使用された実験方法である。この優れた感度に加えて、それは非常に電気生理学的記録に従う生物学的製剤を拡大しており、また、無傷の膜におけるイオンチャネルの観察を可能にした。電圧クランプと電流の記録の両方が同じ電極を用いて達成されているので、まず、小さな細胞または膜パッチを横切って信号を記録するために使用することができる。技術は、イオンチャンネルがカエルの筋肉、ウナギelectroplaques、またはイカ巨大軸索^3,4の興奮性膜に限定されないことが明らかになったのではなく、それらは、膜貫通シグナル伝達機構のユビキタス器具を表し、単方向または全ての細胞膜の種類に固有であること多細胞生物、また細胞内膜へ。インポートantly、単に無傷の細胞にガラスピペットを取り付けることにより、貫通電流を記録する機能は、ネイティブ破壊されていない膜内のイオンチャネルからの活動を記録するために前例のない機会を提供した。したがって、このプロトコルに記載されているセル取り付けパッチクランプ技術は、数十分又はそれらの天然の環境においてより長い連続イオンチャネルの活性をモニター可能にする。

通常の熱揺らぎの下では、イオンチャネルタンパク質を含む全てのタンパク質は、側鎖の動きと全体の再配置によって表される非常に遅く、あまり頻繁に変更することによって最も可能性の高い表現最速かつ最も頻繁に再編成に、幅広い時間スケールにわたる構造的な変化を受けるドメインまたはサブユニット、または翻訳後修飾またはタンパク質-タンパク質相互作用^5,6によっていくつかの場合において。 1分子によって生成された活動の長い期間を観察すると、機能を理解するのに役立ちます完全な生理的膜におけるイオンチャネルのtionalダイナミクスと観測され、分子の動作メカニズムについての貴重な情報を提供します。

細胞型および発生段階を横切るイオンチャネルの多様性の増加理解とは対照的に、天然の膜におけるイオンチャネルの分子組成についての知識は、依然として限られている。すべてのイオンチャネルは、多量体タンパク質であり、天然イオンチャネルの大部分は、多くの場合、多様なコンダクタンスとゲーティング特性を伴う広い分子多様性のタンパク質を産生するサブユニットのいくつかのタイプから組み立てる。このため、規定された分子組成物のイオンチャネルは、異種系での発現の際に検討されている。具体的には、不死化したヒト胚性腎細胞のクローンライン⁷であるHEK293細胞は、組換え型イオンチャネルの異種発現のための好適なシステムとして広く受け入れを得た。男の中イオンチャネルの電気生理学のための選択シス​​テムは、培養の容易さと低価格であり、長寿命、安定した培養物を維持するように、哺乳動物タンパク質の翻訳後フォールディング、プロセシングおよび輸送を行う能力をHEK293細胞を上昇yの利点は、多くの場合、その低レベルまたは対象^7、8のチャネルのための内因性発現のさえない状態。組換えイオンチャネルを発現し、HEK293細胞におけるそれらの機能的特性を研究することは構造 - 機能イオンチャネルの特性ならびにイオンチャネルアイソフォームおよび天然組織におけるそれらの役割の特定のプロパティに関する情報を取得する価値のあるアプローチであり続けている。この資料に記載されているプロトコルは、HEK293細胞において発現された組換えイオンチャネルおよび天然イオンチャネルにも同様に適用することができる。

要約すると、その前例のない能力を介してパッチクランプ技術は、信号を解決するために一つの分子からのsは、今日まで、単一分子の挙動を観察するための最も直接的な方法のままである。その細胞結合型モードでは、パッチクランプ記録は、一分子のために行わ、長い観察期間を可能にするイオンチャネルの動作中に例外的な洞察を提供することができる。以下に一つのイオンチャネルタンパク質を含む細胞取り付けパッチから高分解能電流記録を取得するためのプロトコルが提供される。

Protocol

1。細胞培養およびタンパク質発現

1. HEK293細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したDMEM中で単層培養中で、ATCCにより行わ通路を含み、通路22と40との間（ATCC番号CRL-1573）、および5％CO ₂で1％ペニシリン/ストレプトマイシン混合物を維持する37℃実験の間、10mlの最終体積の5〜20倍希釈でT25フラスコに継代細胞。注：これらの通路の間に細胞を使用することで、最適なシール形成及びパッチの安定性を可能にする、良好な細胞の健康を保証します。
2. トランスフェクションのために、皿当たり細胞懸濁液を〜0.5〜0.6ミリリットルに相当〜10 ⁵細胞/皿の密度で35mmディッシュにHEK293細胞をプレート18〜24時間、2ミリリットル培地中で細胞を増殖させる。
3. 無菌1.5ミリリットル遠心管では、（この順序で）追加することにより、4 35mmディッシュ用のトランスフェクション混合物を準備し、それぞれのcDNA（GluN1、GluN2A、およびGFP）の（1）1μgのを。 （2）315μlを蒸留水（のddH ₂ O）; （3）42mMの350μlの4 - （2 -ヒドロキシエチル）-1 -ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、沈殿物を形成するために使用されている通り2.5 M CaCl _2を降下、（4）35μLを。
4. 5秒間ボルテックスチューブと4 35mm皿のそれぞれにトランスフェクション懸濁液​​175μLを加え、今50から60パーセントの集密度で細胞を含有し、2時間37℃で細胞をインキュベートした、前日に播種した。
5. トランスフェクション培地を吸引除去オフは、PBSで洗浄し、NMDA受容体媒介興奮毒性^9を防止するために2mMのMgCl ₂を補充した増殖培地2mlと交換してください。注：細胞は電気生理学的記録の24〜48時間後、トランスフェクションのために使用することができる。

2。電極の準備

1. 垂直プラーとホウケイ酸ガラス管を引くことによって2対称記録ピペットを生成します。その結果、チップの大きさや形状に基づいて、さらに形状ピペット研磨機を使用して。注：先端サイズを視覚的かつ電気的に評価することができる。視覚的には、外径が1.4から5.6程度の範囲でなければならない。電気的には、細胞外液で満たされた、最適なサイズのチップは、（ 図2B参照 ）12月24日MΩの範囲の抵抗を生成する必要があります。
2. セル添付の実験のために、最大のチャネル活性と高い電流振幅を生成する細胞外環境を表しピペット溶液を使用してください。注：（NMDA受容体の場合、これは、アゴニスト（グルタミン酸およびグリシン）の飽和濃度を含有する溶液に対応する二価の陽イオン性阻害剤および遮断剤をキレート1mMのEDTA、及び唯一つの透過イオンとしてナトリウム（150ミリモル）の生理的濃度を有するmM単位：1グルタミン酸、0.1グリシン、1N NaOHでpHを8.0に緩衝さ150のNaCl、2.5 KClを、1 EDTA、および10 HEPBS、）。

3。セルに接続されたパッチクランプ法

1. オープンQUBデータ取得ソフト制（www.qub.buffalo.edu）RE、および「レイアウト」の下で取得ウィンドウを選択します。 「ファイル」と題し、ドロップダウンメニューの下に「新しいデータ」をクリックして新しいQUBデータファイル（QDF）を開き、次の初期パラメータに入力します。サンプリングレート、40 kHzと; A / Dスケーリング、3,000;出力チャネル、1;とA / Dデータサイズ、2は、データファイルを右クリックして[プロパティ]を選択し、「データ」タブをクリックすることで、0.1V / PAに振幅スケーリングを調整します。注意：これらのパラメータは、セルに接続されたモードでモデル細胞を用いて、各セットアップのために改良することができる。 QUBソフトウェアとQDF特性を備えたデータ収集に関する追加指示がwww.qub.buffalo.eduでオンラインになっている。
2. 細胞を発現するイオンチャネルを含有する35mmディッシュを選択して、カルシウム及びマグネシウムを含有する2mlのPBSに成長培地を交換し;顕微鏡のステージ上に料理をマウントして、細胞が健康で、よくお皿に付着していることを評価するために、位相差顕微鏡を使用してセルラーフィールドに焦点を当てる単層のファッション（ 図1A）であった。トランスフェクションは（ 図1B）成功したことを確認するために蛍光検出に切り替えます。注：蛍光強度の範囲は、タンパク質発現の粗尺度として用いることができる。
3. 単一チャネルの記録のために、×10、アンプ出力ゲイン= 1βに対するパッチ構成、10 kHzのアナログフィルタ、クランプを電圧モードに設定し、100 mVの電圧を適用した。電圧がOFFの位置にコマンドを保持して、「シールテスト」ボタンを選択します。
4. 蛍光と細胞の健康に基づいて、パッチを適用するセルを選択します。細胞がウェルディッシュに接続されていることを位相コントラスト下で確認し、パッチ適用のために露出細胞表面の大部分を有し、他の点では健康に見える。注意：アプローチとパッチクランプの間に細胞を漂白避けるために、位相差照明を維持します。
5. それはelectrodに接触するようにちょうど足りるだけの水でたての研磨ピペットを埋めるE、ゆっくり振る先端に捕捉された気泡を取り除くために。ピペットホルダーのシールねじを締めると銀線をピペット溶液に浸漬されることを確認することで、アンプのヘッドステージ上に記録ピペットを固定します。
6. チュービングによりピペットホルダに接続されている小（5ccの）プラスチックシリンジを用いて、穏やかなアプローチ（ 図2A）の間にチップを入力し、目詰まりを防止するために、不純物の正の圧力を加える。
7. マイクロマニピュレーターを用いて、浴中にピペットを指示し、電気回路を開閉する ​​（ 図1C）をパッチするために選択したセルの上に直接配置します。アンプのシールテスト信号（ 図2B）に対応した矩形波を示す必要があり、これをオシロスコープに注意してください。注意：お風呂に入ると、最適な範囲内でピペット抵抗は、12月24日MΩです。 5 mVの試験信号は、測定された電流rをANGEは、〜20〜40 PAに対応している。
8. オシロスコープで電気顕微鏡ピペット抵抗を介して視覚的にピペットの位置を監視しながら、ピペットは、細胞を軽く当たるまで、少しずつアプローチを続け、テスト信号が増加した抵抗（ 図2B）を示すために、わずかに減少します。
9. 、シールを形成する注射器を手に取り、記録ピペットの先端に細胞膜を引っ張り、GΩ抵抗シール¹⁰の形成を開始シリンジプランジャを引いて、横方向のチューブを通して若干の負圧を適用する。シール形成が見えるだけの容量トランジェント（ 図2B）で、その完全な平坦で示されているオシロスコープでテスト信号波形に注意してください。注：信号が完全にフラット化しない場合、またはベースラインにノイズになると、これはシールの周りにかなりの電流リークと弱シールを示している。これはRを防ぐことができます1チャネル電流をesolving。この場合は、セルからピペットを撤回し、離れてお風呂から、ヘッドステージから削除し、それを廃棄します。適正な範囲（≥1GΩ）にシールを得るまでたて研磨ピペットを用いて処理を繰り返します。
10. アンプに、「オフ」に「シール·テスト」から外部コマンドトグルを切り替える。 （「オフ」にあらかじめ設定された）正にコマンドを保持して電圧を切り替える。およびX100にゲインを上げる。存在する場合、以前にフラットベースライン（ 図2C）からの方形上向き振れとして表示されますが、チャネル活性のためのオシロスコープを、観察します。
11. チャネル活性をオシロスコープに表示されている場合は、「録画」ボタンが続く「プレイ」ボタンを押すことで、QUBで以前に開かれたデジタルファイルにデータを取得する。 、データの取得を停止QUBに停止ボタンを押して簡単にretrievにQDFファイルを保存するには「ファイル」と題し、ドロップダウンメニューで[名前を付けて保存データを保存...」を選択することにより、コンピュータのハードドライブ上のことができる場所。

4。データの前処理や理想化

注：重要情報（最も簡単な場合には、閉じているか開いて）適切な伝導度クラスに、各データ点を割り当てる統計分析により、単一チャネル記録から抽出することができる。このプロセスは、データの理想化と分節K手段（SKM）QUBのメソッド^11を以下に説明されているとのデータ理想の簡単な説明と呼ばれている。

1. QUB内のデータファイルを開き、「レイアウト」の下の「前」のインターフェイスの現在のトレースを表示。というボックスオフにして（デジタルフィルタを削除します）フィルタリングされていない記録されたファイルを表示する」のFcを。 '
2. 視覚的に凹凸や成果物（ 図4A）を発見するレコードをスキャンしてください。そのoccu正しい短時間の電流スパイクRトレース内で、同じコンダクタンスクラスの隣接するクリーンな領域を選択する、この領域をハイライトして右クリックして選択することで（ 図4A） 'を設定、消去バッファを。'個々のサンプル·ポイントが表示されるまでのスパイクにズームイン、交換する地域を選択して、この領域のみとし、右クリックして「消去」を強調することで消去する。
3. ベースラインが安定しているレコードの初期の部分を選択することで、レコード全体のためにゼロ電流のベースラインを定義して、ハイライトして右クリックし、「設定のベースライン]を選択します。正確に表示されるガイドラインは、（ 図4Bの紫）ベースラインレベルを表していることを確認します。
4. 生データのベースラインが設定されたベースラインから目に見えて外れたレコード内のポイントを特定します。逸脱した領域内のベースラインの小さなセクションを選択することにより、これを修正し、右クリックして「ベースライン·ノードを追加」コマンドを選択します。
5. Tの領域を識別彼は簡単に（ 図4C）を補正することができない過剰ノイズやアーチファクトを含む記録。破棄されるべき領域をハイライト表示し、右クリックして選択し「削除してください。 '注：この場合、運動の情報が失われます。処理されたレコードが短くなり、接続点の後に発生するポイントは、事前にノイズ領域に連続して表示されます。
6. SKMアルゴリズム^11を使用してレコードを理想化するには、オープンとクローズの両方のイベントを含むトレースの一部を強調表示し、下の「モッズ」インターフェースに入力'レイアウト。' 「モデル」パネルで、黒四角（閉じた状態）を右クリックして、「グラブ」を選択し、ファイル全体のベースラインを表している微量のきれいな部分を強調表示します。オープンコンダクタンスを強調することによってチャネル開口部のために同じことをする、右「モデル」パネルで、赤い四角をクリックして、「グラブ」を選択します。
7. idealizaを実行下の「ファイル」ボタンを選択して、レコード全体のためのTiON「データソース」。分析用に必要なパラメータが正しいことを確認し、[]をクリックする「モデル」セクションの下に「理想化」タブを右クリックして「ファイル名を指定して実行。 '理想化の結果は、ファイル全体に対する振幅ヒストグラムと一緒に、理想の目視検査（ 図5）を可能にするデータと重ねられる。注意：不適切な理想化はQUBが実際に発生していないチャネル開口部とクロージャを検出する「偽のイベント、 'の発生につながる可能性があります。アンプのアナログフィルタとサンプリングレートによって設定された記録解像度内では、SKMの開閉イベントを検出すると解像度が分析のためデッドタイムを設定することによって制御することができる。最適なデッドタイムは、試行錯誤によって選択する必要があり、サンプリング·レートに依存しますが、経験則である2〜3のサンプル¹²でデッドタイムを選択します。
8. 理想化が正確に生データを表していることを確認するには、手動で理​​想化トレースをスキャンします。理想の誤差の同定に、偽のイベントの上にトレースをハイライト、右クリックし、「IDLに参加してください。 '注意：追加のオプションやQUBにおける様々なコマンドおよび機能の詳細な説明については、QUBマニュアルオンライン（www.qub.buffalo.edu）を参照してください。

Results

組換えNMDA受容体

NMDA受容体は、結合して、2コアゴニストの同時動作に対応：グルタミン酸およびグリシン。彼らはGluN1サブユニットとGluN2サブユニットを結合2グルタミン酸結合2グリシンのヘテロ四として組み立てる。 GluN2サブユニットは、4つの遺伝子（A〜D）でエンコードされており、これらの脳の中で最も広く、転写形式はGluN2A少年動物で大人とGluN2Bである。なぜなら（ 図1A）サブユニット組成の制御、並びに微細研磨したガラスピペット（ 図1C）を用いてチャネルからの電流を記録する機能を可能にするHEK293細胞において受容体を発現する天然の調製物中のNMDA受容体サブタイプの多様性。

ピペットが細胞に接触した後、試験パルス波形の振幅の明らかな減少が、シールを形成する能力を示す（ 図2B）が発生する。一つを含む十分なシールチャネルは、正の電圧（ 図2C）...

Discussion

イオンチャネルフィールドで、研究の重要な領域は、開口部またはチャネルのゲート機構をチャネルにつながるイベントのシーケンスを理解するに捧げられています。ほとんどのチャネルの場合、このプロセスは複雑であり、巨視的なマルチチャネル信号から推定することができないいくつかの動力学的工程を含む。対照的に、実験は、単一チャネル記録内のオープン/クローズイベントのシーケンスを観察する機構をゲーティングに関するより詳細な情報を得ることができる場所に設計することができる。ここに記載される方法において、NMDA受容体が有する外部に配置リガンド結合ドメインは、一定の条件下で実施される最小侵襲性パッチクランプ記録を可能にする。このプロトコルは、リガンドと受容特性の両方に依存する他のリガンド依存性イオンチャネルを調査するのに適しているために適合される必要があり得る。

単一チャネル活性のレコードは、貴重な情報の2種類を提供する。まず、単一の電流振幅を直接測定することができるので、実験は、そのようなチャネルコンダクタンス、透過性及び選択性のような細孔特性についての情報を得るように設計することができる。第二に、開閉...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
化学薬品	シグマ	各種
ホウ珪酸ガラス	サッター	BF-150-86-10
明視野倒立顕微鏡	オリンパス	1x51	ニコンも同様の顕微鏡を持っています
蛍光ボックス	X-cite	シリーズ120
液体ライトガイド	X-cite	OEX-LG15
マイクロマニピュレーター	Sutter Instruments	MP-225
オシロスコープ	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQカード	National Instruments	776844-01
プーラー	成重	PC-10
ポリッシャー	成重	マイクロフォージ MF-830
ファラデーケージ	TMC	8133306
高速圧力クランプ	ALA サイエンティフィックインスツルメンツ	ALA HSPC
プレス/バキュームポンプ	ALA サイエンティフィックインスツルメンツ	ALA PV-PUMP	HSPC-1用