アン生体外文化システム

サマリー

このプロトコルは、マウス胚性甲状腺の解剖と、半多孔質フィルターまたは顕微鏡プラスチックスライド上の外植片の培養について説明しています。このシステムは、野生型またはノックアウト胚の甲状腺発生中に発生する形態形成または分化イベントの研究に理想的であり、機能獲得および機能喪失実験に適しています。

要約

甲状腺は、甲状腺ホルモンT3、T4、およびカルシトニンの生産、首の付け根に局在bilobated内分泌腺である。カルシトニンは、卵胞及び毛細血管の密なネットワークとの間に散在C-細胞により合成されている間T3及びT4は、毛包と呼ばれる閉じた球に編成分化甲状腺細胞によって産生される。成人甲状腺アーキテクチャおよび機能は、広範に記載され、研究されてきたが、「アンギオ濾胞」単位、実質におけるC-細胞の分布および上皮および内皮細胞間のパラクリン通信の形成ははるかに理解されるからである。

この方法は、半多孔フィルターまたは顕微鏡プラスチックスライド上のマウス胚性甲状腺原基の解剖とその文化の連続的なステップを説明します。 4日間の期間内に、この培養系は、忠実にインビボ甲状腺開発に再現する。確かに、（I）億臓器のobation（II）の前駆体は卵胞に整理し、分極、（III）甲状腺細胞およびC細胞が分化甲状腺細胞、及び（iv）顕微解剖した組織が増殖に存在する内皮細胞が、中に移動し、（E12.5外植片の場合）が発生密接に甲状腺ローブ、彼らは生体内でそうであるように、上皮細胞に関連付ける。

甲状腺組織は、野生型、または蛍光ノックアウトトランスジェニック胚から得ることができる。さらに、培養物は、抗体、成長因子、または細胞または馴化培地を遮断、阻害剤を添加することによって操作することができる植片。 エクスビボ開発は、リアルタイムで、または培養の任意の時点で免疫染色およびRT-qPCRにより分析することができる。

結論として、下流のホールマウントでまたはセクションイメージングと遺伝子発現プロファイリングに合わせて甲状腺移植片培養は甲状腺Oの形態形成と分化のイベントを操作し、研究するための強力なシステムを提供していますrganogenesis。

概要

甲状腺は、内皮毛細血管の密なネットワークに囲まれた毛包と呼ばれる独立した上皮の球を集め、、です。この組織は、甲状腺機能ができます：内皮毛細血管はT3とT4ホル​​モン合成に必要なヨウ素と甲状腺細胞を、提供し、全身に後者を配布します。卵胞と毛細血管の間に散在し、C細胞は、低カルシウム血症ホルモンカルシトニン^1を生産する。成人甲状腺アーキテクチャと機能はよく知られているが、甲状腺胚発生（卵胞形成および分化）に関与する細胞および分子メカニズムははるかに理解されるからである。

胚発生の間に、（C細胞の前駆細胞が滴状突起としてE11.5で発信しながら、先祖は、胎生（E）は、マウス胚における8.5で腸内胚葉の腹側の壁の肥厚（正中原基）として開始甲状腺細胞鰓BO第咽頭袋^2-6のダイ）。正中芽はその後、内胚葉から切り離し気管の両側の鰓後体にE13.5で融合する二国間拡張されます。最後に、甲状腺細胞は、毛包に整理して、C-細胞が分化する。

甲状腺形成に関する現在の知識は、主に固定組織の組織学的分析から来ているが、甲状腺形成に関与する形態形成のイベントは非常に動的であり、異なる細胞種間および細胞外マトリックスとの通信との相互作用を伴う。最近の研究は甲状腺細胞の前駆細胞を開発し、甲状腺への内皮細胞を補充するための高レベルのVEGFを生産し、今度は、内皮細胞は毛包の形成を促進し、C細胞分化⁷募集していることを示した。

甲状腺に最もex vivoでの研究では、どちらかの2D組織培養プラスチックdに成長し、孤立した成人の甲状腺由来の細胞で行われてきたishesまたは3Dマトリックス中。文化のこれらのタイプの分化した細胞濾胞偏光したままと卵胞として組織化や3D組織^8月10日の再取得のいずれかを使用して。しかしながら、それらの生理学的環境から外植し、2Dで培養されたこれらの純粋な上皮細胞は、細胞外基質、サイトカイン、成長因子、それらがインビボで通常遭遇するような内皮細胞または神経細胞などの他の細胞型との相互作用を無視する。非常に素晴らしい研究は、最近、3Dマトリゲル¹¹における最終培養工程を用いて、甲状腺濾胞内にES細胞の分化プロトコルを記載した。しかしながら、これらの3D培養物は、他の細胞型との接触を欠いている。

膵臓および唾液に、前の専門知識に基づいて器官培養^12-14腺、マウス胚性甲状腺原基を解剖し、半多孔フィルターまたは顕微鏡プラスチックスライド上植片を培養する方法が開発されました。

時E12.5胚での作業、甲状腺原基（正中原基および2横鰓後体）の二重の起源は、組織の大きなフラグメントのマイクロダイセクションを課した。これは気管ではなく食道を含有し、披裂腫れまでの咽頭弓の動脈から延長した。フィルター上に培養した場合、正中原基は、それらがまだ狭い狭部によって接続された2つの甲状腺ローブを形成し、鰓体と融合気管の各側に横方向に延びている。

文化では、上皮細胞が増殖し、毛包に整理し、その起源に応じて、甲状腺細胞およびC細胞に分化する。マイクロダイセクション組織に含まれる内皮細胞は、増殖し、最終的には独立して血液の流れや循環要因の上皮濾胞構造と密接に関連付けるために、甲状腺葉に侵入。外植片の開発は、忠実に開発し、生体内で再現するようにMENTは、この培養系は、甲状腺の開発中に発生する形態形成と分化事象を研究することが最適である。

甲状腺組織は、野生型、または蛍光ノックアウトトランスジェニック胚から得ることができ、培養系は、損失および機能獲得実験に適している。最終的には、顕微鏡のプラスチック皿上で蛍光標識した甲状腺外植片のタイムラプスイメージングは、より良い生体内で起こる反応速度と形態形成の動きの連続性を調査するために悪用される可能性があります。タイムラプスイメージングは既に膵臓^15,16または尿管芽¹⁷の分岐形態形成を研究するために使用されています。

プロトコル

マウスは大学動物福祉委員会の実験動物ケアの原則に従って上昇し、処理した。すべての手順およびプロトコルは、この委員会によって承認された。

1。顕微鏡プラスティックカルチャーチェンバースのコーティング

注：層流フード内で無菌条件下で、以下のすべての手順を実行します。コー​​ティングの2種類が、機能的に同等です。

1. 甲状腺組織の単離の前に一日フィブロネクチンで被覆プラスチック培養チャンバ。
   1. 100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、0.25μg/ mlのファンギゾンおよび2mMグルタミン¹²を補充したM199培地中で50μg/ mlの最終濃度に無菌フィブロネクチンを希釈します。
   2. 希釈したフィブロネクチン200μlの井戸をカバーし、4℃の冷蔵庫に一晩インキュベートする。
   3. 解剖の日に、M1で一回井戸をすすぎ、フィブロネクチンを吸引99および抗生物質、グルタミンおよび10％ウシ胎児血清を補充したM199200μlを最小ボリュームを追加する。
   4. 外植片をめっきする準備ができるまでインキュベーターでコーティングされたチャンバーを残す。
2. タイプで被覆プラスチック培養チャンバーIは、甲状腺組織の単離の前に2時間コラーゲン。
   1. 私は10 mMのHCl中50μg/ mlの最終濃度になるようにコラーゲンの滅菌タイプを希釈します。注：氷の上にコラーゲン原液を保管してください。
   2. Iコラーゲン希釈タイプ200μlでウエルを覆い、室温（RT）で2時間インキュベートする。
   3. 私は解決策を型コラーゲンを吸引、M199で一回井戸を洗浄し、抗生物質、グルタミンおよび10％ウシ胎児血清を添加したM199の200μLの最小ボリュームを追加。
   4. 外植片をめっきする準備ができるまでインキュベーターでコーティングされたチャンバーを残す。

甲状腺原基含有組織（E12.5）または甲状腺ローブの2。解剖（E13.5-E14.5）

注：クリーンな解剖ツールとペトリ/培養プレートを使用してください。以下に示す一般的な手順と切開はE12.5およびE14.5胚でも同じです。

1. 希望の胚（E12.5からE14.5まで）（e）の日に時限妊娠雌マウスを犠牲にし、解剖器具を用いて子宮を取り除く。
2. HBSSを含む10cmプレートで解剖子宮を置きます。
3. 鉗子で子宮の1四肢を保持し、徐々にすべての胚を解放するために小さなハサミで子宮を開きます。
4. はさみで胎盤から胚を分離し、HBSSを含む新しい10cmプレートに自分の胚体外膜で胚を移す。
5. 卵黄嚢と羊膜を削除します。注：この時点から、下から透視して実体顕微鏡下で動作します。解剖の手順で倍率を上げる。ツールを解剖などのガラスキャピラリーにタングステン針を使用してください。
6. のような針を使用ナイフとフォーク、上顎と耳（に沿って切断し、図1（a））を含むヘッドの上部を、削除してください。
7. その背中に胚を保持し、ただ、前四肢の下で、心臓（ 図1B）の上に、胚の下部そして、第神経管（Bに沿って切断し、図1（a））の余分な部分を削除します。
8. HBSSを含む新しい10cmプレート内の舌（組織を配向する）と首領域を含む胚スライスを転送します。
9. 神経管を取り外し、組織は食道/気管（に沿って切断図1C）に後方。
10. 穏やか部の（bおよびb 'に沿って切断した図1C）、舌の両側に沿った組織切片。
11. 舌の延長を、食道と気管を見つけて、（ 図1D、に沿って切断）、およびボット上の組織膨潤披裂を残して、舌を離れて解剖食道/気管の（bおよびb 'に沿って切断した図1D）の時間両側。
12. 食道を削除し、その腹側を上にして気管を配置。
13. このような胸腺（ 図1E）と咽頭弓動脈の側方に配置された全ての組織のような望ましくない組織を離れて解剖。 （ 図1F、赤い点線）E13.5またはE14.5胚では、気管の両側にある甲状腺ローブを視覚化し、さらに気管から葉を解剖。
14. 抗生物質、グルタミンおよび10％ウシ胎児血清を補充した予め温めたM199培地を含有する35mm培養プレートに単離されたE12.5気管領域、又はE13.5-E14.5甲状腺ローブを転送する。 P-200マイクロピペットで予め湿らせフィルターチップを使用して外植片を転送します。 E12.5外植片の場合は、開口部を広げるために、先端の先端をカット。注：日常的に胚が同じ遺伝子型を持っている場合、すべての胚にステップ6と7を実行し、N 9月1​​1日、最終的に12＆13。

甲状腺外植片の3。メッキと文化

1. 予め温めておいた1mlの培地を含む24ウェルプレートの3ウェルに逐次転送することによって外植片を洗浄（= M199抗生物質、グルタミンおよび10％ウシ胎児血清を補充した）。
2. コー​​ティングされた顕微鏡プラスチック培養室に甲状腺ローブのメッキ。
   1. コー​​ティングされたチャンバーから吸引物M199培地。
   2. 慎重に、マイクロピペット、フィルタチップを用いて培養室に甲状腺外植片を移す。各チャンバーの中央に1外植片を置く。
   3. 外植片をマトリックスに付着させるために2時間、過剰の培地を除去し、組織培養インキュベーター中で培養チャンバーを配置する（5％CO _{2、37℃）。}
   4. 静かに各ウェルに予め温め培地の200から300μlを加える。
   5. 組織培養インキュベーター中で長期培養インキュベートする。
3. メッキO半多孔フィルター上のF気管領域または甲状腺ローブ：
   1. 予め温めた培地を330μlのに必要な24ウェルプレートのウェルの数を埋める。
   2. プレースフィルタ（ 例えば 0.4μmのミリポアフィルター）培地上に培養フィルター下の気泡の捕捉を避けるために注意しながら。
   3. 慎重に、フィルタ（最大4/filter）の中心に、媒体の最小容量と甲状腺外植片を転送し、マイクロピペット、フィルターチップを使用して。
   4. タングステン針で外植片からの媒体と空間の過剰を取り除く。
   5. 組織培養インキュベーター中で長期培養インキュベートする。 NOTE：層流フードの下で変更培養培地を一日おき。 7日までの文化の外植片。

甲状腺外植片のため4。ホールマウント免疫染色プロトコール

タングステン針を使用した（下記のステップ2の後に）フィルター上に成長させた外植片を取り除くか、細かい鉗子とプライマリ（ステップ5）、二次（ステップ7）抗体のインキュベーション（96ウェルプレート）を除くすべてのステップのための24ウェルプレートでの転送。顕微鏡プラスチック室で培養された接着性の外植片の場合は、培養チャンバー内のすべてのステップを実行します。

1. 吸引除去M199培地と20分（24ウェルディッシュ中の500μLおよび顕微鏡のスライドで300μL）のための氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）で外植片を固定する。
2. RTで、トリトン有するトリス緩衝生理食塩水（50mMトリス塩酸pH7.5で、150mMのNaCl、0.1％トリトンX-100 TBST）で2×10分間洗浄。
3. -20℃で、すぐに外植片またはストアを処理NOTE：-20℃での長期保存のために、徐々に100％メタノールに到達するためにTBST中のメタノール濃度を増加させることによって、メタノール中に外植片を脱水する。場合には免疫染色（ステップ4）に進むことができ、徐々にメタノールにTBSTを追加することにより、外植片を再水和。
4. ブロッキング溶液（10％TBST中の正常ヤギ血清でTBSTを交換してください）し、室温で30〜60分間、海シーソーロッカーにインキュベートする。
5. （条件ごとに100〜200μl）をブロッキング溶液中で一次抗体を希釈します。 96ウェルプレートに24ウェルプレートから「フィルタ」植片を移す。 4℃で一晩海鋸ロッカー上の一次抗体を用いた外植片をインキュベート
6. 次の日、バック24ウェルプレート内の「フィルタ」植片を転送する、一次抗体溶液を捨て、そして室温で45〜60分間ずつ海鋸ロッカー上TBSTで少なくとも5回洗浄する。
7. 正常ヤギ血清を1％含有TBST中二次抗体（1:2,000希釈で例えばヤギ抗X-アレクサフルーア）を希釈し、4℃で、暗所で海鋸ロッカー上で一晩この希釈した外植片をインキュベートする。核対比のために、一緒に二次抗体溶液とビス - ベンズイミド（ヘキスト）の1μg/ mlのがあります。
8. 次の日、二次抗体溶液を廃棄し、海のこぎりでTBSTで5回を洗う室温で45〜60分ごとに、ロッカー。洗浄の時には、暗闇の中で外植片を保持します。
9. そっと暗闇の中で4℃で一晩渦巻くTBSTで追加の洗浄を行う。
10. Postfixの10分間4℃で4％PFA中で免疫染色した外植片。
11. TBSTで2回、10分間洗浄します。
12. -20℃で長期保存のためのどちらか、徐々にメタノール100％を外植片を転送するか、すぐに分析します。フィルター上で培養した外植片のため、前多光子や共焦点顕微鏡を用いた分析にTBSTまたはより良い蛍光マウンティング培地で24ウェルプレート、顕微鏡室（ 例えば LabTekまたはIbidi）での転送で免疫染色した。

甲状腺からのRNAの5。抽出

RNaseフリーの環境で動作します。したがって、核酸およびヌクレアーゼフリーのピペットチップを使用し、汚染物質とのRNaseのベンチと機器の両方を清掃してください。フェノール/クロロホルムを基準にしているこのプロトコルは、最初のステップを実行化学フードの下の（1〜7）。

1. 1.5mlチューブ用の使い捨て乳棒を用いてRNA抽出液300μlで1甲状腺外植片または2甲状腺ローブを均質化する。サンプル間、エタノール、その後、水、その後、2％SDS中で乳棒を洗う。
2. RNA抽出液の別の100μlの、ボルテックス10秒を追加し、室温で10分間インキュベートする。
3. 30秒間ボルテックスし、各サンプルにtRNAの20 ngのを追加します。
4. 1分間ボルテックスし、クロロホルムの80μlを加える。
5. 30秒間激しくボルテックスし、室温で15分間インキュベートする。
6. 冷蔵（4℃）遠心機で19,000×gで15分間遠心する。
7. 共沈剤としてグリコーゲン20μgのを含む新しいチューブに慎重に無色の上の水相を転送します。
8. ボルテックスし、100％イソプロパノールアルコールを200μlを加える。
9. 15〜30秒激しくボルテックスし、2〜3時間、-20℃で、または1時間-80℃でのRNA沈殿物をしてみましょう。
10. 19000で30分間のスピン4℃でXG、上清を取り除く。
11. ペレットを取り除くために、冷たい75％エタノールと渦の450μlでペレットを洗浄。
12. 4℃、19,000×gで10分間スピンし、上清を除去する。
13. 5分間のフードの下でペレットを乾燥させます。
14. RNaseフリー水10μlでペレットを再懸濁し、室温で10分間インキュベートする。
15. アッセイRNA濃度は、-80°Cで保存または逆遺伝子発現分析のために転記する。

結果

甲状腺anlages（一緒に周囲の組織との正中線とUB）、および甲状腺葉（ 図1）は、それぞれ、E12.5およびe13.5/e14.5でマウス胚から解剖されています。フィルター上の文化の中で1日を過ごした後、正中原基は、気管の上に及ぶ細長い組織として（ 図2A）に表示されます。それは徐々に気管の各側に2つのローブを形成する。単離された甲状腺ローブ（E13.5又はE14.5）が培養される場合、それらは、展開形態形成および上皮細胞が肉眼で見える濾胞構造（ 図2B）内に組織する受ける。

E-カドヘリンで標識された上皮細胞の組織化および分極は、エズリン免疫標識（ 図3A）によって可視化することができる。徐々に、かつ協調的な方法でエズリン陽性細胞内構造、頂端のポールとなり、細胞の一方の極にヒューズ。このプロセスの間、内皮細胞はPOSIPECAMのためTIVEが増殖し、血管、濾胞ユニット（ 図3B）を形成するために開発し卵胞...

ディスカッション

本論文では、解剖や甲状腺形成につながる複雑な事象を研究し、よりよく理解するために、甲状腺の外植片（E12.5）または葉（E14.5）を培養するための方法を説明します。原因甲状腺原基（正中原基および2横鰓後体）の二重の起源、そしてその小さなサイズ、咽頭弓動脈に吻側にローカライズされたE12.5組織の断片、および気管を含む、ではなく食道へ顕微解剖されています。図示のように、四日間の期間内に、この培養系は、忠実のでインビボ甲状腺開発において再現する：（i）の正中原基は左右移行し、UBと、狭い狭部によって接続された2つの甲状腺ローブ（ 図2A）を形成する膨張、（ii）の前駆体は甲状腺濾胞への細胞の塊から再編成し、最終的に（ 図2Bおよび3A）分極、（iii）の中に存在する内皮細胞をマイクロダイセクション組織増殖する甲状腺葉の中に移動し、密接に上皮細胞（ 図3B）と結合し、それらが生体内 ⁷ でするよう（IV）甲状腺細胞...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile	proxylab	80826
Collagen Type I, rat tail	Millipore	08-115
Fibronectin from human plasma	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
タングステンワイヤー	Goodfellow	LS237450
培養プレートインサート(直径12mm)	Millipore	PICM01250
	GlycoBlue Invitrogen	AM9516
E-cadherin	BD Biosciences	610182	1/1,000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
ヘキスト	シグマ	B2261