Tリンパ球におけるインテグリン活性化の研究のための静的な接着アッセイ

Summary

静的接着アッセイは、Tリンパ球および他の細胞型間の相互作用をモデル化するために使用することができる強力なツールである。プレートリーダーは、シリアル回洗浄し、以下の接着細胞の数を定量するために使用される相互作用は、接着分子でコーティングされたウェルに標識されたT細胞を注入することによって生成される。

Abstract

Tリンパ球の接着は、炎症および抗原提示細胞との免疫学的シナプスの形成部位への遊走を含む複数のT細胞機能に必要とされる。 T細胞は、インテグリン、パートナー細胞または細胞外マトリックス上の標的分子と相互作用する膜貫通タンパク質のヘテロ二量体対からなる細胞接着分子のクラスの接着特性を制御することにより調整された接着性を達成する。最も顕著なT細胞は、インテグリンリンパ球機能関連抗原（LFA）-1サブユニットが標的細胞内接着分子（ICAM）-1αLおよびβ2から構成である。接着を制御するためのT細胞の能力は、個々のインテグリンの親和性の状態を調節する能力に由来する。インサイドアウトシグナル伝達は、細胞内のシグナルがインテグリンの外部ドメインが活性化された状態を想定する原因となるプロセスについて説明します。これらの複雑な現象の私たちの知識の多く​​は、機械論に基づいていますin vitroモデル系で単純化された中で行われた研究。ここで説明するTリンパ球接着アッセイは、T細胞は、静的な条件下で、標的分子に付着させることができ、その後、接着性を定量化するために、蛍光プレートリーダーを利用する優れたツールである。このアッセイは、リンパ球に作用する接着刺激または阻害する物質を定義するだけでなく、関係するシグナル伝達事象を特徴づけるに有用であった。 LFA-1のためにここで説明したが - ICAM-1仲介接着;このアッセイは、容易に他の接着相互作用（ -フィブロネクチン例えば、VLA-4）の研究を可能にするように適合させることができる。

Introduction

Tリンパ球の接着は、免疫応答^1と基本的な処理である。これは、標的細胞に²リンパ節内の細胞（APC）に抗原提示を走査するため、および免疫学的シナプスの形成のために、内皮細胞が毛細血管壁を装飾するとT細胞の相互作用のために（IS）が必要である。これらの要件は、機能的にも速度論的に区別される。リンパ球の血管外漏出のプロセスは、化学誘引、ローリング、強固な接着、移住から構成されています。接着を会社にローリングからの移行が急速にGタンパク質共役受容体シグナルに応答するT細胞を必要とします。この応答は、細胞ローリング^3を遅くし、逮捕インテグリンリガンド相互作用が得られます。インテグリン結合活性の即時の変化は、このプロセスを仲介する。移行は「フロントエンド」と「後端」の癒着の破損で癒着の形成と動的な相互作用のbetweenTcellsおよび内皮細胞を必要とする形成し^、4を壊す約分間隔で。 ISはinminutesを形成するが、時間⁶用にそのまま残る必要があります。

興味深いことに、ある接着分子、インテグリンファミリーメンバーリンパ球機能関連抗原（LFA） -図1は、これら全ての方法⁵に必須である。 LFA-1は、免疫グロブリンスーパ​​ーファミリーのいくつかのメンバーとの相互作用を介して接着を媒介する。 LFA-1の最も高い親和性を有する最も広く研究リガンドは、細胞間接着分子（ICAM）-1である。非活性循環リンパ球は、細胞表面上に低親和性LFA-1を発現し、従って、ICAM-1でコーティングされた表面に付着することができない。 LFA-1の親和性は、可変ならびにT細胞受容体（TCR）によって媒介されるGタンパク質共役受容体の活性化、サイトカイン刺激、および信号などのいくつかのシグナル伝達事象によって調節される。LFA-1が得られた高親和性形態は、細胞外空間への細胞内活性化を搬送するTICAM-1との相互作用hrough。この経路は^{、7シグナリング}インサイドアウトと呼ばれている。同様に、細胞外の空間から、LFA-1を介したシグナル伝達は、アウトサイド·インのシグナリングと呼ばれています。

インサイドアウトやアウトサイドインシグナル伝達に関与カスケードの細胞内シグナル伝達は、現在の研究の主要な焦点である。低分子量GTPase Rap1のは、最近、それは、TCRライゲーションおよび⁸サイトカイン^シグナルの両方に共通しているシグナルインサイドアウトの重要な要素として浮上している。インテグリン活性化のRap1の重要な役割は、T細胞の接着が、ドミナントネガティブ型Rap1 ⁹の発現によって遮断される一方のRap1の過剰発現は、T細胞のインテグリン依存性接着を刺激するという発見により強調される。 Rap1のによるインテグリン規制の我々の理解におけるこれらの進歩は、in vitroのツールで使用して達成されてきた。これらの中でも、ここで説明した静的接着アッセイである。

この方法の全体的な目標は、Tを研究することであるICAM-1をコーティングした表面への細胞接着。具体的には、客観的に測定し、異なる条件下で、リアルタイムで生細胞におけるそのカウンターリガンドに向かってLFA-1の親和性を定量するために使用される。この技術は、T細胞と相互作用する細胞の表面を模倣するようにICAM-1でコーティングしたポリスチレンウェルを使用する。多くの前述の静的T細胞接着アッセイは、実験的に複雑であった。これらのアッセイは、しばしば、培養されたウシ角膜細胞は、T細胞の接着のための基質として細胞外マトリックスを作成するために利用される放射性標識するT細胞に必要な、またはT細胞の接着^10を促進するために拡張された期間にわたって非生理学的T細胞刺激を求めた。多くの他のアッセイシステム¹¹で利用されるように、フローサイトメトリーおよび顕微鏡流れと比較して、接着インキュベーション後のT細胞を定量するための蛍光測定の使用は、定量化のより高感度かつ正確な方法である。さらに、単一細胞microscopインテグリン局在のIC分析では、蛍光の測定と同様に広範な、人口ベースの分析のために許可していません。活性化状態特異LFA-1抗体が市販されているが、これらの抗体は、ここで説明する方法に比べて低い感度を提供します。代替技術上の主な利点は、その単純さと、同時に複数の実験条件を確認できることが挙げられます。特定のアプリケーションのためにこの方法を検討する場合、一方はT細胞が負に、選択された新たに単離され、蛍光マーカーで標識されるべきであることを考慮すべきである。

Protocol

1。マイクロプレートのウェルをコーティング

注記：このステップの目標は、T細胞のLFA-1のリガンドとして機能するように、ICAM-1とのコートポリスチレン表面にある。

1. 次の解決策を準備します。
   1. 再懸 ​​濁することによりコーティング溶液を調製した組換えICAM-1カルシウム（1mMの富化リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（137mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa ₂ HPO _4、2mMのKH ₂ PO _4、pH7.4）で_塩化カルシウム）とマグネシウム（2 nMのMgCl _2を ）。 ICAM-1の最終濃度が0.7 mg / mlの原液から作られ、-80℃の冷凍庫に保管10μg/ mlの、であることを確認してください。
   2. 0.5％のヒト（またはウシ）血清アルブミン（HSA / BSA）、2mMのMgCl _2、および1mM CaCl ₂でPBSを濃縮することにより、接着溶液を調製する。
   3. PBSに2 MgCl ₂および1mMのCaCl _2を追加することにより、洗浄溶液を調製する。 37へのすべてのソリューションを温める使用前にCと°。
2. 洗浄溶液50μlで24個のウェルを洗浄します。これは洗っていない井戸、正（PMA処理した細胞）、および負（コーティングされていない井戸）のコントロールが含まれます。各条件は、少なくとも3つのウェル（三重）を設定するため。
3. 各ウェルにコーティング液50μlを追加します。コー​​ティングされていない対照ウェルに追加しないでください。 37℃のインキュベーター内部の1時間インキュベートする。
4. 先端がウェルの底に触れることなく、穏やかに塗布液を吸引する。洗浄溶液50μlで1回洗浄する。
5. 接着溶液50μlを加え、37℃のインキュベーターの内側1時間マイクロプレートをインキュベートする。
6. 吸引除去優しくおよび50μlの洗浄溶液で1回洗浄する。しかし、それは一晩4℃で保管し、そして次の日、それを使用することが可能で、同じ日にプレートを使用する。

血液からの2。のT細胞単離

1. 50μL/ mlのOにおけるヒトT細胞濃縮カクテルを追加F全血（ 例えば抗凝固剤の3ミリリットル（ヘパリン、EDTA、またはクエン酸塩）、全血の場合、カクテル150μlのを追加します）。よく混ぜる。
2. 室温で20分間インキュベートする。
3. 50ミリリットルの遠心管に処理された血液と室温で1％のD-グルコースで強化し（カルシウムとマグネシウムを含まない）等容量のPBSの3ミリリットルを追加。パスツールピペットを用いて穏やかに混合。
4. 遠心チューブに15ミリリットルフィコール·パックPLUSを追加します。
5. 慎重にリンパ球分離培地上で血液サンプルを希釈し、層を6ml。
6. 休憩をオフにして20℃で20分間400×gで遠心します。
7. 界面で乱されていないリンパ球層を残して、きれいなパスツールピペットを用いて上層を取り除く。 血漿の上層は後の使用のために保存することができる。清浄なパスツールピペットを使用して清浄な遠心分離管にリンパ球層を移す。
8. リンパ球にPBSを3容量（9ミリリットル）を追加します。そっとして細胞を一時停止DRAウイングその中およびパスツールピペットから。
9. 20℃で5分間、400×gで遠心分離する
10. 上清を取り除きます。リンパ球はこれで、アプリケーションに適した媒体に懸濁されるべきである。 20ml中のT-75培養フラスコに細胞を移し、10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地。

細胞の3。準備

注意：細胞を蛍光試薬で標識するための前提条件である。このプロトコルでは発現細胞が許容される代替物であるカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）であるが、緑色蛍光タンパク質（GFP）を使用する。

1. 血球計数器を用いて2.4×10 ⁶ T細胞（各ウェルのための1×10 ^5）を数える。
2. （血清飢餓）は、血清を欠く培地中で細胞を再懸濁。 37℃のインキュベーター内で2時間細胞をインキュベートします。
3. 5分（400×g）で細胞を遠心分離する。培地を吸引除去し、1ミリリットルのPBSに懸濁します。
4. 1:1000希釈（5 mMまで行わストック）でCFSEを追加します。光からカバーし、室温で8分間インキュベートする。
5. 37°CのPBS 10mlに添加することにより反応を停止し、5分間400×gでスピン。
6. 再懸 ​​濁予め温めた接着溶液（501μl当たり1×10 ⁵細胞）を1.2 mlの細胞ペレットを再。

4。細胞の刺激を

注：接着を開始するために、細胞が刺激されなければならない。以下の実験では、細胞を抗CD3抗体を用いて架橋するTCRを介して刺激されるが、可溶性SDF-1は、代替として役立ち得る。実験の目的に応じて、様々な薬理学的試薬は、細胞接着への影響を研究するために、刺激の前又は間に添加することができる。ホルボールミリステートアセテート（PMA）は、二次メッセンジャーのジアシルグリセロール（DAG）と構造的に類似であり、したがって、複数のキナーゼを活性化ホルボールエステルであるTCRの下流側（主にプロテインキナーゼC）だ;ここでは陽性対照として使用する。

1. 37℃にマイクロプレートを温める
2. 8空の1.5mlチューブ（各チューブに150μl）、各条件1のチューブに細胞を分割します。
3. それに応じて細胞を処理：
   1. ポジティブコントロールとして、10 ng / mlのでPMAで1チューブを刺激する。刺激のためのコントロール（「刺激なし」）、未洗浄ローディングコントロール（「NOウォッシュ」）、およびICAM-1コーティングのための制御（「コーティングされていない」）として機能するように、未処理の3つの管を保管してください。
   2. 抗CD3抗体の異なる濃度（0.1、1、5、および10μg/ ml）を用いて4つのチューブを刺激する。遅延することなく、次のステップに進みます。
4. 各ウェルの空に刺激された細胞の混合物のアリコート50μlを。ウェルあたりの細胞の最終的な数は、1×10 ⁵である。
5. 15分間37℃のインキュベーター内でマイクロプレートを置きます。
   注：一部のT細胞株は、短い刺激に対するが必要ですのTiON時間。この時間の間に、細胞がウェルの底に落ち着くし、標的リガンドに準拠しています。

5。洗い流す非接着細胞

注記：このステップの目標は、リガンドでコーティングされた表面との緊密な接触を形成することができませんでした細胞を除去することです。同一の物理的な力を全てのウェルに適用されることを確実にするために、このステップのマルチチャンネルピペットを使用する。これは、接着細胞のパーセンテージの計算を補助するために示された未洗浄の対照ウェルに保つことが重要である。

1. 各ウェルに温かい接着溶液150μlを加える。ウエルから培地を除去する前に数秒間静かにプレートを振る。ヒントウェルの底に触れないでください。
2. この手順を3回繰り返します。内と外のバッファをピペットときピペットの方向を変える。

6。接着細胞の割合の判定

_content ">注意：このステップでは、蛍光プレートリーダーは、各ウェル内の蛍光強度を測定するために使用される強度は接着細胞の数と直接相関する。

1. プレートリーダーをオンにします。デスクトップ上のショートカットアイコンをクリックして、プレートリーダー·ソフトウェアを開きます。
   1. 「タスク」メニューの新しいプロトコルを設定するには「新規」をクリックします。
   2. 「アクション」メニューから「読み込み」オプションを選択します。 「蛍光強度」をクリックして、「OK」のタブを押してください。
   3. ドロップダウンメニューから「励起波長485」と「発光波長528」を選択します。 「OK」のタブを押してください。
   4. 「光」オプションメニューで「ボトム」を選択し、「OK」のタブを押してください。バック「アクション」メニューに移動し、37℃に温度を設定し、「OK」をクリックしてください。
   5. プレートリーダーにマイクロプレートを挿入し、「ファイル名を指定して実行」をクリックしてください。結果はExcelスプレッドシートにエクスポートされます。
2. 以下の式を用いて接着細胞のパーセンテージを計算する： 接着細胞のパーセンテージ=（洗浄後のウェルで読み取る平均蛍光強度）/（未洗浄細胞において読み出さ平均蛍光強度）×100％。

Results

以下の抗CD3抗体の種々の濃度で刺激した一次T細胞を用いて接着アッセイの一例である。これは、未洗浄細胞（ すなわち合計ローディング）の蛍光を知っておくと便利です。非刺激細胞は、陰性対照としての役割を果たし、PMA処理細胞は、抗CD3抗体の陽性対照である。コー​​ティングされていないウェルで播種した細胞は、ICAM-1のコントロールとして機能します。非刺激細胞の割合が5％〜10％の間であり、一方典型的な実験では、付着PMA処理細胞のパーセンテージは40％〜50％の間である。細胞接着性を定量化する別の方法は、非刺激細胞のそれ以上の各条件での蛍光強度の計算倍増加することによるものである。

表1は、CFSEの蛍光強度は、可溶性抗CD3抗体の異なる用量で刺激し、ICAM-1被覆ウェル上にプレーティングし、一次T細胞を標識示す。 図1は、代表的なイムを示す同様の実験歳。細胞は負に末梢血から選択した。 2時間の血清飢餓の後、2.4×10 ⁶細胞を、種々の濃度の可溶性抗CD3抗体による刺激...

Discussion

LFA-1活性化およびT細胞の接着¹²に信号を研究するためのいくつかのアッセイがある。フローサイトメトリーは、屈曲またはLFA-1の拡張のいずれかに選択的に結合するモノクローナル抗体を用いて生細胞におけるLFA-1の親和性の状態を測定するために使用される。この方法の制限の1つは、それが考慮インテグリン '結合活性をとらないことである。遊走アッセイは、便利なツールですが、彼らは、特定の時点でちっぽけな接着をしない移行を測定し、。 Tリンパ球の遊走（ 例えば皮膚過敏症モデル）を研究するマウスモデルは、生理学的に関連するものですが、これらのモデルを利用することは、実行する多因子性と複雑です。ここで説明する静的接着アッセイの主な強みは、簡単な方法で結合活性および親和性の両方を測定する能力である。この方法の別の利点は、迅速かつ正確に少数の細胞を検出する能力である。他の方法と比較した場合には、マニピュレータにはるかに容易であるキュレート細胞と我々が説明するものとして機能アッセイにおいて異なる試薬とそれらを扱う。また、接着細胞をプレートリーダー、手動カウントに関連付けられている除去バイアスが客観的にカ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
プレートリーダー	BioTek	Synergy H1 ハイブリッド
マルチチャンネル ピペット	フィッシャー	21-377-829
光学底部付き 96 ウェル マイクロプレート	Corning Costar	3603
組換え ICAM-1	R&D Systems	ADP4-050
抗CD3抗体	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
CFSE	Molecular Probes	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
DPBS containing Calcium and Magnesium	Gibco
末梢リンパ球	例: マウスまたはヒト
塩化マグネシウム	Sigma-Aldrich	M8266
塩化カルシウム	Sigma-Aldrich	499609
Open Gen 5 ソフトウェア	BioTek	Version 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00
15および50 mlの遠心分離管	Fisher	352099, 352070
使い捨てプラスチックパスツールピペット	Fisher	13-711-7M
T-75 培養フラスコ	Fisher	50-754-1366
RosetteSep T cell enricment kit	StemCell Technologies	15061