方法論記事

遺伝的にコードされたセンサを用いたグルタミンフラックスイメージング

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DOI：

10.3791/51657

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2014年7月31日

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1Virginia Tech

この記事について

サマリー

この記事では、FRETを使用して、生細胞内のグルタミンダイナミクスを監視する方法を紹介します。遺伝的にコードされたセンサーは、細胞下解像度での生体分子のリアルタイムモニタリングを可能にする。実験後の分析のための実験計画、実験的な設定の技術的な詳細、および考慮事項が遺伝的にコードされたグルタミンセンサに議論される。

要約

遺伝的にコードされたセンサーは、細胞下解像度での生体分子のリアルタイムモニタリングを可能にする。生物学的分子のためのようなセンサの驚異的な様々な多くの研究室で日常的に使用される不可欠なツールとなったそのうちのいくつかは、過去15年で利用可能となりました。

遺伝的にコードされたセンサの刺激的な用途の一つは、細胞輸送プロセスを調査において、これらのセンサの使用である。そのような動態および基質特異性などの輸送体の特性は、輸送活性の細胞型特異的な分析の可能性を提供し、細胞レベルで調べることができる。この記事では、トランスポーターのダイナミクスは、一例として、遺伝的にコードされグルタミンセンサーを使用して観察することができる方法を紹介します。実験後の分析のための実験計画、実験的な設定の技術的な詳細、および考慮事項が議論される。

概要

により細胞レベルでのトランスクリプトームやプロテオームの検査を可能にする技術の目覚しい進歩により、現在では、生化学および代謝物とイオンの結果としてフラックスは非常に細胞型特異的であることが明らかになってきた。例えば、哺乳動物の肝臓において、シーケンシャルグルタミン分解及び合成は、後者1-3で過剰のアンモニアを消費しながら、前者の細胞型において尿素サイクルにアンモニアを供給し、それぞれ門脈周囲細胞および静脈周囲の細胞によって同時に行われる。いくつかの場合において、重要な生化学的異質性は、単一の「細胞型」4,5で検出される。このような空間的な特異性に加えて、代謝産物およびイオンの細胞レベル（ 例えば、例えばCa 2 +および環状ヌクレオチドなどのシグナル伝達分子）は非常に動的である。代謝産物およびイオンの時空間パターンは、多くの場合、シグナル伝達に重要な役割を果たす。 M代謝物やイオンの細胞動態をonitoringしかし、ユニークな課題をもたらす。多くの場合、濃度の変化は、迅速かつ一過性の、例えば、樹状突起棘6〜20ミリ秒以内に減衰のCa 2 +のようなシグナル伝達分子の場合が例示される。さらに、細胞内および間の生化学的経路の区画化が困難抽出およびカラムクロマトグラフィー/質量分析技術を用いて代謝産物およびイオンのダイナミクスを定量化することができる。

生物学的分子のための遺伝的にコードされたセンサーは、現在広くにより実験者が（7、8に概説されている）短命および/ ​​または区画化された分子動力学を研究することを可能にする、高時空間解像度に使用されている。これらの遺伝的にコードされたセンサーは、大きく2つのカテゴリに分けることができ;強度ベースのセンサとratiometicセンサー。強度ベースのセンサは、通常、結合ドメインやインフルエンザで構成されてorescentタンパク質（FPS）、および結合ドメインに結合する溶質は、蛍光強度が変化します。 Ratiometicセンサは、一方で、多くの場合、FRETペアとして機能する2つのFPとの間のフォスター共鳴エネルギー移動（FRET）を利用する。これらのセンサは、結合ドメイン二つのFPからなり、溶質の結合は、2つのFPとの間のFRET効率の変化を誘導する。生物学的に重要な代謝産物およびイオンのための多数のセンサは、過去10年間8,9開発されている。

そのような遺伝的にコードされたセンサによって提供される刺激的な可能性の一つは、以前に、細胞レベルで検出することは容易ではなかった膜輸送プロセスの高分解能分析におけるそれらの使用である。遺伝的にコードされたセンサは、基質特異性およびpH依存10,11等の搬送機構の分析を容易にする。また、遺伝的RESとの組み合わせでRNAiのライブラリがモデル生物のために構築ourcesこのように、それは遺伝的にコードされたセンサーを用いた新規輸送プロセスのためのゲノムワイドな検索を行うことができるようになりました。実際、複数のケースで以前に特徴づけられていない輸送体の発見に遺伝的にコード化されたセンサリードの使用12、13。

最近、私たちの研究室では、グルタミンのためのFRETに基づくセンサーのシリーズを開発しました。我々は、細胞のグルタミンレベルが例えばFRETグルタミンセンサ10を用いて可視化することができることを実証した。これらのセンサは、glnHのC末端（ 図1）での細菌グルタミン結合タンパク質glnHに挿入されたFRETドナー（mTFP1）、およびFRETアクセプター（ヴィーナス）から構成されています。これらのセンサのFRET効率は、アクセプター/ドナー強度比の減少をもたらす、グルタミンの結合時に減少する。グルタミン輸送プロセスの微調整は、例えばneurotransmなどの生物学的プロセスにおいて重要であるission 14,15および肝臓1、16、17における尿素サイクルの維持。

ここでは、広視野蛍光顕微鏡セットアップを使用して、グルタミンFRETセンサーを輸送活性を分析する方法論を示す。ここに示された実験の目的は、単一の細胞においてトランスポーター活性を検出し、一過性に発現トランスポーターの基質特異性を検討することである。

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プロトコル

1。サンプルの調製

注：多くの場合、灌流実験はイライラ問題になることができ、細胞の大部分を、洗い流す。ポリ-L-リジンを有する全ての細胞株、被覆カバーガラス表面のために（表面への0.01％溶液の1.0 ml/25 cm 2の投稿必要はないが、細胞培養グレードの水で2回洗浄し、> 5分間インキュベートし、乾燥生物学的安全キャビネット）は、細胞接着を増強する。また、使用される細胞株のバイオセーフティレベル（BSL）を認識して、地域の環境、安全衛生事務所によって承認標準作業手順に従ってください。この実験では、COS7細胞（ 図4参照）が低いため、内因性グルタミン輸送活性を用いた。

  1. ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中で70〜80％コンフルエント+ 10％宇宙胎児血清および100 U / mlペニシリン/ストレプトマイシン、いずれか6ウェル培養中に入れ、無菌25mmのガラスカバースリップ上に〜をシードCOS7細胞皿または8ウェルガラス底スライドする。 37°C、5％CO 2、24時間、100％湿度でインキュベートする。
  2. 製造業者のプロトコルに従って、DMEM +10％宇宙胎児血清（抗生物質なし）に成長培地を交換する。湿度100％で37℃、5％CO 2でO / Nを成長させる。
  3. （CMVプロモーター10の下FLIPQTV3.0センサーを運ぶのpcDNA3.1）グルタミンセンサーと10〜50ミリリットルの無血清培地（OPTI-MEM）mCherryタグ付きASCT2をコードする0.4 mgのプラスミドDNAのそれぞれを追加し、穏やかに混合する。
  4. 50ミリリットルの無血清培地へのトランスフェクション試薬の1ミリリットルを追加します。室温で5分間インキュベートする。
  5. DNA（ステップ1.3）およびトランスフェクション試薬（工程1.4）を含む二つの溶液を混合し、20分間インキュベートする。
  6. 静かに、細胞の上にトランスフェクション試薬を追加し、チャンバーロッキングにより穏やかに混合します。 37°C、5％CO 2、湿度100％で24時間インキュベートする。
  7. 24時間後、DMEM +10 10パーセントコズミック胎児血清にメディアを交換する（CCS）ペニシリン/ストレプトマイシン+ 100単位。
  8. 細胞は、48〜72時間後にトランスフェクションをイメージしている。

2。灌流実験

注：この実験で使用したCOS7細胞は、灌流媒体およびRTチャンバは、周囲CO 2濃度に維持した。使用される細胞は生存のために、より高い温度およびCO 2濃度の制御を必要とする場合は、加熱した顕微鏡ステージおよび/ ​​または環境チャンバを使用すべきである。

  1. 灌流液のAF（材料のリストを参照してください）​​を準備します。灌流液でそれらを埋めるし、ストップコックを閉じ、50ミリリットルの注射器にコックを取り付けます。バッファーでストップコック内のヘッドスペースを埋めるために短時間のストップコックを開きます。
  2. 灌流鉛筆で8チャンネル、重力送り灌流システムの電源を入れ、[選択]機能オプションの下に「マニュアルモード」を選択します。灌流鉛筆の下に廃棄用容器を置きます。
  3. 手動で対応する番号を押して、ポートをアクティブにして、水を入れた10ミリリットルの注射器を使用してチューブを埋め、その後、ポートを閉じる。ポートが水で満たされると、灌流システムのポート1-6にバッファAFを含有する注射器を設定し、コックを開きます。バッファを備えたチューブ内の水を交換し、再びポートを開く。流量は約0.8ミリリットル/分である必要があります。
  4. を押して戻って「選択機能」メニューに移動し、灌流コントローラを一度解除してください。 表1に示した灌流プロトコルで入力し、 "編集プログラム」のオプションに切り替えます。灌流プログラムを保存します。
  5. インキュベーターから細胞を取る。灌流緩衝液で2回洗い、その後、ステージ上のセルを設定します。チャンバーに灌​​流システムを接続します。開放室を使用する場合は、チャンバーからの灌流液を除去し、別のポンプを設置した。
  6. Slidebookソフトウェアを起動します。新しいスライドを開始します。
    注意：次の手順は、Slidebookソフトウェアに固有であるが、MetaFluor及びニシュ-要素のような他のソフトウェアはまた、ここに記載の撮像のタイプのために使用することができる。理論的実験は、時間経過イメージングを可能にする任意のソフトウェアを用いて行うことができ、画像シーケンスは、ImageJの（http://rsbweb.nih.gov/ij/）又はフィジーなどのソフトウェアを使用してポスト実験的に分析することができる（http:/ / fiji.sc /フィジー）。しかしながら、アクセプター/ドナー比率のリアルタイムモニタリングを可能にするソフトウェアは非常に有用である。
  7. 蛍光顕微鏡のステージ上にスライドをマウントします。適切なフィルターセットを用いたセンサとASCT-mCherryを共発現する細胞を見つける「フォーカス」機能の下で（材料のリストを参照してください）​​。 「カメラ」タブをクリックし、「利得」の下のスライドバーをスライドさせてゲインを調整します。また、減光フィルタのドロップダウンメニューから減光フィルタの設定を調整します。注：フィルターキューブが目のフィルタが含まれていない場合は、ショアから接眼レンズを使用しないでくださいT-波長の励起光は、目に有害である。代わりに、細胞を見つけるために、コンピュータの画面を使用します。
  8. 細胞の画像を取得with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels （フィルタは材料のリストで指定されています）。 「イメージキャプチャ」をクリックし、[取得]ウィンドウで、使用する予定のフィルタを指定。次のフィルタ設定にあるボックスに所望の露光時間を入力することで、露光時間を調整するために「TEST」ボタンをクリックしてください。注：すべての3つのチャネルが同じ長さのために露出される必要がある。撮像パラメータを調整するとき、予想されるFRET効率の変化を取ると考慮倍増加：FRET効率は、実験中に2倍に上がることが予想される場合など、撮影パラメータを調整すべきであるように、休止状態でのドナー· アクセプターエクスビボ実施の強度は、<チャネルが実験中に飽和しないように、機器によって記録することができる最大値の50％であるべきである。標識された細胞からのシグナルは、バックグラウンド領域におけるよりも少なくとも3倍高くなければならない。
  9. ソフトウェアにおける領域ツールを使用して関心領域を描画します。あるいは、特定の強度の上方に画素を選択するためのソフトウェア機能を使用して、[領域に変換することができる。これを行うには、マスクをクリックします - セグメントは、所望の領域を強調表示するスライドバーを移動します。
  10. キャプチャの種類]ボックスで「時間の経過」を選択して、実験のための間隔（本実験では10秒）の時点を指定します。
  11. 任意の蛍光細胞なしエリア内の領域を描画します。この領域は、バックグラウンド減算のために使用される。右描かれた領域をクリックして、背景として設定します。注：ある理想的には、細胞をセンサーを発現tは自家蛍光かつカメラによって検出された背景蛍光の両方を考慮して、背景領域として使用されるべきである。そのような細胞は、視野内に使用できない場合、細胞を含まない領域は、少なくともバックグラウンド蛍光を説明するために使用されるべきである。
  12. オプション - "を実行したプログラム機能を選択」の下で目的のプログラムを選択します。保存されたプログラム（ステップ2.3を参照）に切り替え、その後、灌流コントローラ上でエンターキーを押します。今すぐプログラムがロードされ、いずれかのキーを打つと、灌流を開始します。
  13. 灌流コントローラのキーを押すと同時にキャプチャウィンドウで「スタート」ボタンをクリックすることで、同時に灌流およびイメージング実験開始を確認してください。
    注意：これは、溶液が（これは買収タブ内にある「注意」機能を使用して行うことができます）交換された時点を記録することをお勧めします。
  14. 同じ灌流プロトコルUSIを行う実験条件の下で、飽和または非連結のどちらかであることが期待されているセンサーを発現する細胞をngの。
    注：ここでは、実験条件の下で飽和するFLIPQTV3.0_1.5μは、制御は図6のように使用されるような制御実験は、FRET効率の変化ではなく、基板の実際の変化によるものであるとことを確認する必要がある。セルラpHなどの他のパラメータの変化による。

3。ポスト実験解析

  1. サンプルドリフトが実験中に発生したかどうか調べます。画像ウィンドウの上部にあるスライドバーを移動し、細胞は、実験の後半で撮影した画像にROIの外に落ちるかどうかを確認して、関心領域（ROI）は時点0で撮影された画像のS描画します。
  2. はい、マスクを選択することで、セルの周囲にマスクを作成、最初でドリフトを補正するためにトラッキング機能を使用する場合 - セグメントを、その後HIGにカットオフを指定する行をスライド細胞を含有する領域をhlight。粒子追跡 - - 基本粒子追跡マスクをクリックして領域を追跡します。
  3. 必要なときにROIを再描画し、背景領域。
  4. 実験の過程でのROIの平均強度をエクスポートします。エクスポート - - レシオ/タイムラプスデータ統計をクリックします。
  5. 基質濃度のFRET効率および定量化を必要としない場合は、基板のダイナミクスのプロキシとして強度比（ ドナー· アクセプター元全角 /ドナー生体ドナー全角 ）の経時変化をプロットする。 、細胞質ゾル濃度を測定最大（それぞれの基板の飽和および不存在下で、すなわち 、）最小比率変更、Δrの最大を計算するには-をΔr 分 、次式Δratio（ΔR）の非線形回帰によって：
    ΔR= [S] /（ のK D + [S]）×（ΔR マックス- Δrの分 ）+ΔR 分
    ここで、[S]細胞質ゾル中の基質濃度である。 Δrはマックスを使用した-得Δrの最小値が、与えられた量Δrにおけるセンサの彩度（S）は次のように計算されます
    S =（ΔR - Δrの分 ）/（ΔR マックス - Δrの分 ）
    Sは、さらに、以下の式を用いて基質濃度[S]に変換することができる。
    S = [S] /（ のK D + [S]）
    注意： アクセプタEXアクセプターEMチャネルの強度も、実験条件は、直接アクセプターの蛍光に影響を与えたかどうかを調べるためにプロットされるべきである。
  6. 時による光退色ベースラインドリフトは、ベースライン補正を行い、観察される。これを行うには、時間をかけて（ 図5A）をドナーとアクセプターの強度をプロットします。そして、目に使用する時点を特定するEベースライン、灌流システムでの遅延と、特定のセル（ 図5B）の輸送活性に応じた。
  7. 最高のベースラインを記述する多項式フィッティングを計算します。その後、ベースライン（ 図5C）に各時点からの生強度を正規化する。正規化されたドナーとアクセプターの強度から強度比（ ドナーEX·アクセプター·EM、/ドナーEXドナーEM）を計算します。

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結果

典型的な時間経過実験を、図2に示されている。これらの実験では、8 mMの（FLIPQTV3.0_8m、 図2Aおよび2B）および100μM（FlipQTV3.0_100μC及びD）の親和性グルタミンセンサーFRETと共発現させたCOS7細胞10における必須のアミノ酸交換ASCT2 18。グルタミンの流入は、ドナー（mTFP1）およびアクセプター（金星）（ 図2Aおよび2C）との間の蛍光強度比の変化として検出される。別の基板（ALA）の存在下でのグルタミンの流出も明らかに、これらの実験で実証されている。両方のセンサが、正規化された蛍光強度を観察比の変化は確かに起因トンであることを示唆している基質の存在下で（アクセプター強度は、ダウン図2B及び2Dに行くほど、すなわち、ドナー強度が上がる）往復変更FRET効率の変化O。これらの実験は、これらの細胞...

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ディスカッション

イメージング実験の成功は、いくつかの重要な要因に依存します。これらの要因の一つは、上述したように、使用されるセンサの親和性である。関心対象の細胞内区画中の基質の絶対濃度は、しかしながら、多くの場合不明である。そこで我々は、目的の実験条件の下で最適なものを見つけるために千鳥親和性を有する複数のセンサを試してみることをお勧め。例えば、我々の場合、我々は1.5μとグルタミンセンサーをCOS7細胞をトランスフェクションし、100μ、2メートル、8メートルとします（ 図3、データは示していない）。

別の重要な要因は、センサータンパク質の発現レベルである。短命のイベント（ 例えば、単一活動電位）より高い発現レベルが必要になる可能性が19観察する必要がある場合、検出に必要な発現レベルは、例えば、実験の間で変化する。したがって、ほとんどの場合、必要​​とされるレベルはempiricallする必要があるYが決定。標的が細胞内で非常に低濃度で存在する場合は、空乏を標的とする内因性のプロセスの摂動が問題になることができる...

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開示事項

開示することは何もありません。

謝辞

この作品は、NIHの助成金1R21NS064412、NSFの助成金1052048とJeffressメモリアル·トラスト助成金、J-908でサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
倒立型蛍光顕微鏡オリンパスIX81F-3-5他のサプライヤーの同等の倒立型蛍光顕微鏡も適切でしょう。
励起フィルター (mTFP1)オメガオプティカル3RD450-460バンド幅 450-460 nm
励起フィルター (金星)ChromaET500/20バンド幅 490-510 nm
蛍光フィルター (mTFP1)ChromaHQ495/30mバンド幅 475-505 nm
蛍光フィルター (金星)ChromaET535/30mバンド幅 520-550 nm
ダイクロイックミラー (FRETチャンネル)Chroma470dcxrロングパス、470 nm カットオフ
ダイクロイック ミラー (YFP チャネル)Chroma89002bsパス 445-490 nm、510-560 nm、590-680 nm
mCherryフィルターセットChroma49008励起 540-580 nm、ロングパス ダイクロイック、カットオフ 585 nm、蛍光フィルター 595-695 nm
光源オリンパスU-LH100L-3-5安定した光強度を生成するLEDまたはハロゲン光源、水銀ランプはお勧めしません
CCDカメラQimagingRolera-MGi EMCCD
アポクロマート蛍光対物レンズオリンパス
灌流システム、ValveBank IIAutoMate Scientific[01-08]高速溶液交換を可能にする他の灌流システムも層
流チャンバーとして機能しますC&L InstrumentsVC-MPC-TW他のラーミナフローチャンバーも機能します。
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Isotemp CO2インキュベータThermo Scientific13-255-25
ダルベッコのMEM (DMEM)HycloneSH30243.01
宇宙の子牛血清HycloneSH3008703
ペニシリン/ストレプトマイシンHycloneSV30010
トランスフェクション用無血清培地 (OPTI-MEM I)Invitrogen31985Lipofectamine 2000 と併用
ポリ-L-リジン溶液SigmaP4707
25 mm 円形ガラスカバースリップThermo Scientific12-545-102VC-MPC-TWを使用する場合は
リポフェクタミン 2000Invitrogen11668027他のトランスフェクション試薬も使用できます。
溶液A(ハンク緩衝液)9.7 g HANK塩(Sigma H1387)、0.35 g NaHCO3、5.96 g HEPESを1 Lに調整、pHを7.35に調整、NaOH
溶液B溶液A + 0.04 mM Gln
溶液C溶液A + 0.2 mM Gln
溶液D溶液A + 1 mM Gln
溶液E溶液A + 5 mM Gln
ソリューションFソリューションA + 5 mM Ala
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参考文献

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