ArcturusXT楽器のSIVQ-LCMプロトコル

もともと、1990年代半ばに開発されたレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、正確に微小な可視化^1、2を介して組織学的組織切片から特定 ​​の細胞または細胞領域をキャプチャすることを可能にする。組織の擦り傷に対してLCMの分子分析を比較する多くの研究は、方法^3-12の値を示している。また^{、13、14を}表示するために利用可能な技術の3つのビデオプロトコルの出版物があります。関心対象の標的が不均一組織切片中の分散細胞集団である場合、又は多数の細胞は、例えばプロテオミクスのような特定のダウンストリームアプリケーションに必要とされるときが、その実証された値にもかかわらず、LCMは、退屈で面倒であることができる。人間のオペレータの負担は、LCMプロセス^15をガイドするために強力な画像解析アルゴリズムを組み合わせることで、LCMのための半自動化された解剖的なアプローチを開発するために私たちを導いた。

記載されたプロトコルは、ヒト組織試料の使用に関するNI​​Hルールに従って使用した。

1。組織標本

1. 開始する前に、治験審査委員会（IRB）のプロトコルに従って、ヒト組織標本を得る。
2. 組織/セルブロックとそれに対応する処理方法[ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）、冷凍、またはエタノール固定パラフィン包埋（EFPE）]の種類を選択します。ホルマリン固定はエタノール固定および急速冷凍した後、最適な組織像を提供しています。しかしながら、固定および組織処理方法は、下流の分子分析のためにDNA、RNA、およびタンパク質の量と質に影響を与えることができると考えるべきである。
3. 選択したスライド型（ガラス、膜、ガラス、または金属フレーム膜）上に組織/細胞ブロック切片を切った。 SIVQ分析は、すべての3のスライド型に対しても同様に動作します。ご注意ください擬似カバースリップ法キシレンとイーサンに（後述）スライドステージ上で反転されなければならないのでオールメタルフレームメンブレンスライド上で行うことができない。
4. 背景から目的の細胞を識別するために、化学またはIHCベースの組織染色を選択します。その染色方法はまた、DNA、RNA、および蛋白質および組織の量に影響を与えることができます。プロトコルを実行する前に、生体分子のベースラインの質を評価するために染色した後、組織をテストします。 DAB ^15、免疫蛍光で免疫組織化学（IHC）、ファストレッド、 デノボレッド、トルイジンブルー、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）（未発表データ）：SIVQ-LCMを用いて染色した組織/細胞診スライド上で行われた。

2。試料イメージング

1. 負荷は顕微解剖機器の電動ステージ上にスライドさせると関連するソフトウェアを起動します。ロードされたスライドの位置を指定し、撮影された画像ファイルはJPEG形式で保存されるべきであることを確認するためのチェックボックスをオンにします。
2. IMを最適化年齢マニュアルフォーカスホイールまたは切開具のソフトウェアを介してのいずれかを用いて、画面上の画像の明るさ、焦点を調整することにより品質。
   1. 解剖器のソフトウェア内の画像のツールボックスを使用して、適切にランプの明るさやカメラのゲインを設定します。値の例は、ディフューザと、明るさ= 60とゲイン= 220である。
   2. 手動で、またはソフトウェアでのオートフォーカス機能でピント合わせ。
3. 解剖プロセスのためのロードマップを提供するために、スライドのサムネイルの概要イメージをキャプチャします。
   1. uncoverslippedスライドの最適な画像品質を得るには、測定器、凝縮器下のディフューザーを使用する、または、耐火インデックス（擬似カバースリップ）を向上させるために、エタノールまたはキシレンのどちらかを少量（〜30μl）を加える。キシレンを使用する場合は、換気フード、保護白衣、アイゴーグル、手袋の使用を含め、これらは有毒で、適切な安全対策を使用しなければならないしていることに注意してください。
   2. エタノールまたはキシレン溶液が完全にクリアされたか、キャップ上のポリマーが歪みますまで、スライド上のLCMキャップを置かないでください。
4. スライドを移動して、10X、20X、40Xまたは倍率で解剖されるべき領域の画像をキャプチャします。必要に応じて、以前に^22を説明したように（マイクロソフトオフィスピクチャーマネージャーで）などの自動修正などのソフトウェアを使用してイメージを高める。画像は、彼らが自動化された選定ソフトに再インポートできるようにJPEG形式でキャプチャする必要があります。

画像の3。アルゴリズムの解析

1. 転送はSIVQフォルダに顕微解剖機器からの映像を捕獲した。解剖器に接続されたコンピュータ上でArcturusXT、オートスキャンとSIVQソフトウェアパッケージをインストールして開きます。 SIVQソフトウェアへのアクセスのために、博士はユリシーズバリス（ulysses@med.umich.edu）までお問い合わせください。
2. オープンSIVQ、目的の撮影した画像（JPEG）をロードします。</李>
3. 関心のある領域に移動し、/または表示窓（ビューポート5および6）のサイズを調整します。 SIVQソフトウェアでは、ビューポート5は、前処理画像を示すとビューポート6は、後処理画像^16を示している。
4. リングベクトルと、使用するリングの数のサイズを選択します。
5. ビューポート6でそれを右クリックしてキャプチャされる述語画像特徴を選択します。
6. 画像を分析する「スキャン」をクリックしてください。
7. 2つのスライドバーを利用した画像マッチングの統計的確率を調整します。上部のバーには、全体のベクトル特異性を調整し、（選択された「統計」変数で定義されている感度の）過度含ま面積を表すことができ、初期スキャンから地域を除外するために使用されている。逆に、下側スライダーは、スキャンが実行された後に試合であると分類された領域の増大を意図して、感度を高めるために利用される。これらのスライダコントロールの両方がUTI初期ベースライン感度閾値としてリゼ "統計"変数。
8. 画像を保存するには、（画像は現在C :/ vq_testフォルダ/写真に保存されている）「JPEGとして保存」をクリックしてください。
9. アルゴリズムを用いて画像を分析します。アルゴリズム解析の出力はSIVQ-LCMに使用されるための注釈画像をもたらす必要がある。現在、SIVQコアエンジンの現在のバージョンは、フル生産バージョン（利用可能Q1 2014）の単純化された統合のための完全なソフトウェア開発キット（SDK）、アプリケーション·プログラミング·インターフェース（API）を組み込むことを見込んでベータ版テスト中ユーザが生成した空間フィルタと、コアリングマッチングエンジン下流ワークフローデータ処理ステップ。このSDKには、ドキュメントの完全なセットと一緒に配布されます。
   1. SIVQヒートマップを均一赤色に変化していることを確認します。
10. 画像をエクスポートします。これは、Pに位置座標を再埋め込むことが不可欠であるオリジナルの解剖計器イメージからファイルヘッダに貼り付けることが進エディタを使用して、OST分析JPEG画像。適切なデータ」は、画像の開始」マーカー（0xFFの、0xD8）と第「量子化テーブルを定義する「マーカー（0xFFの、0xDB）との間で見つけることができる。

4。マイクロダイセクション

1. 画像はSIVQ解析のために捕獲された関心領域の中心にLCMキャップを置きます。
2. キャリブレーションと品質管理（QC）、UV / IRレーザーとパワー、継続時間、レーザーの位置、および（メーカーが推奨するように）、UVカット速度を含むパラメータを最適化します。解析された画像を再インポートする前に、これらのキャリブレーションを実行します。
3. オープンAutoScanXT（自動化された選択ソフトウェア）およびc :/ vq_testフォルダ/写真から解析された画像をインポートします。
4. SIVQ注釈を認識し、解剖マップを作成するための自​​動化された選択ソフトウェアを訓練。
   1. TRAIを作成するには寧ファイル、SIVQ解析された画像の「赤ペンキ」に（「青い円」でマーク）は、対象の4領域を選択する。
   2. 解剖されるべきではなく、（「赤い四角」でマーク）背景領域を選択します。
   3. その後の使用のために保存することができ、トレーニングファイルを生成するために、「分析」ボタンをクリックしてください。
5. 適切な赤外線（IR）および/または紫外線（UV）レーザを使用したマイクロダイセクションを行う。
   1. 「ライブ」画像に、選択した領域をコピーします。
   2. 「顕微解剖」ツールボックスで、適切なIRキャプチャやUVカットのボタンを選択します。
6. 切開が完了した後、QC局にLCMキャップを移動させ、解剖した組織/細胞の画像を取り込む。別のアプローチは、これは、ユーザが様々な倍率で撮影することができ、従来QCステーションに移動するスライドの空白領域上にキャップを配置することである。
7. 効率をさらに引き上げる評価するためにマイクロダイセクション後に、関心のある組織領域の画像をキャプチャします。
8. 所望の細胞が正常に解剖されている場合は、下流の分析のための分子の抽出手順を開始するArcturusXTソフトウェアで「現段階」ボタンをクリックし、LCMキャップを取り外します。

FFPEヒト乳房組織切片は、標準的なIHCプロトコール23を用いてサイトケラチンAE1/AE3に対して免疫染色した。染色後、組織スライドはArcturusXTステージ上に置き、上記のようにSIVQ-LCMプロトコルが開始した。組織顕微解剖のためにカバースリップすることができないので、+ IHC染色された細胞は、視覚的に（ 図1A）を識別することは困難である。これにより、より良好な屈折率整合および改善された画像を提供するために、キシレン擬似カバーガラス15（ 図1B）を作成するために組織切片に添加した。 JPEG画像は、擬似的なカバーガラス面積がキャプチャされ、アルゴリズム解析のためのSIVQにインポートされました。ユーザーが選択した述語画像特徴（ダークブラウンのDAB染色）は画像（ 図1C）を分析するためにSIVQアルゴリズムを開始した。 SIVQのヒートマップは、その後、自動化された選択ソフトウェア（ 図1によって認識されている「赤ペンキ」に変換されたD）。キシレンを蒸発させ、そしてSIVQのヒートマップを自動選定ソフト（ 図1E）にインポートされ、強調表示されたセルは、IRレーザーで切開した。 LCMキャップは次いでArcturusXT器具のQCステーションに移動し、視覚的に切開効率（ 図1F）を評価するために検査した。残りの組織も観察した（ 図1G）とSIVQのヒートマップは、さらに、マイクロダイセクション効率（ 図1H）を評価するために再インポートされました。

図1。IHCのSIVQ-LCMは、FFPE乳房組織を染色した。パネルAのA）サイトケラチンAE1/AE3のUncoverslipped画像のFFPE乳房組織を染色した。B）キシレンコーティングされた（擬似カバーガラス）の画像、D）からキャプチャリングベクトル（述語画像）を使用してヒートマップを生成した。 ArcturusXTでは、AutoScanXTソフトウェアは赤い注釈を認識するように訓練した。E）AutoScanXTアルゴリズムLCMキャップ。G）のスライド上の組織の画像の後にマイクロダイセクション乳房上皮細胞の、F）画像から生成顕微解剖マップ切開した組織領域にマイクロダイセクションマップ（パネルE）のマイクロダイセクションH）オーバーラップしている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

マイケル·R·エマート、バックにはレーザーキャプチャーマイクロダイセクションをカバーするNIH-保有する特許に関する発明者であり、NIH技術移転プログラムを通じてロイヤルティ報酬を受け取る。