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方法論記事

ディスク顕微鏡スピニング共焦点の使い方アデノウイルスやレンチウイルス形質導入後の初代ラット新生児心筋細胞の生細胞イメージング

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DOI:

10.3791/51666

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2014年6月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max-Planck-Institute for Molecular Biomedicine and Institute of Cell Biology, 2Department of Internal Medicine, Yale Cardiovascular Research Center and Section of Cardiovascular Medicine

この記事について

サマリー

このプロトコルは、共焦点回転ディスク顕微鏡を用いたレンチウイルスおよびアデノウイルス形質導入後の初代ラット新生児心筋細胞を用いた生細胞イメージングの方法を説明しています。これにより、生きた心筋細胞の細胞過程を詳細に観察することができます。

要約

彼らは簡単に単一のプロシージャで大量に単離することができるので、初代ラット新生児心筋細胞では、基本的なin vitroでの心血管系の研究に有用です。原因顕微鏡技術の進歩には、細胞への毒性に関する最小限の懸念をリアルタイムに細胞事象を調査する目的で生細胞の画像をキャプチャすることは比較的容易である。このプロトコルは、細胞の性質を調節するためのレンチウイルスおよびアデノウイルス形質導入後の共焦点回転ディスク顕微鏡を用いて、初代ラット新生児心筋細胞の生細胞タイムラプス画像を撮影する方法を説明します。ウイルスは二つの異なるタイプのアプリケーションは、簡単に2つの異なる遺伝子のための適切な伝達率および発現レベルを達成することができる。ウェル集束生細胞画像が長期間にわたって安定したフォーカスを維持し、顕微鏡のオートフォーカスシステムを用いて得ることができる。この方法は、外因的にエンジニアの機能を適用すること初代培養細胞において発現編タンパク質は分析することができる。さらに、このシステムは、siRNAの使用を介して、並びに化学モジュレーターの遺伝子の機能を調べるために使用することができる。

概要

初代ラット新生児の心筋細胞は、長い試験管 1 に心筋細胞の機能を調べるために用いられてきた。彼らはいくつかのよく確立された方法2-4でラットの子から隔離するのは簡単です。最も一般的な方法は、従来の細胞分離に対する心臓の結合組織を消化するコラゲナーゼまたはトリプシンを採用しています。研究者はまた、大人のげっ歯類5-8だけでなく、新生仔マウス9,10から心筋細胞を単離する方法を開発した。

このプロトコルは、2段階の酵素消化手順を用いて、新生仔ラットから心筋細胞を単離するための方法を記載している。トリプシンは最初に、4℃でO / Nを使用し、次いで、37℃で、精製されたコラゲナーゼ4℃でのトリプシンのO / Nと心臓組織のインキュベーションは、温かい酵素液2シーケンシャルインキュベーションを用いる方法に比べて収穫細胞に必要な手順を軽減します。加えて、精製されたCOを使用して、むしろ粗酵素よりllagenase、ロット間変動は、このように強化された再現性を提供し、排除することができる。

特定のタンパク質の機能的研究は、多くの場合、アデノウイルス11-13および/ ​​または14-16レンチウイルスを用いたタンパク質発現系を使用する。 [注意事項]ウイルス産生および操作は、NIHガイドラインに従って実施されるべきである。

アデノウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれない。これは、分裂細胞​​および非分裂細胞を含めたほとんどの細胞型、ならびに初代細胞および樹立細胞株における形質導入の非常に高い効率を有する。これは、アデノウイルスの遺伝子発現のための信頼性のベクトルになります。アデノウイルスベクターによってコードされるタンパク質の高レベルの形質導入後48時間以内に発症し、それらは数週間続く ​​ことができる17。しかし、タンパク質発現のためのアデノウイルスを使用して1つの欠点は、組換えADEの開発novirusは複雑で時間がかかるの両方です。多くの研究者は組換え遺伝子発現のためのレンチウイルスに目を向けてきたのはこの欠点は、部分的に説明しています。アデノウイルス構築とは異なり、レンチウイルスコンストラクトを生成することは、迅速かつ簡単です。レンチウイルスは、一般に、アデノウイルス形質導入のより低い効率を有するが、分裂および非分裂細胞の両方において、それらは、宿主ゲノムに組み込まない。その結果、形質導入された遺伝子の発現は、アデノウイルス、レンチウイルスに対するよりも、より安定である。

による顕微鏡の分野における技術の進歩のために、組換えタンパク質を発現する細胞の生細胞画像を取り込むことがはるかに簡単である。これは、さらに、取得ビデオレート速度で成り立つ。これは研究者は、目的のタンパク質の特定の改変は、機能的に、リアルタイムで細胞に影響を与える方法を決定することができます。共焦点回転ディスク顕微鏡は、LIVのための最適な手法にするいくつかの重要な機能を持っているEセルイメージング18,19。同時に、点走査型共焦点顕微鏡よりもはるかに少ないレーザーパワーを利用して横河スピニングディスクは、はるかに迅速な画像取得を可能にする。これらの特別な機能の両方は、レーザがサンプルに同時に通過する多数の孔を含有する共焦点スピニングディスク、によるものである。収集中に、ディスク自体は、迅速かつ継続的に18〜20を回転させる。顕微鏡のオートフォーカスシステムを使用することにより、安定したフォーカスが長期間にわたって維持される。これは研究者が十分に焦点を当てた生細胞の画像を撮影することができます。取得した画像を動画ファイルとして再生されます。画像は、ImageJの21,22、フィジー23、又は他の市販のソフトウェアなどの画像解析ソフトウェアを用いて分析する。

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プロトコル

ラット新生児心筋細胞の1。分離

  1. ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）および培養培地としてウシ胎児血清（FBS）およびペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）を補充した最小必須培地（MEM）を使用。単離後の最初の2日間線維芽細​​胞の増殖を防ぐために培地にブロモデオキシウリジン（BrdUの）を追加する。
基本培地 FBS のBrdU（MM） P / S（U / ml）を
選択のDMEM 10パーセント 0 20
初日のDMEM 10パーセント 0.1 10
次の日 DMEM / MEM 5％ 0.1 10
さらに文化 DMEM / MEM 5％ 0 10

表1：ラット新生児心筋細胞用培地は、ラット新生児の心筋細胞を培養するための、このメディアを使用してください。 DMEM / MEMはDMEMおよびMEM培地の1:1混合物である。

  1. 心筋細胞の単離、1日目（推定必要時間、約1時間）
    注：新生児げっ歯類での作業のために、動物のケアプログラムで設定された地元の大学のガイドラインやルールを参照し、制度的に承認された動物のプロトコルに準拠しています。このプロトコルで説明されているすべてのメソッドは、イェール大学の動物資源センターの施設内動物管理使用委員会によって承認されている。
    1. 試薬およびツールを準備し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス液（CMF HBSS）、30ミリリットル×2、10ミリリットル×2、氷の上で;氷上CMF HBSSの2ミリリットルで再構成1mgのトリプシン;オートクレーブ処理ツール; 250mlビーカー中の70％エタノール（EtOH）; 4は、10cmのプラスチック皿、心を単離するための3およびトリプシン処理のための1つを滅菌した。
    2. オーダー1私信実験動物ディストリビューターからのダムとの1対2日齢のラットの子（約10匹）のER。
    3. 1日目は、小さなケージに子犬を移し、ケタミン/キシラジンカクテル（ケタミン、200ml/10gおよびキシラジン20ml/10g）過剰摂取でダムを安楽死させる。
    4. 1子犬を取り、70％エタノールで、その全身を消毒する。他の子犬から隔離場所で殺菌10cmのプラスチック皿上手入れの行き届いた鋭い外科はさみで子犬の首。
      NOTE：可能な限り迅速にサンプルを収集するためには、齧歯動物の寿命を終了させるための最も迅速で効率的な方法を使用するのが最適である。きちんと手入れの行き届いた設備と熟練した専門家によって使用断頭は、動物にはあまり恐怖や不安を生じ、安楽死の他の形態よりも、より迅速かつ実用的であり得る。それは、動物の安楽死のためのアメリカ獣医師会ガイドラインの勧告と一致している。
    5. 彼破っ取り外し滅菌ツールとアート、そして50ミリリットルコニカルチューブに30ミリリットルの氷で冷やし、CMF HBSS中で心を置く。注：可能な限り迅速に心を取り出して、すぐに氷上にそれらを置く。身体から心を除去した後、すべての手順は、氷の上で行ってください。
    6. 氷で冷やし、CMF HBSSの30ミリリットルと氷で冷やし、CMF HBSSの別の30ミリリットルの残りの5心の中に5心を集める。心を洗うためにチューブを旋回。注：このステップの後、層流フード内のすべての手順を実行します。
    7. 上澄み液を捨て、氷の上に新しい滅菌10cmのプラスチック皿に心を移す。注：アスピレーターで心を吸引しないように注意してください。
    8. 大型船および/または望ましくない組織を削除します。心をすすぐために皿に氷で冷やし、CMF HBSSの10ミリリットルを追加します。
    9. 氷の上に新しい滅菌10cmのプラスチック皿にすべての心を転送します。氷上で1mm未満3にハサミで心をミンチ。
    10. チルドCMFのHBSS 9ミリリットルを追加します。チルドトリプシンreconstiの1ミリリットルを追加します。CMF HBSS（最終50 UG / ml）でtuted。
    11. パラフィルムで、皿を密封し、アルミホイルでそれをカバーし、一晩、低温室（4˚C）に置きます。
  2. 心筋細胞の分離、2日目（推定必要時間、約4時間）
    1. 準備試薬およびツール：50ミリリットルコニカルチューブ×2;氷上でCMF HBSS 1mlので再構成2mgのトリプシン阻害剤;室温（RT）でのリーボビッツL-15、5 mlで再構成ユニット1500コラゲナーゼ;リーボビッツL-15、滅菌した1リットルの水で再構成し、0.22ミクロンのフィルター、RTで8ミリリットルを通して濾過;水に10 mg / mlの（32.6ミリモル）のBrdU; P / S; DMEM + 10％FBS; MEM; 2つの10センチメートルのプラスチック細胞培養皿; 3.5センチメートルのガラスボトムディッシュ。
    2. 2日目、ゼラチンコーティングされた料理を準備。コー​​ティングするためにイメージング実験用の3.5cmガラスボトムディッシュを0.1％ゼラチン水溶液1ミリリットルを追加します。使用前にゼラチン溶液を吸引し、廃棄した後、数時間で37˚Cでの料理をインキュベートする。
      NOTE：3.5センチメートルのガラスボトムディッシュでは、蛍光顕微鏡を用いてイメージング実験に適している。ウェスタンブロット（WB）によりタンパク質発現を検出するために、初代心筋細胞からタンパク質を抽出するために、0.1％ゼラチン被覆されたプラスチック細胞培養皿を用いることができる。
    3. 滅菌フード内において50ミリリットルコニカルチューブに緩衝液と一夜トリプシン消化し、すべての心臓組織を転送します。 CMF HBSS中トリプシンインヒビターの1ミリリットル（最終182 UG / ml）を追加します。を50mlコニカルチューブの開閉蓋をしっかり汚染を防止する。
    4. 組織を温めて30〜37˚Cにバッファリングするために37˚Cのインキュベーター内で約30分間チューブをインキュベートリーボビッツL-15（最終94単位/ ml）にコラゲナーゼの5ミリリットルを追加します。穏やかに振盪（37˚Cのインキュベーター内で170〜200回転シェーカー）で45分間37˚Cでインキュベートする。
      注：このステップでは、層流フードの外側に行うことができる。それ以降のすべてのステップは室温で行われる必要があります。
    5. 70％エタノールで50ミリリットルコニカルチューブの外側を消毒して置くそれ滅菌フード内。
    6. 20倍の速度を3ml /秒でピペッティングして、自動ピペットを用いて磨砕組織。組織残留が3分のために解決し、70 UMセルストレーナーで上清をフィルタリングすることができます。
      NOTE：レギュラーサイズを10mlピペットでトリチュレートために使用することができる。
    7. 残りの組織塊と粉砕物にリーボビッツL-15の5ミリリットルを加え、再び上清をフィルタリングします。リーボビッツL-15 2mlのセルストレーナーを洗浄します。
    8. コラゲナーゼは、部分的に分解されたコラーゲンを消化できるようにするために60分 - 20フード内で濾過した細胞液を配置します。
    9. 5分間100×gで沈降細胞。 10％FBS及び高濃度P / S（20 U / ml）を含有する20mlのDMEM中で細胞を再懸濁する。
    10. 心筋細胞の選択のため37˚CでのCO 2インキュベーター中で1時間2 10cmのプラスチック製の細胞培養皿上で事前にプレート細胞。注：線維芽細胞は、心筋細胞よりも皿の底により容易に取り付けます。
    11. WHパリウェイティング、DMEM中、10％FBS、P / S（10 U / ml）および0.1 mMのBrdUをを含む準備。 10％FBSおよびP / Sを含むDMEMの325ミリリットルに10 mg / mlののBrdU 1ミリリットルを追加します。
    12. 優しく料理を旋回し、2 10cmの皿から心筋細胞を含む上清を収集します。
      注：ほとんどの心筋細胞は、依然としてインキュベーションの1時間後に上清中に浮遊されます。軽くお皿に付着している線維芽細胞を汚染しないようにするには、ピペッティングにより上清を収集することはありません。
    13. オプションの>細胞の生存率をチェックするために、0.2％トリパンブルーでとすることなく、上清中の細胞を数える。
    14. 5分間100×gで沈降細胞。 10％FBS、P / S（10 U / ml）および0.1mMのBrdUを含有DMEM中で細胞を再懸濁する。顕微鏡を用いて観察するためのゼラチンでコーティングされたの3.5cmガラスボトムディッシュでの2×10 5細胞/皿のプレートの細胞。注：37˚CでのCO 2インキュベーター内に少なくとも24時間、めっき後の細胞を乱さないでください
    15. 3日目、チャNGE培地で24時間、5％FBS、P / Sおよび0.1mMのBrdUを含有するDMEM / MEMにめっき後。
    16. 4日目、5％FBSおよびP / Sを含有するDMEM / MEM培地にプレーティング後48時間に変更し
      注：5％FBSおよびP / Sを含むDMEM / MEMで2〜3日ごとに培地交換

2。レンチウイルス形質導入

  1. レンチウイルスプラスミドのパッケージング
    注：このテーマ24〜26の詳細、詳細な情報については、他の情報源を参照してください。これは、レンチウイルス溶液を調製し、約3日かかります。それは、より高い導入効率を達成するために、新鮮なレンチウイルスソリューションを使用することをお勧めします。レンチウイルスプラスミドと並行して、ラット新生児心筋細胞を単離のパッケージングを開始します。代わりに、レンチウイルスパッケージングプラスミドのポリエチレンイミン（PEI）27を使用するのではなく、市販のトランスフェクション試薬を使用することができる。メーカーの指示に従ってください。
    1. 試薬およびツールを準備します。 HEK293T細胞を、10cmのプラスチック製の細胞培養皿、レンチウイルスプラスミド溶液（pMDLg / PRRE、のpRSV-英語、pMD2.G、レンチウイルストランスファーベクター、1.0 mg / mlの各々）、1g / lのPEI、無血清培地、20mMの70％EtOH中の水、10％漂白剤、1％SDS中クロロキン
    2. 0日目を 10cm当たり2〜2.5×10 6のHEK 293T細胞をトランスフェクションの前日皿プレート。
      注：トランスフェクションで30〜60％のコンフルエンスが最適である。
    3. 1日目 、PEIトランスフェクション溶液を準備する。 1.5mlチューブ内の960のUL無血清培地に1グラム/リットルPEIの30 ULを追加します。 1.5mlチューブ内のPEIトランスフェクション溶液に4プラスミドを追加し、タップして混ぜる。
    プラスミドの名前ノートサイズ（kbpの） ボリューム追加（ML） 10cmディッシュ（mg）の中の最終量 10cmディッシュ（PM）中の最終濃度
    レンチウイルス導入ベクター包装される遺伝子をコードする 9月13日 3.6から5.2 3.6から5.2 60
    pMDLg / PRRE HIV-1 GAG / POLを表現 8.8 1.76 1.76 30
    のpRSV-REV HIV-1のREVを表現 4.1 0.82 0.82 30
    pMD2.G VSV Gが表現 5.8 1.16 1.16 30

    表2：レンチウイルスパッケージングのためのプラスミドの量は、10cmの皿でHEK293細胞をトランスフェクトするために、これらのプラスミドの量を使用する。皿当たりレンチウイルス導入ベクターの最終量は60時に皿あたりの最終濃度を維持するため、その大きさに応じて異なる場合があります。二本鎖DNAの一塩基対の平均分子量は660ダルトンである。

    1. 古い培地を捨てるHEK 293T細胞の10cmの皿から、ゆっくり新しい培地9ml（P / SなしのDMEM +10％FBS）を追加。
    2. PEI-DNA混合物を追加そっとプレートに単位を落とし、ゆっくりと媒体と混合する旋回。 10ミリリットルを培地に20mMのクロロキン（最終20 UM）10μlのを追加します。 NOTE：クロロキン、リソソームコンパートメント28内のpHの部分的な中和を介したプラスミドを含有するトランスフェクション複合体の分解を減少させると考えられている。
    3. 6時間、37˚CでのCO 2インキュベーターで培養する。次いで、PEI-DNA混合物を含有する培地を除去し、新しい培地10mlを加える（DMEM + 10％FBS + 20 mMの4 - （2 - ヒドロキシエチル）-1 - ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、pH7.4の+ P / S） 。 NOTE：インキュベーション後、ウイル​​スが培地中に生産されるであろう。吸引パスツールピペットおよび/またはチップには10％の漂白剤で除染する必要があります。関係なく、常に上清をこぼしたかどうかの生物学的安全キャビネットの表面を除染し、70％EtOHで汚染された可能性の機器か。スピルが発生した場合、70％EtOH中の1％SDSで十分に汚染除去が必要である。
    4. 一日2〜3、48〜72時間、37˚CでのCO 2中インキュベートインキュベーター。4日目 、（ セクション2.2に進みます）レンチウイルスソリューションを収集します。
      注：ミディアムトランスフェクション後48時間で変更することができます。ウイルス上清を収集する48時間と72時間2倍の力価のウイルス溶液を得るために達成することができる。
  2. レンチウイルスソリューションおよび形質導入のコレクション
    1. 試薬およびツールを準備します。15ミリリットルコニカルチューブ、1M HEPES、pH7.4の（0.22 UMフィルタリング）
    2. 4日目 、15ミリリットルコニカルチューブにUM 0.45通ってフィルタを上清をフィルタリングして、ルアーロックシリンジに滅菌10mlでレンチウイルス粒子（レンチウイルスソリューション）を含む上清を回収。フィルターレンチウイルス溶液（最終10 mM）を1 M HEPES pH7.4の1/100のボリュームを追加します。
      注：フィルタリングのために、唯一のセルロースエースを使用テートまたはポリエーテルスルホン（PES）（蛋白質結合の低いもの）フィルタ。ニトロセルロースフィルターを使用しないでください。ニトロセルロースは、レンチウイルスエンベロープ上の表面タンパク質に結合し、ウイルスを破壊する。
    3. 1.2節の最後のステップで得られたラット新生児心筋細胞の3.5センチメートルディッシュから培地を除去3.5 cmディッシュにフィルタレンチウイルス溶液1mlを加える。
    4. 臭化ヘキサジメトリン（最終濃度4-6 UG / ml）を追加し。
      NOTE：ヘキサジメトリンブロミドは、レンチウイルス形質導入の効率を高めることができる。ヘキサジメトリンブロミドの濃度が最適化されるべきである。
    5. レンチウイルス形質導入のため37˚CでのCO 2インキュベーターで6時間、お皿をインキュベートし、5％FBSおよびP / Sを含む新しいDMEM / MEMに培地を変更3日間、37˚CでのCO 2インキュベーター内で料理をインキュベートする。
      NOTE：レンチウイルスによる宿主ゲノムへの外来遺伝子の組み込みは、72時間までに完了していると考えられる。
    7. 日7、次のステップのためのステップ2.2.5から細胞を使用してください。 NOTE：レンチウイルスプラスミドからのタンパク質発現は、相対的な発現レベル（図1aおよび1b）を決定するために、形質導入の48〜72時間後にWB又は免疫細胞化学（ICH）により確認することができる。
  3. レンチウイルス溶液の濃度
    注：これは、レンチウイルス溶液の力価が十分に高くない場合には、最も高い形質導入効率を達成するために、新鮮なレンチウイルス溶液を使用するのが最適であり、レンチウイルス溶液は、ポリエチレングリコール（PEG）沈殿29によって濃縮することができる。
    1. 4倍のPEG溶液（32％PEG6000、400mMの塩化ナトリウム（NaCl）を、40mMのHEPES pH7.4）中の調製
      1. 125ミリリットル4X PEG溶液のために、そして60ミリリットルの水に溶かし、PEG6000の40グラムの重量を量る。
        注：注：（。 すなわち PEG6000の平均分子量は6000である）、PEGの後の数字は平均分子量である
        注：2.3.1.2）をゆっくりと10ミリリットルを追加の5M NaCl。ゆっくりと1のHEPES pH7.4の5mlのを追加します。 2Mの水酸化ナトリウムを用いてpHを7.4に調整する。
        注：2.3.1.3）125ミリリットルに水を追加します。 0.22μmのフィルターを用いて膜濾過により4X PEG溶液を殺菌し、4˚Cで保管して
    2. レンチウイルス濃度
      1. フィルタレンチウイルスは、0.45μmのフィルターを用いて新たな50mlチューブに上清を形質導入した。
        注：上清= 1:3）：2.3.2.2）4X PEG溶液を1:3の比（PEG溶液を追加します。 16〜48時間、4˚Cで保存してください。
        注：30分間4˚Cでの2600 X gで2.3.2.3）遠心分離する。 5分間4˚Cでの2600 X gで上清遠心を捨てる。
        注：2.3.2.4）のペレットを乱さないように注意し、上清を捨てる。再懸濁1/2元の上清容積の1/25容積するため使用する無血清培地中でペレット。
        注：2.3.2.5）を直接使用するか、液体窒素を用いて凍結し、-80˚Cで保存

3。アデノウイルスの形質導入

注：アデノウイルス構築13の構成および増殖のための方法のために他の情報源を参照してください。吸引パスツールピペットおよび/またはチップには10％の漂白剤で除染する必要があります。常に生物学的安全キャビネットの表面を除染して、潜在的に関係なく、上清をこぼしたかどうかの70％エタノールで機器に汚染。スピルが発生した場合、70％EtOH中の1％SDSで十分に汚染除去が必要である。

  1. 50％組織培養感染量によってアデノウイルス滴定（TCID 50）
    注：形質導入する前に、アデノウイルスのストック溶液を滴定することが必要である。 TCID 50は、ウイルス溶液を滴定するための最良の方法の一つである。この方法は、HEK 293T細胞への感染力によって力価を評価しているため、計算されたTCID 50は、アデノウイルスストックの実際の感染能を反映している。 PFU（プラーク形成UNITS）約0.56 30倍でTCID 50に比例している。
    1. 細胞およびツールを準備する：HEK 293T細胞を10cmの細胞培養皿、96ウェル平底細胞培養プレート、8チャンネルマルチピペット
    2. 1 10cmの皿に70％〜90％コンフルエントのHEK 293T細胞を準備します。
    3. ウイルスストックの1月10日4の予備希釈を行う。 96ウェル平底細胞培養プレートの各ウェルにDMEM + 10％FBS50μlのを追加する。からHに、最初の行に予め希釈したウイルスストックの25 ULを追加
    4. よく混合し、8チャンネルマルチピペットを用いて二行に井戸の最初の行から25 ULを転送します。 1月3日までの井戸の各行へのウイルス溶液の希釈と11行を含むを繰り返して、最後の25 ULを捨てる。
    5. DMEM +10％FBSの10ミリリットルに粉末化したHEK 293T細胞。 1〜12行から各ウェルに細胞溶液の50μlのを追加します。
    6. 11月13日日のCO2インキュベーターで37˚Cでの細胞をインキュベートする。 DMEM +10 1の50 ULを追加4-5日とメッキの7-8日後には0％のFBS。
    7. 感染後11から13日後に各ウェルの細胞変性効果を測定します。
    レーン 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    行A D D D D D D D D D
    行B D D D D D D D D D
    行のC D D D D D D D D D
    行D D D D D D D D
    行E D D D D D D D D D D D
    行F D D D D D D D
    G行 D D D D D D D D
    行H D D D D D D D D D D D
    行当たりの陽性ウェルの数 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    行当たりの陽性ウェルの割合 1 1 1 1 1 1 1 0.75 0.63 0.25 0.25 0
    D 50％以上の細胞変性効果を表示する
    50％の下に表示されないか、または細胞変性効果

    レーン1、希釈3 1×10 4;レーン2、3 2倍希釈物4; ···;レーン11、希釈3 2×10 11;レーン12、コントロール。
    Sは、行ごとの陽性ウェルの比率の合計を=
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0.75 0.63 0.25 0.25 0 = 8.875
    ×10 8 TCID 50 = 3×10 4×3×（8.875から0.5）= 2.97
    TCID 50 / mlの= 5.94×10 9

    表3：感染した96ウェルプレート10日間のインキュベーション後 、各ウェル内の細胞変性効果を測定し、行ごとの陽性ウェルの比率を合計する例 。

    1. Kaerberの式に従って力価を計算します 31。
    2. TCID 50 =（最初のレーンの希釈）×（希釈）（S-0.5）
    3. Sは、行ごとの陽性ウェルの比率の合計を=
      注：このプロトコルの場合、TCID 50 =（30000）X（3）、（S-0.5）。ウイルス液50μlのこのプロトコルで使用されているため、TCID 50 / mlで計算するために0.05 TCID 50を分割する。
  2. アデノウイルス形質導入
    1. その力価（PFU / mlのmlまたはTCID 50 / mlのウイルス粒子/）から、アデノウイルス液の必要量を計算します。 MOI（感染多重度）を計算するための式を使用しています。
    2. EM> [ここに置いて表4]
    3. 無血清培地にウイルス溶液の計算された量を追加する（表5参照）。よく混ぜ、室温で20分間インキュベートする。
    4. EM> [ここに置いて表5]
    5. 7日目には、2.2節の最後のステップで得られた料理を取り、5％FBSおよびP / Sを含む新しいDMEM / MEMの750 ULを含む培地を交換してください
      注：中量の削減元の体積の約50％に伝達において高い導入効率のために重要である。
    6. お皿に希釈したウイルス液を追加します。 37˚CでのCO 2インキュベータ内で4〜8時間の皿をインキュベートその後、新鮮な培地と交換してください。
    7. 37˚CでのCO 2インキュベータ内で24〜48時間のために料理をインキュベート一日8-9で、生細胞イメージング実験のための細胞を使用してください。 NOTE：アデノウイルスプラスミドからのタンパク質発現は、相対タンパク質発現レベル（図1c、1dに）を決定するために、形質導入の24〜48時間後にWB又はICHにより確認することができる。

4。ライブセルイメージング

  1. 温度制御室とスピニングディスク共焦点顕微鏡を用いた画像取得およびCO 2環境システム（オプション）
    1. すべてのデバイスが買収前の先頭に37˚Cまで平衡化するように、買収前に、少なくとも1時間に温度制御システムをオンにします。 confocをオンにするら、ディスク顕微鏡システム（PC操作のため、顕微鏡、スピニングディスク装置、CCDカメラ、レーザ、蛍光光源、通常光光源、電動ステージ、自動シャッター）スピニング。
      NOTE：複数の1時間は、すべてのデバイスの完全な温度平衡を達成するの​​に必要である。
    2. 必要に応じて、取得のために必要な培地は3.5センチメートルガラスボトムディッシュにメディアを変更します。温度制御されたチャンバー内の共焦点回転するディスクの顕微鏡のステージ上の皿を置きます。
      注：原因番1.5カバーガラスで3.5センチメートルガラスボトムディッシュ（約0.16〜0.19ミリメートルの厚さ）の顕微鏡を用いて、最適な観察のための球面収差を理想的です。使用される目的は、補正環を有する場合には、0.17ミリメートルよりも厚いカバーガラスを用いて得られた画像を補正することができる。また、フェノールレッド、わずかな蛍光を持っています。場合によっては、フェノールレッドを含まないDMEM例えば、フェノールレッドを含まない培地を用いることが好ましい。 COを制御するための装置がまだ存在しない場合 2濃度UB、それは長期的なタイムラプスイメージングのためのHEPESによってバッファのCO 2の独立した媒体やメディアを使用することをお勧めします。
    3. 接眼レンズへの光路を選択します。
    4. 上の明視野光源のシャッターを切ります。接眼レンズを通して顕微鏡下で細胞にピントを合わせます。明視野光源オフのためにシャッターを切ります。
    5. 上の蛍光光源にシャッターを切ります。接眼レンズを通して顕微鏡下で蛍光タンパク質を発現する細胞を見つける。オフ蛍光光源のためにシャッターを切ります。
    6. 別売>プレスタイムラプス収集中に着実にフォーカスを維持するために、上の完璧なフォーカスシステムをオンにする顕微鏡の前で完璧なフォーカスシステムの起動ボタン。
    7. 回転するディスク共焦点顕微鏡への光路を変更します。適切に画像のディスプレイ表示をチェックし、オペレーティングソフトウェアを使用して取得するための設定を調整します画面上YED。 （ 例えばフォーカス、レーザパワー、露光時間、CCDカメラゲインおよびオフセット）
    8. オペレーティングソフトウェアを用いた蛍光画像取得のための一連の設定。例：チャンネル1のために、EGFPからの蛍光シグナルを取得するには、次のように「光路を使ってチャンネルを変更」を選択し、「EGFPチャンネル1」。
    9. オペレーティングソフトウェアを使用してタイムラプス画像を撮影するために、タイムラプスの設定を構成することで、時間の点の間の周波数を設定します。例：1の時点を5分ごとに取得するには、ドロップダウンメニューから「タイムポイントあたりミニッツ」を選択し、テキストフ​​ィールドに5を入力してください。
      注：実際の速度で映画を作るために「最高速度」を選択します。蛍光タンパク質の発現が低い場合、蛍光が経時取得中に迅速に漂白よい。その場合には、取得時間点の数を減らすことが良い。
    10. 「STAをクリックして、タイムラプス取得を開始します画像シーケンスを取得する」ボタンを室温。
      NOTE：これは、複数のポイント取得機能を使用しない方がよい。それは、タイムラプス撮影時撮像視野の焦点や移動の損失が発生することがあります。
  2. 取得された画像の解析
    NOTE：取得画像は、動画ファイルとして再生し、解析ソフトウェアを用いて分析することができる。
    1. 映画の中で含まれるように取得された画像を選択します。必要に応じて、トリミング画像から関心領域及びオペレーティングソフトウェアを使用して、ムービーのファイルサイズを小さくすることは興味深い時点を選択する。
    2. AVIのムービーファイルやMOV形式としてエクスポート画像。 "フォーマット"ドロップダウンメニューと、完成したムービーに必要なタイミングからのムービーフォーマットを選択して、「エクスポート」をクリックしてください。注：1の時点で、5分ごとに取得した時間経過の画像は、実際の速度よりも3000倍速い毎秒10フレームで映画として再生することができます。

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結果

技術は、レンチウイルスをコードするEGFP（強化緑色蛍光タンパク質）タグ化Cx43の（コネキシン43）又は細胞におけるEGFP-タグ融合タンパク質を発現するために使用された変異したCx43 32、およびアデノウイルスをコードFGFR1DN（線維芽細胞増殖因子受容体1ドミナントネガティブを説明するために）セル33-35においてFGFシグナリングをシャットダウンするために使用した。心筋細胞の単離後三日間は、孤立した心筋細胞は、細胞中のEGFP標識タンパク質を発現させるためにレンチウイルスを形質導入した。次に、レンチウイルス形質導入の3日後に、孤立した心筋細胞は、さらに細胞内のFGFシグナル伝達を排除するためのアデノウイルスのエンコーディングFGFR1DNで形質導入した。形質導入された外因性遺伝子を発現するように細胞のための十分な時間を与えた後、スピニングディスク共焦点顕微鏡は、生細胞の画像をキャプチャするために使用した。取得された画像は、動画ファイルとして再生し、画像解析ソフトウェアを用いて分析する。より詳細なrepresenta用TIVE結果は、桜井ら 32を

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ディスカッション

新生児ラットから単離された初代心筋細胞は、長いin vitroで心筋細胞の機能を研究するために使用されてきた。このプロトコルは、第4℃でトリプシンO / Nで消化し、次いで精製されたコラゲナーゼ、二段階の酵素消化法を用いて、仔ラットから新生児の心筋細胞を単離するための方法が記載されている。精製されたコラゲナーゼ工程を用いる利点の一つは、酵素の同じグレードの全ての単離のために使用されることである。このように、単離された細胞の品質と量は実験から実験と一致している。

細胞培養物の形質導入の高い効率は、所定の実験が必要である場合には、アデノウイルスに関連したより高い形質導入効率を考えると、アデノウイルスを使用することをお勧めします。高レベルの形質導入が不要な場合は、レンチウイルスベクターを使用することができる。アデノウイルスまたはレンチウイルスベクターのいずれかを使用するオプションを持つことが容易適切なtransdを達成することを可能にする遺伝子の異なるタイプのはじめ発​​現レベル。共焦点スピニングディスク顕微鏡またはICCを用いて生細胞イメージングにより検出された蛍光強...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

レンチウイルス包装についてのアドバイスをいただいたAlengo Nyamay'antu博士とIlse Timmerman博士に感謝いたします。この研究は、米国心臓協会の科学者開発助成金10SDG4170137によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
斬首用ハサミWPI501749使用前のオートクレーブ
1 心臓の隔離とチョッピングのための細いハサミWPI14393使用前のオートクレーブ
2 細かい鉗子(デュモンNo.5)シグマF6521使用前のオートクレーブ
3 滅菌済み10cmプラスチック皿シグマCLS430165心臓の隔離用
3.5cm ガラス底培養皿MatTekP35G-1.5-20-C将来の生細胞イメージングのための心筋細胞の最終めっき用。ibidiのMicro-Dishesは、許容できる代替品です。
3.5 cm ガラス底培養皿MatTekP35G-0.17-14-CTIRFまたは高解像度画像用
エタノール溶液、水中70%(v / v) シグマE7148
2%ゼラチンシグマG1393
1 滅菌済み10cmプラスチック皿シグマCLS430165トリプシン化用
アルミホイル任意のブランド
パラフィルムシグマP7543
2つの10 cmプラスチック細胞培養皿シグマCLS430165選択用
オートピペット ドラモンドサイエンティフィック4-000-300トリチュレーション用
セルカウンター
セロメータ、自動セルカウンターネクセロム細胞のチェックとカウントに
顕微鏡と血球計算計任意のブランド細胞のチェックとカウント
トリパンブルー溶液、0.4%invitrogen15250-061
CO2インキュベーター三洋MCO-19AIC
インキュベーションオービタルシェーカーシグマZ673129コラゲナーゼで心臓組織を37°Cで振る。C 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU 溶液BD Pharmingen550891
DMEM、高グルコースinvitrogen41965039ミックス培地 プロトコルに示されているように温め、使用前に温め
MEMinvitrogen31095029プロトコルに示されているように培地を混合し、使用前に温め
ウシ胎児血清invitrogen26140079
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / ml) invitrogen15140-122
セクション 2 レンチウイルス形質導入
3 パッケージングプラスミド
pMDLg/pRREAddgene12251
pRSV-RevAddgene12253
pMD2.GAddgene12259
レンチウイルス転写ベクター、pLVX-IRES-PuroClontech632183
Opti-MEM(無血清培地)invitrogen31985070
Transfection reagent
polyethyleneimine」Max", (MW 40,000) - 高効力線形PEI(遊離塩基形でMW 25,000に相当) Polysciences24765-2RocheのX-tremeGENE 9で代用可能 Roche
X-tremeGENE 9Roche6365779001トランスフェクション試薬としてPEIの代替品
ChloroquineSigmaC6628水に溶解し、100mMのストック溶液を作ります。エンドソーム酸性化の抑制は、10-100 μMクロロキン。
HEPESSigmaH3375
10 ml Luer-Lokシリンジ、滅菌済みBD309604
0.45 μmフィルターシグマF8677酢酸セルロースまたはポリエーテルスルホン(PES)(低タンパク質結合)フィルターのみを使用してください。ニトロセルロースフィルターは使用しないでください。ニトロセルロースはレンチウイルスエンベロープ上の表面タンパク質に結合し、ウイルスを破壊します。
臭化ヘキサジメトリンSigmaH9268水に溶かして8mg/mlの原液を作り、ろ過して滅菌します。
ポリエチレングリコール 6,000Sigma81260
塩化ナトリウムΣS9888
水酸化ナトリウムΣS5881
セクション3 アデノウイルス形質導入
HEK 293T細胞ATCCCRL-11268
約10cm細胞培養皿ΣCLS430165
蓋付き96ウェルマイクロプレート、平底、組織培養、滅菌BDFalcon353072滴定用
マルチチャンネルピペット、10-100 μl、8チャンネルエッペンドルフ3122 000.035
セクション4 ライブセルイメージング
スピニングディスク共焦点マイクロスポピーPerkinElmerL7267000
温度制御チャンバー任意のブランド温度を37°に保つために;C
A CO2環境システム任意のブランドCO2濃度を維持するためのオプション 最適な
CO2 独立した培地、グルタミンなしinvitrogen18045-054  長時間のタイムラプス撮影に
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol redinvitrogen21063-029長時間のタイムラプスイメージング用
てください てください の

参考文献

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