組換えセルラーゼCEL5Aの式からトリコデルマ·タバコ植物における

Summary

タバコ植物を、一過性発現系を介して、真菌セルラーゼ、TrCel5Aを作製した。発現は、蛍光融合タンパク質を用いてモニターすることができ、タンパク質活性を発現後に特徴付けた。

Abstract

セルロース分解酵素、セルラーゼは、研究と産業の利益の両方の標的である。このような菌糸構築真菌および嫌気性細菌などの難培養する生物におけるこれらの酵素の優勢は、この分野における組換え技術の使用を早めました。植物発現法は、酵素および他の工業的に有用なタンパク質の大規模生産のための望ましいシステムである。ここで、 ニコチアナ·タバカムにおける真菌エンドグルカナーゼ、 トリコデルマ·CEL5Aの一過性発現のための方法は、実証される。成功したタンパク質発現はmCherry-酵素融合タンパク質を用いて蛍光によってモニターし、示されている。さらに、基本的な一連のテストは、一過性に発現T.の活性を調べるために使用されているSDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、ザイモだけでなく、蛍光染料ベースの基質分解アッセイを含むデルマレー CEL5A、。ここで説明するシステムは、アクティブセルを製造するために使用することができる短時間でulase、構成的または誘導性発現系を介して植物におけるさらなる生産の可能性を評価するようになっている。

Introduction

リグノセルロース系バイオマスを液体燃料への変換の劣化が化石燃料への依存を低減する方法として想定されている。経済的に実現可能なバイオマス処理システムを確立する上での一つの重要なハードルは、セルロースとヘミセルロース¹の酵素分解である。植物発現系は、工業的規模での酵素の産生のための大きな可能性を示している。彼らは何千年もの間あったように収穫植物経済的にもボリューム内の農業システムは、すでに確立されています。植物におけるセルラーゼの生産は^、2自己加水分解の容易さ、および植物細胞壁¹の消化率を増加させることによって、より低い酵素レベルの使用を最大にするための電位のような要因に望ましい。最後に、植物系は、植物細胞の特定の領域への組換えタンパク質の標的化を可能にし、翻訳後^3を必要な酵素を変更することができる。

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ニコチアナ·タバコ （タバコ）は非常に一般的に、その急速な成長とバイオマス蓄積機能⁴に、植物における異種タンパク質発現の研究のためのモデル生物として使用されます。組換えタンパク質の一過性発現が局在化および選択されたタンパク質の翻訳後修飾、したがって、 即ちセルラーゼのような柔軟性を維持しつつ、短時間⁵におけるタンパク質産生を可能にする技術である。また、植物における発現の....

Protocol

野生型のN.タバコ植物の 1。成長

1. Nを成長させるタバコ L. CV。土壌へのプチハバナSR1植物は、発芽のための通常のポッティング土壌を充填適切なポットにタバコ種子を置く。 2週間後、個々のポットに苗を移す。定数22℃（暗期）または25℃（明期）および70％の相対湿度で温室で植物を培養する。 8分の16時間明/暗サイクルで照明を提供（ 例えばフィリップスIP65 400Wのランプ、180マイクロモル·秒^-1·メートル^-2;λ= 400〜700 nm）で毎日水。

TrCel5AとTrCel5A-mCherryタンパク質の2。一過性発現

1. 無菌条件下で、pTRAkc-ER-TrCel5AまたはpTRAkc-ER-TrCel5A-mCherryのいずれかを含むAgarobacterium tumefaciensの単一のコロニー（GV3101 :: pMP90RK GMR、KMR、RifR）をピックアップし、10ミリリットルの酵母抽出物を含有する三角フラスコに移すブロス（YEB、製造業者の仕様書に従って調製）培地およびカナマイシン（50 mg / ml）を、リファンピシン（50 mg / ml）を、および選択のためのカルベニシリン（100 mg / mlで）。 26℃、180rpmで....

Results

TrCel5AとTrCel5A-mCherryを、一過性発現系（ 図1Aおよび1B）を用いてタバコ植物において首尾よく発現された。 TrCel5A-mCherry融合タンパク質の発現パターンの検査は、健康な葉の緑色光（ 図1D）の下で広範なタンパク質の発現を示した（ 図1C）を 、明らかにした。

総可溶性タンパク質の抽出を一過TrCel5Aタンパク質を発現させ、SDS-PAGEは、タンパク質の多種多様を示した葉を含有していたタバコ植物で行った本であった（ 図2A、レーン1）。植物およびNTEPsに由来する全可溶性タンパク質サンプルを発現TrCel5Aからの全可溶性タンパク質サンプルを、55℃で10分間インキュベートした。他の多くの（ネイティブタバコ）タンパク質は、この温度で​​安定していないながらTrCel5Aは55℃で安定しており、アクティブな状態を維持します。このように、多くの非ess​​entiアルタンパク.......

Discussion

セルラーゼの組換え発現は、より効率的なバイオ燃料生産システム¹のための欲求に、大きな関心の分野である。植物は、このような経済的な収穫技術や、大規模なバイオ燃料生産のための非常に望ましい特性であること自己加水分解法などの機能により、成功したセルラーゼの生産のための多くの可能性を提供します。また、タンパク質を産生するための別のローカリゼーションを使用することは、必要であれば、翻訳後修飾^を可能にする^20。明らかな利点を提供しながら、セルラーゼの構成的発現を可能にするために、植物を変更するか、成功しない可能性があり、時間がかかる方法である。このような発現されたタンパク質や誘導性発現メカニズムの隔離のような技術は、植物に成功したセルラーゼの生産の可能性を高めるが、これらはまだ確立に何カ月もかかる。ここでは、一過性発現法は、特定のセルラーゼの可能性を例示するために、実証される数日のうち以内に植物系を経て製造される。

蛍光タンパク質mCherryとの融合は、一過性のタンパク質.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-メチルウンベリフェリル &β;-D-セロビオシド	SIGMA-ALDRICH	M6018
酢酸	ROTH	3738
アセトシリンゴン (濃縮)	ROTH	6003
抗生物質 - カナマイシン	ROTH	T832
抗生物質 - リファンピシン	ROTH	4163
抗生物質 - カルベニシリン	ROTH	6344
抗体 - rabbit anti His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
抗体 - ヤギ anti rabbit AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
Azo-carboxymethyl セルロース	MEGAZYME	S-ACMC
β-cyclodextrin	SIGMA-ALDRICH	C4805
塩化カルシウム二水和物	SIGMA-ALDRICH	C5080
カルボキシメチルセルロース	ROTH	3333.1
セルラーゼ Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
コンゴレッド	SIGMA-ALDRICH	75768
クーマシーブリリアントブルー G 250	ROTH	9598.2
D(+)-グルコース	ROTH	8337
エタノール	ROTH	K928
濾紙 - Rotilabo あぶらとり紙	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
MES バッファー	ROTH	4256
メタノール	ROTH	8388
クエン酸ナトリウム	ROTH	3580
ドデシル硫酸ナトリウム	SERVA	20765
水酸化ナトリウム	ROTH	6771
土壌、Einheitserde classic	PATZER GMBH
分光計 - Infinite M200	TECAN
ショ糖	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-ヒドロキシベンズヒドラジド	SIGMA-ALDRICH	H9882
リン酸緩衝生理食塩水	ROTH	1058
UV 光源 - BLAK RAY	UVP
Vibratome - VT1000S	Leica