組換えセルラーゼCEL5Aの式からトリコデルマ·タバコ植物における

サマリー

タバコ植物を、一過性発現系を介して、真菌セルラーゼ、TrCel5Aを作製した。発現は、蛍光融合タンパク質を用いてモニターすることができ、タンパク質活性を発現後に特徴付けた。

要約

セルロース分解酵素、セルラーゼは、研究と産業の利益の両方の標的である。このような菌糸構築真菌および嫌気性細菌などの難培養する生物におけるこれらの酵素の優勢は、この分野における組換え技術の使用を早めました。植物発現法は、酵素および他の工業的に有用なタンパク質の大規模生産のための望ましいシステムである。ここで、 ニコチアナ·タバカムにおける真菌エンドグルカナーゼ、 トリコデルマ·CEL5Aの一過性発現のための方法は、実証される。成功したタンパク質発現はmCherry-酵素融合タンパク質を用いて蛍光によってモニターし、示されている。さらに、基本的な一連のテストは、一過性に発現T.の活性を調べるために使用されているSDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、ザイモだけでなく、蛍光染料ベースの基質分解アッセイを含むデルマレー CEL5A、。ここで説明するシステムは、アクティブセルを製造するために使用することができる短時間でulase、構成的または誘導性発現系を介して植物におけるさらなる生産の可能性を評価するようになっている。

概要

リグノセルロース系バイオマスを液体燃料への変換の劣化が化石燃料への依存を低減する方法として想定されている。経済的に実現可能なバイオマス処理システムを確立する上での一つの重要なハードルは、セルロースとヘミセルロース¹の酵素分解である。植物発現系は、工業的規模での酵素の産生のための大きな可能性を示している。彼らは何千年もの間あったように収穫植物経済的にもボリューム内の農業システムは、すでに確立されています。植物におけるセルラーゼの生産は^、2自己加水分解の容易さ、および植物細胞壁¹の消化率を増加させることによって、より低い酵素レベルの使用を最大にするための電位のような要因に望ましい。最後に、植物系は、植物細胞の特定の領域への組換えタンパク質の標的化を可能にし、翻訳後^3を必要な酵素を変更することができる。

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ニコチアナ·タバコ （タバコ）は非常に一般的に、その急速な成長とバイオマス蓄積機能⁴に、植物における異種タンパク質発現の研究のためのモデル生物として使用されます。組換えタンパク質の一過性発現が局在化および選択されたタンパク質の翻訳後修飾、したがって、 即ちセルラーゼのような柔軟性を維持しつつ、短時間⁵におけるタンパク質産生を可能にする技術である。また、植物における発現のさらなる戦略のための基礎を敷設しながら、基本的な分析のためのセルラーゼ（単数または複数）の産生を可能にする。このような一過性発現戦略を用いて、真菌宿主トリコデルマ·リーゼイ （ ハイポクレアジェコリーナ ）由来のグリコシルヒドロラーゼファミリー^{5、CEL5A、6}からエンドグルカナーゼ（以下TrCel5Aと呼ぶ）が生成される。 TrCel5Aはネイティブにグリコシル化されている42 kDaのタンパク質であり、HYDに高活性であるセルロース鎖^7を roylzing。

ここで説明する一過性発現技術は、植物はアグロバクテリウムは 、適切な発現ベクターに目的の遺伝子を保有する葉浸潤、比較的一般的に使用されるシステムに基づいている。 インプランタ発現の成功の迅速な分析を可能にするために、TrCel5AもmCherry、本来ディスコソマ（Discosoma）種に由来する単量体の蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現させることができる。タンパク質DsRedは^8、さらに6ヒスチジン残基（Hisタグ）は、に融合してC末端（TrCel5A-mCherry）。異種融合タンパク質、TrCel5A-mCherryの発現は、このようにmCherryの分散を調べるために緑色光を用いて成長した植物内で監視することができる。所望であれば、植物材料の薄い部分は、タンパク質の特異的な局在を確立するために顕微鏡的に緑色光下で検査することができる。この作品、信号TRANのため座るペプチドは、小胞体から⁹異種タンパク質輸送をローカライズするために、構築物に組み込まれた。

TrCel5Aを含む植物発現セルラーゼの活性を分析するために、セルラーゼ活性試験の数を実行することができる。全可溶性植物タンパク質を抽出した後、TrCel5Aは、部分的に熱インキュベーション法を用いて精製することができる。タンパク質サイズは、ウェスタンブロッティング、続いてSDS-PAGEを使用して確立される。溶解度^10：ザイモグラフィーはカルボキシメチル化（CMCカルボキシメチルセルロースの製造）されたセルロース、例えば 、基質に対する活性を分析するために使用することができる。セルラーゼとグルコシダーゼ活性は、（4-MUC合わせた）β-D-セロビオシドに関連付けられたフルオロフォア4 - メチルウンベリフェリル（4-MU）を使用してモニターすることができる。エンドグルカナーゼ活性を評価するための別の方法は、アゾdで関連付けられているCMCの分析を含むあなたがた（Remazolbrilliantブルー^R）11。また、エンドグルカナーゼ及びセルラーゼの範囲の両方のタンパク質の活性は、p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（PAHBAH）アッセイ¹²などの糖分析試験の使用によりモニターすることができる。これらの技術は、目的の発現セルラーゼの活性を解明し、定量することができる。

プロトコル

野生型のN.タバコ植物の 1。成長

1. Nを成長させるタバコ L. CV。土壌へのプチハバナSR1植物は、発芽のための通常のポッティング土壌を充填適切なポットにタバコ種子を置く。 2週間後、個々のポットに苗を移す。定数22℃（暗期）または25℃（明期）および70％の相対湿度で温室で植物を培養する。 8分の16時間明/暗サイクルで照明を提供（ 例えばフィリップスIP65 400Wのランプ、180マイクロモル·秒^-1·メートル^-2;λ= 400〜700 nm）で毎日水。

TrCel5AとTrCel5A-mCherryタンパク質の2。一過性発現

1. 無菌条件下で、pTRAkc-ER-TrCel5AまたはpTRAkc-ER-TrCel5A-mCherryのいずれかを含むAgarobacterium tumefaciensの単一のコロニー（GV3101 :: pMP90RK GMR、KMR、RifR）をピックアップし、10ミリリットルの酵母抽出物を含有する三角フラスコに移すブロス（YEB、製造業者の仕様書に従って調製）培地およびカナマイシン（50 mg / ml）を、リファンピシン（50 mg / ml）を、および選択のためのカルベニシリン（100 mg / mlで）。 26℃、180rpmで36〜40時間インキュベートする。注意：タンパク質発現のための適切な構築体のデザインは、本稿の範囲外ですが、指導のため、マクリーンら ¹³とマンローとPellham ¹⁴の方法には、構造物の設計のために続けることができます。
2. 上記の抗生物質濃度をYEBの20ミリリットルを接種し、前と同じ条件でインキュベートする各培養液200μlを取る。
3. 36-40時間後、2μlのアセトシリンゴン（200μM最終濃度）、100μLの40％（w / v）のグルコース溶液と1 M MES緩衝液（pH5.6）を200μl。を添加することによって培養物をpreinduce一晩インキュベートする。
4. 2×浸潤緩衝液（100 g / Lのスクロース、3.6グラム/ Lのグルコース、8.6グラム/ Lムラシゲ·スクーグ基本塩を100mlを調製、）、水酸化カリウムを使用して5.6にpHを調整する。
5. それは、OD 5-6の_600に到達するまで1時05希釈液との文化のOD _600を測定します。 OD ₆₀₀で30ミリリットル浸潤培地に必要な培養液量を計算します。 2X浸潤バッファの15ミリリットルを追加し、30ミリリットルまでのバッファを作るために、脱イオンH ₂ Oを加える。
6. 温室から植物を取り出し、浸透を容易にするために、上から5 ^番目の葉に、ニックに3 ^回目の背軸側をピペットチップを使用しています。
7. 侵入を容易にするために、ニックに葉の背軸側をピペットチップを使用してください。
8. 浸透培地で注射器を記入し、以前に作らニックの1に（針なしで）それを置く。向軸、葉側の指で注射器をサポートしています。 interveinal葉ゾーンの組織の中に慎重に培地を押してください。注意：浸透後、上記と同様の条件で、温室内の植物を栽培しています。また、untrの同じ割合を維持浸透させた植物と同じ条件下で、コントロールとしてeated、非一過性発現植物（NTEPs）。

植物の葉におけるTrCel5A-mCherry発現の3。評価

1. 4-6日後、Aに浸透させた植物を取る温室からpTRAkc-ER-TrCel5A-mCherryを含有し、蛍光分析のために、暗い部屋の中に置いツメファシエンス 。
2. 赤色フィルター（620から750ナノメートル）と515 nmの緑色の光を発する携帯用光源を用いTrCel5A-mCherry、光の植物を表す葉の切片の蛍光を可視化した。注：深さは、植物の葉におけるタンパク質発現の特徴付けは、光及び蛍光顕微鏡下で検査し、ビブラトームで薄切片の葉によって達成することができる。このために、以下の手順に従います。
   1. 浸潤葉から約5×5mmの大きさの小さな部分をカットし、アガロース50 mMリン酸緩衝液（pH 5.7）に溶解し、4％に埋め込む。
   2. カットビブラトームを使用して埋め込まれた葉から、80〜90ミクロンの大きさの部分。バッファまたはカバースリップで覆い、上述と同じ波長フィルタを用いて、蛍光検出器を用いて10倍の倍率で顕微鏡を使用して調べ、顕微鏡スライド上に置きます。

タバコ葉から4。TrCel5A抽出

1. A.に感染した植物から1グラムのおおよそのウェイトにタバコの葉から作品をカット液体窒素で予冷し乳鉢でpTRAkc-ER-TrCel5Aと場所を含むツメファシエンス 。サンプルに液体窒素を適量入れる。グラインドは予備冷却乳棒を使用して粉末に残します。
2. 接地葉印刷物に1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）2 mlを加え、葉状物質の大部分が懸濁液中になるまで混合する。 4℃で20分間15,000 xgで遠心抽出物およびタンパク質を含む上清を取る。
3. セントリフーガ4℃で20分間15,000×gでの抽出物とは、ペレットを破壊しないように注意しながら、タンパク質を含む上清を取る。ペレットを捨てます。
4. 部分的に10分間55℃でタンパク質含有上清をインキュベートすることによってTrCel5Aを精製する。 RTで10分間15,000 xgで遠心分離し、次いで、さらに10分間室温で休息できるようにする。対照サンプルを得るために、非浸潤植物のための部分的な精製プロセスを繰り返します。以下のすべての実験のために、これらのサンプルを使用してください。注：タンパク質溶液は、1週間まで、または最大3ヶ月間、-20℃で、4℃で保存することができる。
5. 対照サンプルを得るために、非浸潤植物のための部分的な精製プロセスを繰り返します。以下のすべての実験のために、これらのサンプルを使用してください。注：タンパク質溶液は、1週間まで、または最大3ヶ月間、-20℃で、4℃で保存することができる。

5。、SDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、およびTrCel5A-mCherry <アゾ-CMCザイモ/ pの>

1. 購入または確立された方法¹⁵に従って（w / v）のSDS-PAGEゲル12％を準備。
2. 1.5％（w / v）の溶液を得、水にCMCを溶解する。 CMC-SDS-PAGEゲルを作るために、0.1％（w / v）のCMC + 12％（重量/体積をもたらすを10mlのSDS-PAGEゲル混合液に1mlの水1.5％CMC 1mlの置き換え）SDS-PAGEゲルミックス。通常のゲルを注ぐ。注意：元の溶液中のCMCが完全に40℃（前ゲル溶液を調製する直接繰り返す）に攪拌および加熱の組み合わせにより溶解していることを確認してください。
3. 確立された方法¹²に従って、SDSの存在下で沸騰させることにより、サンプルを変性させる。陽性対照として、T.から市販のセルラーゼ混合物の1:500希釈を使用このようなTとしてデルマレー 、 デルマレー ATCC 26921。ネガティブコントロールとして非浸潤葉（NTEPs）から同様に調製したタンパク質溶液を使用しています。
4. 通常のプロトコル¹⁵に従って電気泳動を行って、例えば色素の先端がゲルの底に達すると停止し、電気泳動で〜50分間、200Vを使用しています。
5. 0.1％を用いたものSDS-PAGEゲルを染色（w / v）のクーマシーブリリアントブルー、メタノール/氷酢酸混合物を用いて脱色。注：ラピッド染色及び脱色を穏やかな染色を加熱し、10分後、脱色液を変え、温め（ただし沸騰）第染色をした後、脱色溶液で15秒〜マイクロ波を用いて、すなわち溶液を脱色することにより行うことができるとき、または冷却し、新たな脱色液を繰り返します。
6. 確立されたプロトコル^16,17を使用して1 SDS-PAGEゲルのウェスタンブロッティングを行う。 （二）アルカリホスファターゼに結合されたHisタグ（プライマリ）とポリクローナルヤギ抗ウサギ抗体Fc領域に対するポリクローナルウサギ抗体：以下の抗体を使用してください。注：二次抗体は、ニトロブルーテトラゾールを用いて可視化を可能にするために選択されるべきであるイウムchloride/5-bromo-4-chloro-3 ' - indolyphosphateのp-トルイジン塩（NBT / ^{BCIP）、18に}記載され^ているよう。
7. 1.5％ゲルをインキュベートすることによって0.15％（w / v）のCMC SDS-PAGEゲル上でリフォールディングゲル内のタンパク質を用いて室温でβ-シクロデキストリン、20mMのリン酸 - クエン酸緩衝液、pH 6.5（w / v）の実行穏やかな15分¹⁹振とう。
8. β-シクロデキストリンのソリューションを捨て、簡単に、H ₂ Oでゲルを洗うさらに15分間50mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.8）中で、室温でインキュベートする。 50℃で20分間、30 mM酢酸ナトリウム緩衝液pH4.8の中でゲルをインキュベートすることによってリフォールディング0.15％CMC SDS-PAGEゲルを用いてCMCザイモグラフィーを行う
9. 50℃で20分間、30 mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.8）中でゲルをインキュベートすることによってリフォールディングし、0.15％（w / v）のCMC SDS-PAGEゲルを用いてCMCザイモグラフィーを行う
10. 30分間、またはクリアバンドが1 MのNaを使用して観察されるまで、0.1％w / vコンゴーレッド溶液及び脱染を用いて10分間ゲルを染色CL。明確に画像化のための0.3％（v / v）の酢酸でゲルを洗浄する。

TrCel5Aの6。4-MUC活性アッセイ

1. 50％（v / v）メタノール中の10mM 4-MUCのストック溶液を調製し、RTで暗所に保管して
2. アッセイの直前に、1 mMの4-MUCさ60mm酢酸ナトリウム、pH 4.8で構成される4-MUC 2X作業溶液を、準備します。
3. （誘導的に発現の有無TrCel5Aなし）葉タンパク質100μlを、Tから100μlの市販のセルラーゼ混合物を含む試料に、このテストを実行するレセイ 1:1,000、および純粋なH ₂ Oであった。三重に各サンプルを実行します。
4. ピペット96ウェルプレートの各ウェルに4-MUC作業溶液100μlを、各試料100μlを加える。
5. 360nmの励起波長および465 nmの発光波長を用いて、蛍光分光法によって4-MU蛍光の0分の時点を決定します。
6. 20プレートをインキュベート50℃分間、蒸発を防ぐために接着剤の蓋で覆った。凍結（またはμlの0.15 Mグリシン、pHは10.0と、別々のプレートの試料100μlを100とを組み合わせることにより）により反応を停止します。
7. 360nmの励起波長および465 nmの発光波長を用いて、蛍光分光法によって4-MU蛍光のエンドポイントを決定します。蛍光値の変化を得るために、エンドポイント（20分）の時点から0分を差し引く。

TrCel5Aの7。アゾキシメチルセルロース活性アッセイ

1. 0.5 M、RTで保存する1.5％のストック（w / v）のアゾ-CMC、および18mMの酢酸亜鉛を含有する沈殿溶液を調製酢酸ナトリウム、pH 5〜80％エタノール（v / v）で、室温で保存温度。
2. アッセイの直前に、1％（H ₂ O中）（w / v）のアゾ-CMCおよび60mMの酢酸ナトリウム、pH 4.8からなるアゾ-CMC倍ワーキング溶液を調製。
3. 50μlのサンプルと仕事の50μLを組み合わせる1.5ミリリットルのチューブでソリューションをING。
4. （一時的に発現したかTrCel5Aなし）葉タンパク質の50μLを含有する試験サンプル; T.から市販のセルラーゼ混合物100μl デルマレーは 1:1,000に希釈した。そして、純粋なH ₂ O三重でサンプルおよび標準を実行します。
5. 50℃で20分間、サンプルをインキュベート沈殿溶液を250μlを添加して反応を停止させます。溶液が完全に混合したことを確認するために10秒間激しくボルテックス各サンプルを。
6. 室温で10分間サンプルをインキュベートし、再度ボルテックスする。 10分間1,000×gでの遠心分離のサンプル。ペレットを破壊しないように注意しながら、96ウェルプレートに各サンプルの上清を200μlを削除します。
7. 590nmの波長で吸光度分光法を用いてアッセイ。

TrCel5Aの8。PAHBAHアッセイ

1. ろ紙円（〜5.5ミリメートル径）をカットして穴パンチを使用してください。 100μlの60 mMののNaAc、pHは4.8、および1を追加サンプル（誘導的に発現の有無TrCel5Aなしで）の葉のタンパク質を含むいずれか、または商業Tの00μL リーゼイのセルラーゼ混合物は、1:1,000に希釈し、300rpmで振盪しながら50℃で20時間濾紙丸でインキュベートする。濾紙とインキュベートし、各試料について、個々のサンプルを対照として濾紙なし重複溶液をインキュベートする。
2. RTで5 100mlの溶液を、合計濃HCl溶液、およびストアを添加してH ₂ Oに溶解することによってPAHBAH 330 mMのパラヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（PAHBAH）溶液Aを調製。注：最良の結果は、H ₂ Oで100mlとする量を加える前に、溶解を助けるために温度下で撹拌PAHBAHスラリー、 すなわち 30ミリリットル、より小さな体積にHClを添加することによって達成される
3. RTでの50 mMクエン酸ナトリウム、10mMの塩化カルシウム、および500mM NaOHおよびストアを含む、PAHBAH溶液Bを調製する。
4. IMMEDiatelyアッセイの前に、使用するまで（4時間以内に使用する）氷上9ミリリットルの緩衝溶液、ストアに1ミリリットルのPAHBAH試薬の1.5倍の作業溶液を調製する。
5. 耐熱性0.2または0.5 mlチューブ内のサンプルを準備します。フィルターペーパー（ステップ8.1）、H ₂ Oを45μLとPAHBAH作業溶液100μlとインキュベートし、各溶液5μlを兼ね備えています。サンプルコントロール（フィルターペーパーなしでインキュベートしたサンプル）は、同じ濃度（5μlのサンプル、45μlのH ₂ O、100μlのPAHBAH使用液）の下で実行する必要があります。また、0〜0.2gのグルコース/ Lを含有する5規格（5μl）を、純H ₂ Oをテストする三重でサンプルおよび標準を実行します。
6. 正確に10分間RTで冷却し、次いで、100℃で正確に10分間、サンプルをインキュベートする。波長410nmで96ウェルプレートおよびアッセイ分光ピペットソリューションを提供しています。最終的な取得するためのサンプルから（フィルターペーパーなしでインキュベート）個々のサンプル·コントロールを引く値。

結果

TrCel5AとTrCel5A-mCherryを、一過性発現系（ 図1Aおよび1B）を用いてタバコ植物において首尾よく発現された。 TrCel5A-mCherry融合タンパク質の発現パターンの検査は、健康な葉の緑色光（ 図1D）の下で広範なタンパク質の発現を示した（ 図1C）を 、明らかにした。

総可溶性タンパク質の抽出を一過TrCel5Aタンパク質を発現させ、SDS-PAGEは、タンパク質の多種多様を示した葉を含有していたタバコ植物で行った本であった（ 図2A、レーン1）。植物およびNTEPsに由来する全可溶性タンパク質サンプルを発現TrCel5Aからの全可溶性タンパク質サンプルを、55℃で10分間インキュベートした。他の多くの（ネイティブタバコ）タンパク質は、この温度で​​安定していないながらTrCel5Aは55℃で安定しており、アクティブな状態を維持します。このように、多くの非ess​​entiアルタンパク...

ディスカッション

セルラーゼの組換え発現は、より効率的なバイオ燃料生産システム¹のための欲求に、大きな関心の分野である。植物は、このような経済的な収穫技術や、大規模なバイオ燃料生産のための非常に望ましい特性であること自己加水分解法などの機能により、成功したセルラーゼの生産のための多くの可能性を提供します。また、タンパク質を産生するための別のローカリゼーションを使用することは、必要であれば、翻訳後修飾^を可能にする^20。明らかな利点を提供しながら、セルラーゼの構成的発現を可能にするために、植物を変更するか、成功しない可能性があり、時間がかかる方法である。このような発現されたタンパク質や誘導性発現メカニズムの隔離のような技術は、植物に成功したセルラーゼの生産の可能性を高めるが、これらはまだ確立に何カ月もかかる。ここでは、一過性発現法は、特定のセルラーゼの可能性を例示するために、実証される数日のうち以内に植物系を経て製造される。

蛍光タンパク質mCherryとの融合は、一過性のタンパク質...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4-メチルウンベリフェリル &β;-D-セロビオシド	SIGMA-ALDRICH	M6018
酢酸	ROTH	3738
アセトシリンゴン (濃縮)	ROTH	6003
抗生物質 - カナマイシン	ROTH	T832
抗生物質 - リファンピシン	ROTH	4163
抗生物質 - カルベニシリン	ROTH	6344
抗体 - rabbit anti His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
抗体 - ヤギ anti rabbit AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
Azo-carboxymethyl セルロース	MEGAZYME	S-ACMC
β-cyclodextrin	SIGMA-ALDRICH	C4805
塩化カルシウム二水和物	SIGMA-ALDRICH	C5080
カルボキシメチルセルロース	ROTH	3333.1
セルラーゼ Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
コンゴレッド	SIGMA-ALDRICH	75768
クーマシーブリリアントブルー G 250	ROTH	9598.2
D(+)-グルコース	ROTH	8337
エタノール	ROTH	K928
濾紙 - Rotilabo あぶらとり紙	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
MES バッファー	ROTH	4256
メタノール	ROTH	8388
クエン酸ナトリウム	ROTH	3580
ドデシル硫酸ナトリウム	SERVA	20765
水酸化ナトリウム	ROTH	6771
土壌、Einheitserde classic	PATZER GMBH
分光計 - Infinite M200	TECAN
ショ糖	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-ヒドロキシベンズヒドラジド	SIGMA-ALDRICH	H9882
リン酸緩衝生理食塩水	ROTH	1058
UV 光源 - BLAK RAY	UVP
Vibratome - VT1000S	Leica