マウスにおける同種のCD4 T細胞応答を研究する尾皮膚の移植

サマリー

尾皮膚移植は、マウスの同種免疫応答中のT細胞依存性拒絶反応と耐性誘導を研究するための強力なモデルです。このプロトコルの利点は、軽度の侵襲的手術と、レシピエントマウスを犠牲にすることなくモニタリングが容易になることです。

要約

T細胞の応答とその結果の研究は、ドナーT細胞と宿主T細胞を区別し、移植片を容易に監視し、異なる免疫学的質問に答えるためにシステムを適応させることを可能にするモデルを必要とします。Medawarらは、1955年にマウスにおける同種尾皮移植を確立しました。それ以来、皮膚移植モデルは、特定の質問に答えるために継続的に修正され、適応されてきました。テールスキンの使用により、このモデルは移植片拒絶反応のスコアリングが容易になり、広範な準備も深い麻酔も必要とせず、すべての遺伝的背景の動物に適用でき、虚血性壊死を阻止し、化学的および生物学的介入を可能にします。

一般的に、CD4⁺とCD8⁺の同種T細胞の両方が、異なるマウス系統からの不一致の主要な組織適合抗原を認識するため、同種移植片の拒絶に関与しています。皮膚移植マウスにおける同種T細胞の活性化について、いくつかのモデルが報告されています。C57BL/6マウスを含むさまざまなマウス系統における主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIおよびII分子の同定は、T細胞媒介性同種応答の理解と研究に向けた重要なステップでした。ここで説明する尾部皮膚移植モデルでは、MHCクラスII(I-A^b)分子の抗原提示グルーブにある3点変異(I-A^bm12)は、C57BL/6マウスで強力な同種CD4⁺ T細胞の活性化を誘導するのに十分です。C57BL/6マウス上のI-A^bm12マウスからの皮膚移植片は12〜15日以内に拒絶されますが、同系移植片は最大100日間受け入れられます。T細胞(CD3^-/-およびRag2^-/-マウス)の不在により、皮膚移植片の受け入れは最大100日間可能であり、これは2 x 10⁴野生型またはトランスジェニックT細胞を移植することで克服できます。養子移植されたT細胞は増殖し、I-A^bm12移植されたRag2^-/-マウスでIFN-γを産生します。

概要

このような皮膚、心臓、腎臓などの固形臓器の移植は現在、世界の医療行為¹の標準的な手順である。正常に移植された臓器は、ドナーの主要組織適合性抗原を認識するレシピエントの免疫系の活性化によって拒絶することができる。このため、移植患者は免疫抑制剤²を用いた治療を必要としています。マウスでの同種皮膚移植は1955年にメダウォアらによって設立され、後に主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIおよびIIとして記述対象となる分子を同定するために有用だった。それ以来、皮膚移植モデルを連続的に変更され、T細胞サブセットの役割および移植片拒絶^2-4を抑制するのに化学的および生物学的介入の関連性を研究するために適合されている。耳とトランクから肌を準備するのがより困難であると尾の皮膚⁵よりも低酸素症や壊死を受けやすい。しかし、移植手順は同様である。また尾の皮膚移植のモニタリングは、皮膚の特徴的な髪の質感が容易です。

この記事では、CD4 ⁺ T細胞媒介同種移植片拒絶およびマウスにおける寛容の様々な側面の研究を可能にし、MHCクラスIIミスマッチ尾皮膚移植のための詳細な手順を提供します。 （IA ^BM12と呼ばれる）MHCクラスII分子IA b ^は6-9の天然の三点突然変異は、C57BL / 6マウス⁸における皮膚同種移植片の拒絶反応を誘導するのに十分である。 IAの^BM12分子は、種々のαβ-T細胞受容体Vα2Vβ8-TCR特異的T細胞は、TCR-トランスジェニックマウス^10を生成するために、同定され、そのうちC57BL / 6マウスからの（TCR）の鎖を用いてCD4 ⁺ T細胞を活性化する。 Vα2Vβ8-TCR特異的T細胞の養子移入は、免疫不全C57Bに拒絶モデルを確立するために使用されているL / 6 RAG2 ^{- / -} IA ^BM12皮膚を移植したマウス。

ドナーとレシピエント間の遺伝的差異は、移植受容と拒絶の結果に影響を与える。移植の異なる種類があります。自家移植は、レシピエント個体自体からの移植である。 syngraftsおよび同種移植片は、それぞれ遺伝的に同一と遺伝的に無関係な個人からの移植である。別の同種臓器移植の受け入れは、患者とマウスモデル^11,3,4における化学的および生物学的介入によって実証されている。基本的なアプローチでは、抗CD3抗体で処理したC57BL / 6マウスIA ^BM12尾皮膚（未発表データ）の生存期間の延長を示した。レシピエントマウスにおける移植の前にCD4 ⁺およびCD8 ⁺ T細胞の枯渇は、MHCクラスIおよびIIミスマッチ移植片^（12改訂）の受入れをもたらした。興味深いことに、皮膚移植片の拒絶反応は、CD4 ⁺の存在に依存する T細胞^（12牧師）。このモデルでは、調節性T細胞と抗体または抑制との共刺激分子を遮断することによって、異なる免疫細胞間の特異的相互作用を標的とする（未発表データ）寛容を誘導し得る。実際、CD40およびCD28の両方を遮断することは、長期的な皮膚同種移植片寛容^13,14につながった。

尾の皮膚移植は他の臓器の移植に比べて実行​​が容易であり、監視が容易です。また、尾の皮膚移植は、調製が容易であり、他の皮膚組織よりも虚血を受けにくい。注入された麻酔薬とは対照的に、移植時の麻酔ガス（イソフルラン）の使用は、プロシージャおよび受信者の回復時間の両方を短縮します。不完全な創傷治癒および移植片拒絶につながる可能性尾皮膚移植のカールは、組織接着剤の適用によって防止される。さらに、IA ^BM12尾皮膚移植モデルでは、排他的に、CD4を活性化させる ^{+（同じ遺伝的背景の）免疫応答性および免疫不全マウスの両方においてT細胞は、結果の解釈を容易にする。}

このプロトコルは、化学的、生物学的な介入を可能にし、信頼性の高い再現性があり、容易に監視マウスモデルを説明しています。モデルは、尾の皮膚移植の拒絶と寛容の誘導を調査対象としています。

プロトコル

このビデオ出版物およびプロトコルでは、すべての動物の手順はカントン当局バーゼルシュタット、スイスで承認された動物プロトコルに従って行った。可能な限り無菌状態ですべての手順を実行します。

外科1。準備

1. 使用前にすべての手術器具やガーゼをオートクレーブ。
2. 暖かいパッドを加熱して、テーブル（ 材料/方法の表 ）に手術器具を整理します。
3. 指ストリップ包帯を開きます。 （ガーゼが完全に覆われていることを確認してください）​​綿棒で創傷パッドの上にワセリンを適用します。
4. マウスの重さおよび鎮痛ブプレノルフィン0.05 mg / kg体重を管理します。注意：これはすぐに移植後鎮痛を提供します。

移植のためのテール皮膚の2。準備

1. CO ₂窒息とDあたりのドナーマウス（ 例えば、IA ^BM12）を安楽死させる切除する前に消毒液で尾をisinfect。
2. きれいなプラスチック板に黒のストライプを下にして尾を置き、中央のライン全体で縦にカットし、スキン層のみが関与する表面的な切開を行う。
3. 把持鉗子を使用して、尾から肌をやってのける。
4. 10ミリリットルのHBSSで満たされた10cmの細胞培養皿の中で尾の皮膚を置く。

3。外科的手技

1. 透明インダクションボックスの3％イソフルラン溶液を吸入によってレシピエントマウス（ 例えば、C57BL / 6）を麻酔。注意：マウスは、手術平面麻酔を達成することは3〜5分かかります。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
2. 暖かいパッドの上にマウスを置き、つま先をつまんで、各動物レフ口マスクとロバを経由して1.5％イソフルランを適用します。
3. レシピエントマウスの背側部位（ 例えば、C57BL / 6）を剃るとドライガーゼSWを使用して、汚染の毛を取り除くAB。
4. 無菌性溶液で剃毛移植部位を消毒。
5. 背の右/中央のサイトにある鉗子で皮膚をつまんで、約1×0.6cmの円形の切開を作るために湾曲したハサミを使用しています。
6. 出血が発生した場合は、その後、滅菌綿棒で傷口をきれいに。
7. 切開の大きさを評価し、メスを用いて尾部皮膚から推定サイズの移植をカット。
8. 移植を丸めるコーナーをトリム。
9. 滅菌綿棒で、メス、HBSSの乾燥過剰に移植をロードし、レシピエントマウスの移植床に置きます。
10. ドナーとホストの皮膚の重複を回避し、独占的に接触領域に組織接着剤を適用します。
11. マウスの腰の周りにしわなしに石膏を適用します。
12. （3ミリメートルシフト）は、マウスに石膏を固定するための接着剤の非弾性包帯を適用します。
13. 包帯の上腹、サイト内の3ミリメートル程度ハサミで切開する。注：これは、trのを回避することである回復期のマウスの歯のapping。
14. 麻酔から口にマスクを外し、目を覚ましまで加熱パッド上に移植されたマウスを保持します。
15. 完全に回復した場合にのみケージに移植されたマウスを戻し、包帯がきつすぎるではないことを確実にするために彼らの移動性を評価します。
16. 次の手術に進む前に70％エタノールですべての手術器具を滅菌する。

4。術後ケア

1. 飲料水（4 mg / ml）をにパラセタモール含有シロップを追加し、7日のためにそれを管理します。
2. それが回復した後、動物の部屋にマウスを返します。
3. 密接に包帯が所定の位置にある時間（1週間）のために、うつ病やその他の行動の変化（食事や不動）、異常な外観（グルーミングの欠如）や姿勢（PILO - 勃起や猫背の姿勢）を含む臨床兆候をマウスを監視します。

5。包帯除去（6-7日後の移植）

1. Anes透明インダクションボックスの3％イソフルオラン液​​の吸入によるthetizeマウス（上記参照）。
2. 動脈ハサミで包帯や絆創膏をカットし、慎重にそれらを削除します。注：移植部位の伸縮を避ける。
3. 臨床徴候のために移植されたマウスを監視する（4.3参照）、皮膚移植片（ 表1）の拒絶のために得点。注：グラフ、スコアシステムは、背の皮膚に比べて尾部皮膚に異なる髪のテクスチャを利用しています。移植とその拒絶反応の出現は3等級に分類されている。 C57BL / 6免疫応答性マウスの同種皮膚（MHC IIの不一致、 例えば、アイオワ^BM12）移植片は、通常12から15日後に移植（自分のデータと^{、15〜20）}内で拒否されます。

結果

最初のアプローチで、C57BL / 6マウスのIA ^BM12同種移植片およびIA ^B型syngraftsを移植した。包帯除去後の、C57BL / 6マウス（ 図1A）における接触ゾーンの閉鎖せずに移植片、創傷治癒の徴候をマニフェスト。 syngraftsながら包帯を除去した後、CD4 ⁺ T細胞媒介炎症は、移植後13日以内に、C57BL / 6マウス（キャラクターいっぱい図1B-C）で壊死領域（赤い斑点）の外観およびIAの^BM12の同種移植片の拒絶反応につながった最大100日間（ 図1B-C、白抜きの記号）のために許容された。これらのデータは、免疫応答性C57BL / 6マウスにおけるIAの^BM12移植片^の急性拒絶反応の進行を示している。

種々の研究は、MHCクラスIIミスマッチ尾の皮膚の拒絶反応が同種異系CD4 ⁺ T細胞

ディスカッション

皮膚移植拒絶反応およびT細胞依存耐性を研究するために広く用いられる方法である。皮膚移植モデルが確立されて以来、いくつかの適応および変更が適用されている。記載された手順では、IA ^BM12尾の皮膚移植が麻酔ガス（イソフルラン）を用いて行われる。ガス麻酔を使用すると、移植されたマウスへのストレスを減少させる実行し、マウスの回復の時間が短縮されます。手順は、耳や背皮膚組織よりも多くをカールする傾向がある、尾の皮膚を修正するために組織接着剤を採用しています。しかもこれがカーリングを軽減し、背側切除部位での尾の皮膚の位置を向上させるようにエッジを切断し、トリミング前の尾の皮膚を平らにすることが重要です。

移植片拒絶または受諾を評価するためには、TRAの得点を容易にするために、移植片の中央に（C57BL / 6マウスでは、例えば ）ブラックストライプと尾の皮膚を準備するために必要である髪質の違いに基づいてnsplants。

MHCクラスIIのIA ^BM12分子の変異は、排他的...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ベタジン標準液	Mundipharma
綿棒	Carl Roth GmbH	31025060
Dafalgan , UPSA	Bristol Myers Squibb UPSA
Hansaplast finger strips	Beierdorf	AG REF.76861
Histoacryl tissue adhesive	Braun	REF.1050052
Leukotape classic , 2 cm x10 m	BSN Medical	SAS REF.02204-00
PBS、リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4	Invitrogen	10010015	GIBCO
滅菌ガーゼ、5 x 5 cm、8 ply	MaiMed GmbH	21010
ナローパターン鉗子	FST	11003-12
ファインアイリスシザーカーブ	FST	14095-11
ファインアイリスハサミ	FST	14094-11
メイヨーはさみ	FST	14010-15
動脈はさみボールチップ11.5	cm FST	14080-11
鉗子	FST	11021-14
用ブレードNo.20	Swann-Morton LTD	3006	炭素鋼
外科用ブレードハンドル	Swann-Morton LTD
シリンジ、1 ml	ARTSANA		ディスポーザブル
テムゲシック、ブプレノルフィン	ESSEX Chemie AG		0.3 mg/ml
組織培養皿 10 cm、60.1 cm2	TPP
ワセリン	Vifor SA
ウォームパッド	ソリス		タイプ 223

組織外科