分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

サマリー

このプロトコルで説明した3次元培養法は、分枝状の臓器へのそれらの大幅な拡大、分化および形態形成などの分散したマウス胎児の膵臓前駆細胞から膵臓の発達を再現。この方法は、画像化、ニッチの機能的干渉や操作に適している。

要約

膵臓は、グルコースの恒常性を調節し、消化酵素を分泌する必須の器官です。膵臓の胚形成に関する研究は、^幹細胞1から膵臓細胞を作製するプロトコールの開発につながっています。胚器官全体は、発生の複数の段階で培養することができます^2-4。これらの培養法は、薬剤の試験や発生過程の画像化に役立っています。しかし、臓器の拡張は非常に限られており、臓器が平らになるため、形態形成は忠実に再現されていません。

私たちは、解離したマウス胚性膵臓前駆細胞の効率的な拡大を可能にする3次元(3D)培養条件を提案します。培地の組成を操作することにより、主に初期状態で拡大する膵臓前駆細胞で構成される中空球、またはより成熟した拡大前駆細胞に進行し、内分泌細胞、腺房細胞、および管細胞に分化し、胚性膵臓に似せて自発的に自己組織化する複雑なオルガノイドを生成することが可能です。

ここでは、インビトロプロセスが自然な膵臓の発達の多くの側面を再現していることを示しています。この培養システムは、細胞が協力して臓器を形成する方法を調べるのに適しています。これにより、初期の複雑さを数個の前駆細胞に減らすことができます。これは、膵臓の3D構造を再現するモデルであり、したがって、上皮構造の分極や分岐などの形態形成の研究に役立ちます。また、剛性や細胞のテンセグリティへの影響など、ニッチの機械的な手がかりに対する応答を評価することも適切です。

概要

器官培養は複雑であるが、生体内の調査で非常に関連性の高い細胞株モデルの便利なが、おおよそのシミュレーション間のギャップを橋渡しする有用なモデルを提供しています。内分泌および外分泌細胞を模擬した形質転換された細胞株が存在するが、膵臓例では、膵臓の前駆細胞と完全に同等のない細胞株ではありません。大人の膵臓全体を培養することができません。単離された内分泌膵島は数時間⁵ インビトロで維持することができる細胞増殖および組織切片なしで、数週間維持することができる。胚性膵臓培養物は、広くその発達を研究するためだけに使用されているだけでなく、上皮間葉相互作用^4,6,7を調査するために、画像に^8を処理または化学的にそれらと^9を妨害する。二つの器官培養法が主に使用されます。最初は都合のですフィブロネクチンコーティングしたプレート^2、上の膵臓芽を培養することにある画像化目的のためにnient;二つ目のオプションは文化に最も形態形成を保持する気液界面^3,4でフィルタの臓器です。非常に有用であるが、これらの方法は、ある程度の平坦化をもたらす;前駆細胞の拡大は非常に正常な発達および出発集団は、膵臓細胞および間葉細胞の全ての種類を含む複合体であると比べて制限される。

文化への能力と分散初代細胞を拡大し、系....

プロトコル

このプロトコルは、マウスE10.5から派生した膵臓オルガノイドが上皮膵臓細胞を解離した成長を目指しています。

プロトコルは、動物実験のための倫理的な承認を必要とする。

E10.5マウス胚から背膵芽の1。解剖

1. ハサミで腹部を開き、胎生（E）10.5で時限妊娠マウスを犠牲に、2子宮角を削除し、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、またはダルベッコで満たされた10センチメートルペトリ皿に置いて修正必須培地（DMEM）は氷上に保持。細胞播種の犠牲からの全実験は、細胞の損傷を防ぐために60〜90分間で行われる。
2. 小さなハサミを使用して個々の胚のセグメントに子宮を分離する。冷PBSで35ミリメートルペトリ皿に1胚を移し、上からの照明で解剖顕微鏡下でそれを視覚化する。解剖ピンセットで周囲の筋肉、脱落膜と卵黄のSAを削除Cおよび胚を公開します。背中冷たいDMEM培地に胚を置きます。胚は容易に3ミリリットルのプラスチックトランスファーピペット/スポイトを使用して転送することができる。続行する前に、同様の方法で、すべての個々の胚を分離します。
3. PBS中できれいな35ミリメートルペトリ皿に胚を置きます。
   1. 前肢を削除するために、薄い鉗子（0.05ミリメートル幅）を使用してください。優しく脊髄領域（ 図1）からの消化管を分離するために開口部に鉗....

結果

3Dマトリゲルで解離し、播種E10.5の背側膵臓前駆細胞は、膵臓の発達を再現。前駆細胞は、最も容易に蛍光リポーターで追跡することができる。我々のケースでは（ 図2）NEUROG3 ^4を活性化することなく、タモキシフェンの非存在下では、したがって、Pdx1のプロモーター（、PDX1のNgn3-ER ^{TM-nGFP）（}動画1）によって制御された核GFPタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを使用していました。

オルガノイド培地で、細胞の小さなクラスターの初期圧縮は、最初の数時間で起こる。拡張は、最初の4日間でのクラスターの拡大（ 図2A）によって検出することができる。 5日目から、枝は20％、最大オルガノイドに形成している。単一細胞を拡張し、大規模なクラスタがPdx1の式 ^28を保持^しながらのPdx1発現を失うことはありません。

ディスカッション

インビトロにおける機能的β細胞の大規模生産は依然として¹無効である。このような厳しい状況では、発生生物学の研究で​​は、機能的なβ細胞の分化に必要とされる正確な信号を解読するに役立つことがあります。このプロトコルは、in vitroでの胚性膵臓前駆細胞の維持、拡大と差別化が可能になります。これは、他の内分泌ホルモンを共発現しないインスリン産生β細胞の形成を含む、Pdx1の高レベルのインスリン成熟し、処理インスリン^28を有するプロコンバターゼを発現している。システム内の重要な鍵となる要因は、Y-27632によって経路だけでなく、ROCK阻害FGFシグナルの活性（外因的ヘパリンによって増強追加FGFによって刺激）とNotch（内因性）である：いいえ、それらの因子の非存在下で、または非常にオルガノイドと球の限られた数が^28を生成した。 FGFおよびNotための要件CHの活動を簡単に、生体内²⁸での膵臓の開発のための重要性に基づいて理解されている。 ROCK阻害剤は、従って、解離時にマイクロフィラメント.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ペニシリン-ストレプトマイシン	Gibco	15070-063	在庫は-20°Cに保たれています。C
ノックアウト セラム リプレイス (サプリメント)	Gibco	10828-028	ストックは -20 °C に保たれています。C
2-メルカプトエタノール	Sigma Aldrich	3148-25ML	ストックは4°Cに保たれています。C
ホルボールミリスチン酸酢酸 (PMA)	Calbiotech	524400-1MG	ストックは-20°Cに保たれています。C
Y-27632 (ROCK阻害剤)	Sigma Aldrich	ab120129	在庫は-20°Cに保たれています。安定性/ソースは、頻繁に問題の原因となります。
EGF	Sigma Aldrich	E9644-2MG	ストックは-80°Cに保たれています。C
組換えヒト R-spondin 1	R&D	4645-RS-025/CF	在庫は-80°Cに保たれています。C
組換えマウス R-spondin 1	R&D	3474-RS-050	在庫は-80°Cに保たれています。C
組換えヒトFGF1(aFGF)	R&D	232-FA-025	在庫は-80°Cに保たれています。C - ベータ細胞産生を増加させるために、
ヘパリン(リクミン)	Drossapharm		4°Cに保たせません。C
組換えヒト FGF10	R&D	345-FG-025	在庫は-80°Cに保たれています。C
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
ペニシリン-ストレプトマイシン	Gibco	15070-063	在庫は-20°Cに保たれています。C
B27 x50 (supplement)	Gibco	17504-044	ストックは-20°Cに保たれています。C
組換えヒトFGF2(bFGF)	R&D	233-FB-025	ストックは-80°Cに保たれています。C
マトリゲル	コーニング	356231	ストックは-20°Cに保たれています。C
トリプシン 0.05%	Gibco	25300-054	在庫は 4 度に保たれています。C
RNAlater - RNA安定化試薬	Qiagen	76104	RT
Dispase	シグマ アルドリッチ	D4818-2MG	使用濃度: 1.25 mg/ml. ストックは -20 °C に保たれています。
C BSA 再構成用	Milipore	81-068	サイトカインの再構成用  - ストックは -20 °C に保たれています。C
子牛胎児血清 (FCS)	Gibco	16141079	Stock kept at -20 >C
60ウェルマイクロウェルトレイ	Sigma Aldrich	M0815-100EA
4ウェルプレート	Thermo Scientific	176740
95ウェルプレート Fボトム	Greiner Bio	6555180
Glas ボトムプレート	Ibidi	81158
ディスポーザブルガラスマイクロピペット	Blaubrand	708745
顕微鏡			Cell® 浜松市オルカER製B7WカメラとLudin Cube、Boxを搭載したイメージングステーション(電動倒立型オリンパスIX81スタンド) Leica DMI6000 Bスタンドは、Leica DFC365 FXカメラとAF6000 Expert/Matrixソフトウェアコマンドインターフェースを備えたLudin CubeとBoxに囲まれています。
目的、			UPLAN FL、NA 0.30、空気、9.50 mm、10X、長距離; ライカ HC PL FLUOTAR NA 0.30 空気 11.0 mm 10X 長距離

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