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方法論記事

分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

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DOI:

10.3791/51725

⸱

2014年7月19日

 ,  ,  , 
1Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, School of Life Sciences, Swiss Institute for Experimental Cancer Research, 2DanStem, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルで説明した3次元培養法は、分枝状の臓器へのそれらの大幅な拡大、分化および形態形成などの分散したマウス胎児の膵臓前駆細胞から膵臓の発達を再現。この方法は、画像化、ニッチの機能的干渉や操作に適している。

要約

膵臓は、グルコースの恒常性を調節し、消化酵素を分泌する必須の器官です。膵臓の胚形成に関する研究は、幹細胞1から膵臓細胞を作製するプロトコールの開発につながっています。胚器官全体は、発生の複数の段階で培養することができます2-4。これらの培養法は、薬剤の試験や発生過程の画像化に役立っています。しかし、臓器の拡張は非常に限られており、臓器が平らになるため、形態形成は忠実に再現されていません。

私たちは、解離したマウス胚性膵臓前駆細胞の効率的な拡大を可能にする3次元(3D)培養条件を提案します。培地の組成を操作することにより、主に初期状態で拡大する膵臓前駆細胞で構成される中空球、またはより成熟した拡大前駆細胞に進行し、内分泌細胞、腺房細胞、および管細胞に分化し、胚性膵臓に似せて自発的に自己組織化する複雑なオルガノイドを生成することが可能です。

ここでは、インビトロプロセスが自然な膵臓の発達の多くの側面を再現していることを示しています。この培養システムは、細胞が協力して臓器を形成する方法を調べるのに適しています。これにより、初期の複雑さを数個の前駆細胞に減らすことができます。これは、膵臓の3D構造を再現するモデルであり、したがって、上皮構造の分極や分岐などの形態形成の研究に役立ちます。また、剛性や細胞のテンセグリティへの影響など、ニッチの機械的な手がかりに対する応答を評価することも適切です。

概要

器官培養は複雑であるが、生体内の調査で非常に関連性の高い細胞株モデルの便利なが、おおよそのシミュレーション間のギャップを橋渡しする有用なモデルを提供しています。内分泌および外分泌細胞を模擬した形質転換された細胞株が存在するが、膵臓例では、膵臓の前駆細胞と完全に同等のない細胞株ではありません。大人の膵臓全体を培養することができません。単離された内分泌膵島は数時間5 インビトロで維持することができる細胞増殖および組織切片なしで、数週間維持することができる。胚性膵臓培養物は、広くその発達を研究するためだけに使用されているだけでなく、上皮間葉相互作用4,6,7を調査するために、画像に8を処理または化学的にそれらと9を妨害する。二つの器官培養法が主に使用されます。最初は都合のですフィブロネクチンコーティングしたプレート2、上の膵臓芽を培養することにある画像化目的のためにnient;二つ目のオプションは文化に最も形態形成を保持する気液界面3,4でフィルタの臓器です。非常に有用であるが、これらの方法は、ある程度の平坦化をもたらす;前駆細胞の拡大は非常に正常な発達および出発集団は、膵臓細胞および間葉細胞の全ての種類を含む複合体であると比べて制限される。

文化への能力と分散初代細胞を拡大し、系統関係を研究し、単離された細胞のタイプ10の固有の特性を明らかに価値がある。杉山ら 11膵臓前駆細胞およびフィーダー層上の文化の中で3〜5日間いくつかの機能の文字を保持する内分泌前駆細胞を維持することができます。ニューロスフェア12と13のマンモスフィアに似Pancreatospheresは、成人の島および前駆細胞/幹細胞の性質であるが管細胞から展開されてきたこれらの球体を生成することをすることは明らかではない。また、生理的発達とは対照的に、pancreatospheresは、いくつかのニューロンの14,15を含んでいた。球はまた、最近、胚性膵臓前駆細胞16,17と良好な前駆細胞の拡大とそれに続く分化と膵臓18回生から生じたが、形態形成を再現できなかったし。

小型化された臓器に自己組織化分散させ、多くの場合、定義された細胞からの3Dモデルは、最近、繁栄し、そのような腸19,20、胃21、肝臓22、前立腺23、気管などの複数の器官の発達、大人の離職率をシミュレートしている24。光学カップ25、小腸26または脳27の場合のように、いくつかの例では、形態形成の発達および分化は、ES細胞から3Dにで要約されている。

ここでは、DES彼らは差別化と自己組織化することができる3Dマトリゲル足場に解離した多能性膵臓前駆細胞を拡大する方法をcribe。

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プロトコル

このプロトコルは、マウスE10.5から派生した膵臓オルガノイドが上皮膵臓細胞を解離した成長を目指しています。

プロトコルは、動物実験のための倫理的な承認を必要とする。

E10.5マウス胚から背膵芽の1。解剖

  1. ハサミで腹部を開き、胎生（E）10.5で時限妊娠マウスを犠牲に、2子宮角を削除し、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、またはダルベッコで満たされた10センチメートルペトリ皿に置いて修正必須培地（DMEM）は氷上に保持。細胞播種の犠牲からの全実験は、細胞の損傷を防ぐために60〜90分間で行われる。
  2. 小さなハサミを使用して個々の胚のセグメントに子宮を分離する。冷PBSで35ミリメートルペトリ皿に1胚を移し、上からの照明で解剖顕微鏡下でそれを視覚化する。解剖ピンセットで周囲の筋肉、脱落膜と卵黄のSAを削除Cおよび胚を公開します。背中冷たいDMEM培地に胚を置きます。胚は容易に3ミリリットルのプラスチックトランスファーピペット/スポイトを使用して転送することができる。続行する前に、同様の方法で、すべての個々の胚を分離します。
  3. PBS中できれいな35ミリメートルペトリ皿に胚を置きます。
    1. 前肢を削除するために、薄い鉗子（0.05ミリメートル幅）を使用してください。優しく脊髄領域（ 図1）からの消化管を分離するために開口部に鉗子を挿入します。オプション：より便利に、胃を参照してください下に卵黄茎下の心臓や尾部に、胚の上半身を削除するには。
    2. 胃、肝臓と腸の位置を確認します。鉗子を使用すると、胃から小腸への消化管に分離した（ 図1）氷の上に冷たいDMEM中に入れてください。背側膵臓芽は、胃への後方（ 図1）、背側に取り付けられている。
    3. シミのすべての個々の消化管を隔離続行する前にLAR方法。胚が遺伝子型を決定する必要がある場合には、解剖時に尾を収集し、氷上で冷たいDMEMで24ウェルプレート中の異なるウェル内のすべての個々の消化管を保つ。
  4. 冷PBS中できれいな35ミリメートルペトリ皿に1消化管を配置します。今解剖顕微鏡下で背側膵臓芽を視覚化して分析する明視野で下から照明を使用しています。これらの条件はボリュームの可視化を最適化します。電解的にシャープタングステン針または20gの注射針を使用して、上皮の周り可能な限り少ない間充織（ 図1）と膵臓芽を分離します。
    1. 2〜3分間冷たいディスパーゼ溶液（1.25ミリグラム/ ml）を含むペトリ皿に孤立した芽を転送します。この時点から、移動が最も便利に口の制御、フレキシブルチューブに付着した難引っ張っ50μlのガラスキャピラリーで行うことができます。代わりに、より多くのRIと芽を失うSK、適切なプラスチックのヒントを10μlの自動ピペット（ピペットマン）を使用します。
    2. 微視的な制御の下で膵臓芽の吸引と排出を行う。バックPBS中の膵臓芽を置く。さらにガラスキャピラリー（ 図1）を使用して、針と穏やかな吸引との間葉から分離された膵臓の芽を清掃してください。
    3. 全体間充織が除去されると、冷PBS中で膵臓芽をすすぐ。個々のウェル（冷DMEM中の10μLで満たされた60ウェルミニトレー）冷DMEM中に各芽を移す。それは組織が非常に粘着性になり、これディスパーゼで間充織を削除しないことが重要です。

分散した細胞の2。メッキと文化

  1. 洗浄に10μlのPBSで満たし60ウェルミニトレーの円錐形のウェルに難引っ張らガラスキャピラリーを持つすべての胚から解剖上皮を転送します。
    1. トリプシン0.05％Aを10μlに芽を移すNDそれは4分間、37℃でインキュベートしてみましょう。 10μlのDMEM + 10％ウシ胎児血清（FCS）でウェルに芽を転送することによりトリプシンを不活性化する。
    2. ピペットプラーで引っ張ら細い毛細血管を通して吸引により細胞懸濁液を解離する。これは、細胞を解離するには、上下にピペッティングしながら、この段階で泡を避けることが重要である。膵臓オルガノイド最適に5月15日細胞の小グループから始めるため、部分的な解離（ 図1）をお勧めします。
  2. 個々の処理による違いを最小限にするために、エッペンドルフチュー​​ブに、いくつかの胚からの細胞をプールする。 1:3の比で冷却したマトリゲル中の細胞懸濁液を希釈する。分量この混合物を96ウェルプレートに、8μL/ウェルまたは画像化のために最適化されたプレート（下記参照）。
  3. マトリゲル増粘させること、5分間37℃でプレートをインキュベートする。 タブを参照して、選択（オルガノイドや球の培地を70μlの井戸を埋めるレ1および2）、37℃、5％CO 2及び95％空気を含む加湿環境ではあり
  4. すべての4 日目の媒体を交換してください。毎日成長している膵臓コロニーを監視し、画像化してプロセスを文書化します。
  5. 28先に報告されたように関心対象の小分子またはタンパク質は、干渉実験のために、この段階で培地に添加することができる。

表1：オルガノイドミディアム。

素材の名前ストック濃度最終的な培地中の濃度株式のボリューム
ペニシリン - ストレプトマイシン 100パーセント 1％ 50μL
ノックアウト血清代替（サプリメント） 100パーセント 10パーセント 500μL
2 - メルカプトエタノール 14.3 M 0.1 mMの 1μL
ホルボールミリステートアセテート（PMA） 16μM 16 nMの 5μL
Y-27632（ROCK阻害剤） 50 mMの 10μMの 1μL
EGF 50μg/ mlの 25 ng / mlの 2.5μL
組換えヒトR-スポンジン1 250μg/ mlの 500 ng / mlの 10μL
- または -
組み換えマウスR-スポンジン1 250μg/ mlの 500 ng / mlの 10μL
組換えヒトFGF1（aFGFを） 100μg/ mlの 25μg/ mlの 1.25μL
ヘパリン（Liquemin） 2500 U / mlの 2.5 U / mlの 2μL
推奨遺伝子組換え型のヒトFGF10 100μg/ mlの 100 ng / mlの 5μL
DMEM/F-12 4,412.25μL
合計 5000μL

表2：スフィア媒体。

素材の名前ストック濃度最終的な培地中の濃度株式のボリューム
ペニシリン - ストレプトマイシン 100パーセント 1％ 50μL
B27のX50（サプリメント） 100パーセント 10パーセント 100μL
組換えヒトFGF2（bFGFを） 100μg/ mlの 64 ng / mlの 3.2μL
Y-27632（ROCK阻害剤） 50 mMの 10μMの 1μL
DMEM/F-12 4845.8μL
合計 5000μL

オルガノイド開発の進行の3。イメージング

  1. 画像オルガノイドどちら毎日または時間経過顕微鏡による蛍光タイムラプス顕微鏡を使用。タイムラプスイメージングのため、XY（Z）自動化された倒立蛍光顕微鏡を使用しています。
  2. 4ウェルプレートまたは2〜5ミリリットル培地を充填したガラス底プレート中3μLの預金小滴。 10倍の長距離目的としたイメージ。注：蛍光トレーサーを発現するトランスジェニックマウスを使用することができる。例えば、映画1は、PDX1のNgn3-ER TM-IRES-nGFP +マウス4からオルガノイドの初期膨張。核GFPは、個々のオブジェクトが、同様の原理は、膜の蛍光を有する細胞を追跡するために適用することができるように、細胞を追跡することを可能にするMT / Mg系マウス29など。
  3. フォーカスドリフトを回避し、手動で定義されている位置で、3日以上1画像/時を取るために自動化を制御するソフトウェアを設定するために細胞を播種した後タイムラプスイメージングの3時間後に開始します。全ての位置については、蛍光マーカーの発現を報告し、微分干渉コントラスト（DIC）画像ならびにGFP信号を取得する。

組織学のためオルガノイドの4。回収

  1. 氷上で96ウェルプレートを置き、氷冷PBSで置き換え、培地を除去。これは部分的にマトリゲルを解重合する。
  2. 優しくアーキテクチャ全体を混乱させないために千μLチップを使用して、周囲のマトリゲルを除去し、個々のオルガノイドを吸引する。氷冷PBSでウェルに各オルガノイドを転送します。氷の上にプレートを保管してください。マトリゲル内直接固定することも可能である。
  3. 、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で15分間オルガノイドを修正しました。ショ糖でそれを冷凍保存し、ゼラチンに埋め込む。それぞれを処理前述したように凍結切片および組織学のための組織体（ヨハンソンら 、2007）4。

PCRおよび生化学用オルガノイドの5。回復

  1. 氷上で96ウェルプレートを配置し、培地を除去。細胞のRNAを安定化し、保護するために、ウェル当たりのRNAlater 60を添加する。
  2. 部分的に氷の上で解重合することにより、各ウェル内でゲルを機械的に破壊する。全体的なアーキテクチャを混乱させるか、200μlの先端を機械的にゲルを破壊することによって（マトリゲルで）全体をよく回復しないために、千μLチップを使用して個々のオルガノイドを回復のどちらか。 RNA分解酵素フリー非粘着性エッペンドルフチュー​​ブに入ってもコンテンツを転送するために千μlのチップを使用して、氷上に保持。
  3. 60μLのRNAlaterでウェルを洗浄し、同じエッペンドルフチュー​​ブに残りのコンテンツを追加します。
  4. 4℃で500〜1,000×gで5分間チューブをスピン
  5. 20〜30μLを残して上清を取り除き一緒にペレットとチューブ内のRNAlater。生化学のために、可能な限りドライサンプルを格納。
  6. すぐにRNAlater中でサンプルを凍結しないでください。 4℃のCO / Nにおけるストア（RNAlaterで徹底的に組織を貫通できるようにする）。組織は、長期保存のために-20℃で保存することができ、後に組織破壊及びRNAの少量の抽出のために処理することができる。

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結果

3Dマトリゲルで解離し、播種E10.5の背側膵臓前駆細胞は、膵臓の発達を再現。前駆細胞は、最も容易に蛍光リポーターで追跡することができる。我々のケースでは（ 図2）NEUROG3 4を活性化することなく、タモキシフェンの非存在下では、したがって、Pdx1のプロモーター（、PDX1のNgn3-ER TM-nGFP）（動画1）によって制御された核GFPタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを使用していました。

オルガノイド培地で、細胞の小さなクラスターの初期圧縮は、最初の数時間で起こる。拡張は、最初の4日間でのクラスターの拡大（ 図2A）によって検出することができる。 5日目から、枝は20％、最大オルガノイドに形成している。単一細胞を拡張し、大規模なクラスタがPdx1の式 28を保持しながらのPdx1発現を失うことはありません。

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ディスカッション

インビトロにおける機能的β細胞の大規模生産は依然として1無効である。このような厳しい状況では、発生生物学の研究で​​は、機能的なβ細胞の分化に必要とされる正確な信号を解読するに役立つことがあります。このプロトコルは、in vitroでの胚性膵臓前駆細胞の維持、拡大と差別化が可能になります。これは、他の内分泌ホルモンを共発現しないインスリン産生β細胞の形成を含む、Pdx1の高レベルのインスリン成熟し、処理インスリン28を有するプロコンバターゼを発現している。システム内の重要な鍵となる要因は、Y-27632によって経路だけでなく、ROCK阻害FGFシグナルの活性（外因的ヘパリンによって増強追加FGFによって刺激）とNotch（内因性）である：いいえ、それらの因子の非存在下で、または非常にオルガノイドと球の限られた数が28を生成した。 FGFおよびNotための要件CHの活動を簡単に、生体内28での膵臓の開発のための重要性に基づいて理解されている。 ROCK阻害剤は、従って、解離時にマイクロフィラメント...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作品は、デットFrieForskningsråd/ Sundhed OG SygdomからNCCRフロンティア遺伝学におけるパイロット賞、若年性糖尿病研究財団助成41-2009-775とグラント12から126875で順次資金を供給された。著者らは、動画撮影をホストするためのスパニョーリラボに感謝。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15070-063在庫は-20°Cに保たれています。C
ノックアウト セラム リプレイス (サプリメント)Gibco10828-028ストックは -20 °C に保たれています。C
2-メルカプトエタノールSigma Aldrich3148-25MLストックは4°Cに保たれています。C
ホルボールミリスチン酸酢酸 (PMA)Calbiotech524400-1MGストックは-20°Cに保たれています。C
Y-27632 (ROCK阻害剤)Sigma Aldrichab120129在庫は-20°Cに保たれています。安定性/ソースは、頻繁に問題の原因となります。
EGFSigma AldrichE9644-2MGストックは-80°Cに保たれています。C
組換えヒト R-spondin 1R&D4645-RS-025/CF在庫は-80°Cに保たれています。C
組換えマウス R-spondin 1R&D3474-RS-050在庫は-80°Cに保たれています。C
組換えヒトFGF1(aFGF)R&D232-FA-025在庫は-80°Cに保たれています。C - ベータ細胞産生を増加させるために、
ヘパリン(リクミン)Drossapharm4°Cに保たせません。C
組換えヒト FGF10R&D345-FG-025在庫は-80°Cに保たれています。C
DMEM/F-12Gibco21331-020
ペニシリン-ストレプトマイシンGibco15070-063在庫は-20°Cに保たれています。C
B27 x50 (supplement)Gibco17504-044ストックは-20°Cに保たれています。C
組換えヒトFGF2(bFGF)R&D233-FB-025ストックは-80°Cに保たれています。C
マトリゲルコーニング356231ストックは-20°Cに保たれています。C
トリプシン 0.05%Gibco25300-054在庫は 4 度に保たれています。C
RNAlater - RNA安定化試薬Qiagen76104RT
Dispase シグマ アルドリッチD4818-2MG使用濃度: 1.25 mg/ml. ストックは -20 °C に保たれています。
C BSA 再構成用Milipore81-068サイトカインの再構成用  - ストックは -20 °C に保たれています。C
子牛胎児血清 (FCS)Gibco16141079Stock kept at -20 >C
60ウェルマイクロウェルトレイSigma AldrichM0815-100EA
4ウェルプレートThermo Scientific176740
95ウェルプレート FボトムGreiner Bio6555180
Glas ボトムプレートIbidi81158
ディスポーザブルガラスマイクロピペットBlaubrand708745
顕微鏡Cell® 浜松市オルカER製B7WカメラとLudin Cube、Boxを搭載したイメージングステーション(電動倒立型オリンパスIX81スタンド)
Leica DMI6000 Bスタンドは、Leica DFC365 FXカメラとAF6000 Expert/Matrixソフトウェアコマンドインターフェースを備えたLudin CubeとBoxに囲まれています。
目的、UPLAN FL、NA 0.30、空気、9.50 mm、10X、長距離;
ライカ HC PL FLUOTAR NA 0.30 空気 11.0 mm 10X 長距離
ストックをオリンパス、

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