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方法論記事

ヒト胚性幹細胞におけるターゲティングジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子の強化

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DOI:

10.3791/51764

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2014年8月23日

 ,  ,  ,  , 
1Drug Discovery Biology, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University

この記事について

サマリー

レポーター細胞株は、視覚追跡し、不均一な集団から目的の細胞を単離する手段を提供する。しかし、遺伝子ターゲッティングヒト胚性幹細胞は、従来の相同組換えを使用しては非常に非効率的である。本明細書では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ増強相同組換えを使用して、EGFPとCNS中脳特異的転写因子PITX3遺伝子座を標的と記載している。

要約

現在のヒト胚性幹細胞（ESC）分化プロトコールの一つの主要な制限は、不均一な細胞集団の生成である。これらの培養は、目的の細胞を含むだけでなく、未分化ESCを、非神経誘導体および他のニューロンのサブタイプで汚染されている。これは、 インビトロで、そのような創薬または細胞置換療法のためのin vitroモデルとして、生体内用途におけるそれらの使用を制限する。これを克服するために、目的の細胞を可視化する追跡し、単離するための手段を提供するレポーター細胞株は、操作され得る。しかし、従来の相同組換えを介したヒト胚性幹細胞でこれを達成するためには非常に非効率的である。このプロトコルは、説明して一緒に、サイト固有の二本鎖DNA切断を導入、カスタム設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、ヒト胚性幹細胞における下垂体ホメオボックス3（PITX3）遺伝子座のターゲティングPITX3 - EGFP特異なDNAドナーベクター。 PITX3レポーター細胞株の生成に続いて、それは、次に、 インビトロパーキンソン病モデルまたは細胞置換療法として研究における使用のために公開されたプロトコルを使用して分化させることができる。

概要

現在、胚性幹細胞（ESC）の分化プロトコルは、特に特定のニューロン表現型の誘導に関して、不均一な細胞集団を生じる。培養物が所望の細胞表現型、他の神経を含んでいるがこのように、非神経および未分化細胞型は、多くの場合、1が存在する。これらの特性は、細胞置換療法およびin vitro疾患モデルにおける使用のための ESC由来する細胞供給源の適用を制限する。

遺伝子レポーター細胞株は、視覚追跡し、目的の細胞を単離するための手段を提供する、レポータータンパク質（RP）の発現は、内因性発現を再現することを条件とする。遺伝子コード領域のすぐ上流にプロモーターの使用は、粗遺伝子レポーターを導出するために使用することができるが、そのような構築物は、内在性遺伝子の発現を制御する正確な調節要素を欠いている。対照的に、相同組換えが提供RPの忠実度の高い発現を確実にする機会。過去には、目的の特定の遺伝子座での相同組換えのために設計されたターゲッティングベクターは、DNA送達1,2手段としてエレクトロポレーションを用いて、マウスのESC（たmESC）でRPを標的化するために使用されてきた。しかしながら、従来の相同組換えを介したレポーター細胞株の生成は、ヒトESC（hESCの）のための非常に非効率的であるため、唯一の（3日）の場合の一握りに記載されている。 Iは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNは）と総称される部位特異的ジンクフィンガーモチーフでヌクレアーゼフォックの融合物を含む操作されたキメラタンパク質を用いて、DNA二本鎖切断は、予め決定されたゲノム遺伝子座に導入することができる。 DNA二本鎖切断の両側に相同性を有するDNAベクターを添加する場合、ゲノム部位は、DNAドナー配列の組み込みを可能にする、相同組換えによって修復することができる。この技術は有用fは証明されているまたはヒト初代細胞4,5及びヒトES細胞6,7の両方におけるゲノム編集。より最近の研究は、部位特異的ヌクレアーゼ9の設計を支援するために、転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENS）、植物病原体8によって使用される転写因子を利用している。

以下のプロトコルでは、ヒト下垂体ホメオボックス3（PITX3）遺伝子座のためのZFNと一緒に相同ターゲティングベクター6を含むEGFPのエレクトロポレーションによってのhESCレポーター細胞株の生成を実証する。 2〜3週間のための抗生物質選択の後、正常に組み込まれたDNAでhESCを手動で拾い、拡大し、PCRを介して最初にスクリーニングし、続いてサザンブロット法によって検証することができます。

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プロトコル

全ての手順は、無菌層流フード中で実施される。特記のない限り、すべてのメディアとの溶液を37℃に平衡化する。

トランスフェクションのための人間のPSC（ヒトES細胞とhiPSCs、WA-09この議定書で使用される）の1。拡大

注：これは、マトリゲルまたはGeltrex上のhESCを拡張する必要はありません。ヒトES細胞は、マウス胚性線維芽細胞（MEF）上に展開（セクション2.8を参照）MEF除去工程以下のエレクトロポレーションまたはヌクレオのために使用することができる。

  1. w / vゼラチン0.1％でプレコーティング皿上で（ 表1参照）1×100 mmディッシュとMEF培地中で1cm 2当たり2.0×10 4個の細胞でのDR4のMEFの1×75平方センチメートルフラスコを準備します。
    注：CF1、BLK6またはMF1のMEFを使用することができます、しかし、それは、 例えば、DR410、抗生物質耐性MEFラインが使用されていることをお勧めします。
  2. 翌日、通路のhESCセクション1.1で調製したMEFであらかじめメッキ100mmディッシュ上に。このASPIを行うには文化の料理からレートのhESC媒体は、Ca2 +の/ Mg2 +を含まないハンクス平衡塩溶液（HBSS）でヒトES細胞を洗浄し、37℃/ 5％CO 2で加湿インキュベーター中ディスパーゼ（適切なボリュームについては表2を参照）、場所を追加します。 MEFはを削除するには、HBSSで2回 - 3〜5分のインキュベーション後、穏やかに吸引ディスパーゼと1を洗う。穏やかに培養皿の表面からコロニーをこすり、hESC媒体（ 表3参照）及び細胞スクレーパーを使用して、または5 mlピペットを追加する。
  3. 15ミリリットルの遠心管に培養皿から懸濁液中のコロニーの断片を収集します。 hESC媒体で培養皿をすすぎ、15mlチューブに移す。単一細胞または小さな断片に塊を壊さないように注意してください。
  4. コロニー断片をペレットに160×gで5分間遠心する。
  5. 上清を吸引し。コロニーフラグメントペレットを緩め指で15ミリリットルチューブの底をタップします。分割比率に応じhESC媒体中で静かに再懸濁コロニー断片（normall4と1：8適切である）屋1の間の比を分割します。これは効率に再播種影響するように、単一の細胞または小さな断片に塊をレンダリングしないように特に注意してください。
  6. MEFは上のhESCの断片を再播種する前にHBSSで1倍を洗う。ゆっくり皿のMEFで予めメッキにhESC媒体中のhESC断片を含む細胞懸濁液を適当量（ 表2参照）を追加する。
  7. インキュベーター内の棚の上に培養皿を置き、均等にコロニー断片を配布するために前後左右にゆっくりと移動する。
  8. 毎日のhESC媒体を交換してください。
  9. MEFは（MEF-CM）からの馴化培地を製造するために洗って75cm 2のフラスコMEFをHBSSで1×で予備メッキ。 hESC媒体を追加します。 24時間後、馴化培地を収集し、新鮮なhESC媒体と交換してください。 12日間の最大を毎日繰り返します。必要になるまで4℃でMEF-CMに保管してください。

トランスフェクションのためのヒトESCの調製

  1. hESCの成長を観察します毎日顕微鏡下で。コロニーは40〜50％コンフルエント、板1cm 2当たり2.0×10 5 MEFを持つ3×100 mmディッシュになると。
  2. コロニーが60になったとき - 70％コンフルエント彼らは、トランスフェクトされる準備ができている。差別化したコロニーまたはコロニーコアを除去することにより、「新郎」コロニー。
    注：私たちは、より高いトランスフェクションを信じて、細胞が対数増殖期にあるときにターゲットに効率が発生すると、それはhESCは≥70％の密集度に到達する前に、エレクトロポレーションが行われることが示唆されている。
  3. HBSSでhESCコロニーを洗浄しのAccutaseを追加します。
    注：なお、ステップ2.7の間にY-27632と共にインキュベートした場合ROCK阻害剤Y-27632で予め御馳走hESCは十分な阻害が発生する必要はありません
  4. 37℃/ 5、顕微鏡下で見たときのコロニーが単一細胞をレンダリングするまで％のCO 2で20分間- 10インキュベートする。 1ミリリットルピペットで粉末化した細胞。
  5. 40μmのセルstraineを使用して15ミリリットルコニカルチューブにhESC媒体とフィルタを追加します。細胞塊を除去するためのrを。
  6. 5分間160×gで遠心分離する。新鮮なhESC媒体中で再懸濁細胞ペレットおよび任意の残留のAccutase溶液を除去する繰り返します。
  7. 10μMのY-27632を含むhESC媒体中で細胞を再懸濁し、ゼラチンでプレコーティング100mmディッシュに、総細胞懸濁液を移す。
  8. 最低30分間、37℃/ 5％CO 2でインキュベートする。
  9. この間、MEFを、ゼラチンコートディッシュに接着する。新鮮を15ml遠心管に1mLのピペットを使用して非付着性のhESCを収集し、血球計数器を用いて細胞密度を決定する。

hESCの3。エレクトロポレーション

  1. 0.22μmのフィルターを用いてフィルタCM-MEF培地および10ng / mlの組換えヒト線維芽細胞増殖因子2（rhFGF2）を加える。
  2. 5分間160×gで新しい15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にセクション2.9から7.5×106のhESCを転送します。
  3. 指数関数ELEを選択プログラム：この時間の間にエレクトロを設定250 V、静電容量：500μF、および抵抗：∞-以下のパラメータ、電圧をctroporationと設定してください。
  4. 上清を吸引し、氷冷0.22μmのフィルタ処理のHBSS 0.8ミリリットルに細胞ペレットを再懸濁。無菌0.4cmのエレクトロポレーションキュベットにソリューションを転送します。
  5. TV-hPITX3フォワードターゲッティング構築（30μgのDNA）を追加し、200μlのピペットを用いて穏やかに混合。氷上で5分間インキュベートする。この間にPITX3 ZFN mRNAの1アリコートを除去し、氷上で解凍。エレクトロポレーションキュベットにDNA /細胞混合物に転送のZFN mRNAの7.5μLを解凍するとき。 200μlのピペットを用いて穏やかに混合。
    注：標的とされる遺伝子座は、効率をターゲットに貢献する主要な要因である。遺伝子座はサイレント遺伝子をコードする、などPITX3などのESCで発現しない遺伝子は、従来の相同組換え6を用いて標的とすることは困難である。したがって、このプロトコルは、DNA二本鎖bを誘導するために、人間PITX3座のためのカスタム設計されたZFNを利用reak。
  6. エレクトロ上の画面に表示される指示に従って、エレクトロポ。
  7. 200μlのピペットを使用すると、10ミリリットルのヒトES細胞培地を含む15mlチューブにエレクトロポレーションキュベットからコンテンツを転送します。毎回hESC媒体200μlで二回キュベットを洗浄し、15mlチューブに移す。否定的に細胞の生存に影響を与える溶解した細胞からDNAおよびタンパク質からなる「粘液状」の残骸があるでしょう。この破片を除去するために5分間160×gで遠心分離する。
  8. 上清を吸引し、穏やかに緩めます細胞ペレットをタップします。 10μMのY-27632を含むMEF-CMを補足30mlに再懸濁し、MEFをしてpreplated 3×100mmの皿にreplate。
  9. 日単位のメディアを変更します。 2日目に、Y-27632を回収することができ、細胞は、hESC媒体中で増殖させた。
  10. 2-3日後、hESCを50〜70％コンフルエントであるべきである。この時点で、抗生物質選択（ 例えば、0.5 / mlのピューロ）を開始します。
  11. SELを維持毎日新鮮なhESC /ピューロメディアを追加することでと接続。 〜7日後に小さなコロニーが見えるはずです。抗生物質耐性のMEFを使用しない場合は、MEFを1cm 2あたりの追加1.0×10 4個の細胞を添加することによって補うことができる。

4。ピッキングジェニックのhESCクローン

  1. 約14 - （コロニーは〜1mmの直径に達した）選択に続いて21日には、拡張およびスクリーニング用プレートを準備します。 5時間の最小値、4℃でマトリゲルまたはGeltrexのアリコートを解凍することから始めます。製造者の指示に従って希釈し、3×96ウェルプレートの各ウェルに75μlを添加する。 1cm 2当たり2.0×10 4個の細胞でのMEFをプレーティングすることによって3×48ウェルプレートを準備します。 37℃/ 5％CO 2で両プレートO / Nインキュベートする。
  2. 次の日は、グリッドを切断して2ミリリットルピペットの先端に21 G針を使用して16〜25個にコロニーを解剖。
  3. 吸引し、96ウェルプレートからのマトリゲルとsupplemと交換取得済みのCM-MEF培地。ウォッシュ48ウェルプレート中のMEF HBSSで1 xとhESC媒体を追加します。
  4. 200μlのピペットを用いて静かに拡張のために48ウェルプレートに解剖し、コロニーの3分の1を転送します。補足したCM-MEF培地を含む対応する96ウェルプレートに解剖し、コロニーの他の3分の2を転送します。
  5. 日単位のメディアを変更することで、両方のプレートを維持する細胞（MEFを含む48ウェルプレート96ウェルマトリゲルコーティングしたプレートとのhESC媒体用CM-MEF培地を補足し、どちらも0.5 / mlのピ​​ューロを補充した）。
  6. 96ウェルプレートを100％コンフルエントであり、その後、最初にPCRによってスクリーニングされるまで展開する。

5。スクリーニングし、陽性クローンの拡大

  1. ゲノムDNA（11に基づく方法）を調製反転させることによりプレートからすべてのメディアを削除するには、その後、ペーパータオルの上にブロット。
  2. 各RT PBS（100μl/ウェル各洗浄）、ステップ5.1の場合と反転し、ブロットとよく二回すすいでください。 -80℃fにおける置きプレートまたは1 - 2時間は、細胞溶解を助けるために（プレートは次のように無期限に保存することができる）。
  3. 細胞はサルコシル溶解バッファーを作るC -80°であるが（ 表4参照）（50μl/ウェル）。各ウェルに細胞を、RTで5分間のウォームプレートピペット溶解緩衝液を溶解した。湿度を作成するために、湿ったペーパータオルを含む密封可能容器内のテープ、場所と各プレートの端をシールし、60℃でO / Nインキュベートする。
  4. インキュベーション後、-20℃の無水エタノール10mlに5M NaClを150μlのを追加し、よく混ぜて、各ウェルに100μlを添加する（注：NaClをが追加されたときにエタノールが曇って行きます）。タッププレートは穏やかに混合（しないピペットを行う）と、室温で30分間、最低残す。この間、溶液は透明に行くとDNAが沈殿する。
  5. 各ウェルに70％エタノールを150μlを追加し、ステップ5.1のように、ソリューションを削除します。優しくプレートを逆さにし、以前のようにブロット。この手順をさらに2回繰り返します。
    注：のため沈殿したDNA当然のadhE組織培養プラスチックへの解像度は、これらの洗浄工程中に追い出さにならない。）
  6. 最終洗浄後、トップスピードで簡単に遠心機のプレートは、少​​なくとも30分間、RTで、各ウェルその後空気乾燥の下部（または37℃）へのDNAを濃縮する。
  7. 1時間または4℃、CO / N PCRに使用する前に65℃で各ウェルに50μlのT0.1E液（pH8.0）（ 表5参照）またはTE液（pH8.0）と場所プレート- 40を追加します。静かにプレートの側面をタップして、DNAを再懸濁します。再懸濁したDNA /10μlのPCR反応の1-2μlを使用する。
  8. hPITX3 Lはアーム世代でロングテンプレートPCRシステムを展開して使用する。 FとhPITX3 LのアームGFP Rプライマーは、58℃のアニーリング、45秒の伸長、35サイクルでクローンの最初のスクリーニングを行う。
  9. 45分間100VでGelRed及びUV照射を介して、陽性クローンを検出含む1％アガロースゲルでHyperladderの1キロバイトで電気泳動したサンプル。
  10. EXPAからゲノムDNAを消化し、PCR陽性クローンを検証サザンブロットへのベクターの相同性ア ​​ームのHindIIIおよびハイブリダイズのプローブの5 'および3'でndedクローン（下記参照）（以前は1で説明したように）。プローブは、プライマー対hPITX3 5 'プローブFとR、およびhPITX3 3'プローブFとR、EcoRIで消化し、一般的なクローニングベクターにライゲーションを使用してPCRによって生成される。
  11. 陽性クローンの数に応じて、MEFを（1cm 2当たり2.0×10 4細胞）でプレめっき法により6ウェルプレートの2ウェルを準備。
  12. 次の日は、1時間の最低10μMのY-27632で48ウェルプレートでの陽性クローンを前処理。
  13. HBSSで陽性クローンを洗浄しのAccutaseを300μlを追加。
  14. コロニーは、単一細胞をレンダリングするとき、のhESC培地1mlを追加し、15mlチューブに収集する。
  15. 日単位のメディアを変更します。 2日目に、Y-27632を回収することができ、細胞は、hESC媒体中で増殖させた。
  16. 80％コンフルエント、サブカルチャーと大腸の残りを凍結 - コロニーは70であるときNY断片。

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結果

PITX3と一緒にカスタム設計されたPITX3ジンクフィンガーペアの同時エレクトロポレーションに続いて- EGFP特異なDNAドナーベクター、およびその後のピューロマイシン選択、正のhESCクローンを、最初にゲノムPCRスクリーニング（ 図1）を介して検出された。これらのPCR 5での陽性クローン'および3'特異的プローブのサザンブロットハイブリダイゼーションは、19％の効率で、PITX3遺伝子座 （ 図2）のエキソン1ために正しいターゲティングを確認した。 図3に示す免疫蛍光画像は、公開されたPA6間質細胞の分化プロトコル12,13を使用して分化を以下PITX3プロモーターによって駆動されるEGFP発現を示す。 EGFPの共局在は、FOXA2（赤）（ 図3A）およびチロシンヒドロキシラーゼ（TH;赤色）などの中脳ドーパミン作動性ニューロンのマーカーで観察することができ、（ ...

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ディスカッション

レポーター細胞株の生成は、追跡し視覚化し、ヒトES細胞から誘導された不均質な集団から目的の細胞を単離するための強力な手段を提供しています。しかし、従来の相同組換えによる遺伝子ターゲティングは、ヒトESC 3に極めて非効率的であることが証明されている。このプロトコルでは、ZFNを一緒に広く利用可能なターゲティングベクターを用いて、ヒトES細胞で、エクソンPITX3座の一つに、RPを導入するための比較的簡単な手法について説明します。私たちの手では、遺伝子標的化システム（つまり、以前に公開された6と同様に）正確に標的PITX3遺伝子座を含むピューロマイシン耐性クローンの19％で、効率的である。

遺伝子ターゲティングを容易にするためのZFNの使用に制限が家の中でゼロからのZFNを設計する上での難しさである。このように、このプロトコルで私達は取得する高価なことができ、カスタム設計された市販のZFNはを使用した。＆＃160;より最近では、ターレンシステムは、相同組換え9...

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開示事項

著者らは、開示することは何もない。

謝辞

このプロトコルで説明する作業は再生医療のためのカリフォルニア研究所（CIRM）との共同提携の一環として、ビクトリア州政府からの資金提供によって可能になりました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
マウス胚性線維芽細胞 (DR4)GlobalStemGSC-6004G
ゼラチンシグマG1393-100ML
HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド (HBSS)なし Life Technologies14175-095
DispaseStemCell Technologies7923
Cell ScraperCorning3008
AccutaseライフテクノロジーズA11105-01
Y27632索Medchem軸索1683
セルストレーナー - 40 ΜmBDバイオサイエンス352340
33 mm - 0.22 μmフィルターMilliporeSLGP033RS
rhFGF2R&D Systems233-FB-025/CF
エレクトロポレーターBioRad165-2661
0.4 cm エレクトロポレーションキュベットBioRad165-2088
ヒト TV-hPITX3-前方ターゲティングコンストラクトAddgene31942
ZFN キット;ヒト PITX3Sigma-AldrichCKOZFN1050-1KT
ピューロマイシンInvivoGenant-pr-1
マトリゲルBD バイオサイエンス354277
GeltrexLife TechnologiesA1569601
NaClSigma-AldrichS3014
ダルベッコ モディファイド イーグル メディウム (DMEM)Life Technologies10566-016
ウシ胎児血清、認定、熱不活化、米国原産 (FBS)Life Technologies16140-071
Pen/StrepLife Technologies15070-063
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)Life Technologies11320-033
KnockOut Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828-028
MEM非必須アミノ酸 (NEAAの)ライフテクノロジー11140-050
GlutaMAXライフテクノロジーズ 35050-061
ß-メルカプトエタノールライフテクノロジーズ 21985-023
N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩溶液(サルコシル) (30%)シグマ-アルドリッチ61747
EDTAシグマ-アルドリッチE9884
Trizma HydrochlorideSigma-AldrichT3253
Proteinase K solution (20 mg/ml)Bioline AustraliaBIO-37084
Expand Long Template PCR SystemRoche Australia11681834001
hPITX3 L arm gen. F (プライマー): 5'TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3'GeneWorks社(オーストラリア
hPITX3 L arm GFP R (プライマー): 5'ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3'GeneWorks、オーストラリア
HyperLadder 1 kb バイオラインオーストラリアBIO-33025
GelRedJomar Bioscience、オーストラリア41003
軸ズ )

参考文献

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