レポーター細胞株は、視覚追跡し、不均一な集団から目的の細胞を単離する手段を提供する。しかし、遺伝子ターゲッティングヒト胚性幹細胞は、従来の相同組換えを使用しては非常に非効率的である。本明細書では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ増強相同組換えを使用して、EGFPとCNS中脳特異的転写因子PITX3遺伝子座を標的と記載している。
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この記事について
サマリー
要約
現在のヒト胚性幹細胞（ESC）分化プロトコールの一つの主要な制限は、不均一な細胞集団の生成である。これらの培養は、目的の細胞を含むだけでなく、未分化ESCを、非神経誘導体および他のニューロンのサブタイプで汚染されている。これは、 インビトロで、そのような創薬または細胞置換療法のためのin vitroモデルとして、生体内用途におけるそれらの使用を制限する。これを克服するために、目的の細胞を可視化する追跡し、単離するための手段を提供するレポーター細胞株は、操作され得る。しかし、従来の相同組換えを介したヒト胚性幹細胞でこれを達成するためには非常に非効率的である。このプロトコルは、説明して一緒に、サイト固有の二本鎖DNA切断を導入、カスタム設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて、ヒト胚性幹細胞における下垂体ホメオボックス3（PITX3）遺伝子座のターゲティングPITX3 - EGFP特異なDNAドナーベクター。 PITX3レポーター細胞株の生成に続いて、それは、次に、 インビトロパーキンソン病モデルまたは細胞置換療法として研究における使用のために公開されたプロトコルを使用して分化させることができる。
概要
現在、胚性幹細胞（ESC）の分化プロトコルは、特に特定のニューロン表現型の誘導に関して、不均一な細胞集団を生じる。培養物が所望の細胞表現型、他の神経を含んでいるがこのように、非神経および未分化細胞型は、多くの場合、1が存在する。これらの特性は、細胞置換療法およびin vitro疾患モデルにおける使用のための ESC由来する細胞供給源の適用を制限する。
遺伝子レポーター細胞株は、視覚追跡し、目的の細胞を単離するための手段を提供する、レポータータンパク質（RP）の発現は、内因性発現を再現することを条件とする。遺伝子コード領域のすぐ上流にプロモーターの使用は、粗遺伝子レポーターを導出するために使用することができるが、そのような構築物は、内在性遺伝子の発現を制御する正確な調節要素を欠いている。対照的に、相同組換えが提供RPの忠実度の高い発現を確実にする機会。過去には、目的の特定の遺伝子座での相同組換えのために設計されたターゲッティングベクターは、DNA送達1,2手段としてエレクトロポレーションを用いて、マウスのESC（たmESC）でRPを標的化するために使用されてきた。しかしながら、従来の相同組換えを介したレポーター細胞株の生成は、ヒトESC（hESCの）のための非常に非効率的であるため、唯一の（3日）の場合の一握りに記載されている。 Iは、ジンク....
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プロトコル
全ての手順は、無菌層流フード中で実施される。特記のない限り、すべてのメディアとの溶液を37℃に平衡化する。
トランスフェクションのための人間のPSC（ヒトES細胞とhiPSCs、WA-09この議定書で使用される）の1。拡大
注：これは、マトリゲルまたはGeltrex上のhESCを拡張する必要はありません。ヒトES細胞は、マウス胚性線維芽細胞（MEF）上に展開（セクション2.8を参照）MEF除去工程以下のエレクトロポレーションまたはヌクレオのために使用することができる。
- w / vゼラチン0.1％でプレコーティング皿上で（ 表1参照）1×100 mmディッシュとMEF培地中で1cm 2当たり2.0×10 4個の細胞でのDR4のMEFの1×75平方センチメートルフラスコを準備します。
注：CF1、BLK6またはMF1のMEFを使用することができます、しかし、それは、 例えば、DR410、抗生物質耐性MEFラインが使用されていることをお勧めします。 - 翌日、通路のhESCセクション1.1で調製したMEFであらかじめメッキ100mmディッシュ上に。このASPIを行うには文化の料理からレートのhESC媒体は、Ca2 +の/ Mg2 +を含まないハンクス平衡塩溶液（HBSS）でヒトES細胞を....
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結果
PITX3と一緒にカスタム設計されたPITX3ジンクフィンガーペアの同時エレクトロポレーションに続いて- EGFP特異なDNAドナーベクター、およびその後のピューロマイシン選択、正のhESCクローンを、最初にゲノムPCRスクリーニング（ 図1）を介して検出された。これらのPCR 5での陽性クローン'および3'特異的プローブのサザンブロットハイブリダイゼーションは、19％の効率で、PITX3遺伝子座 （ 図2）のエキソン1ために正しいターゲティングを確認した。 図3に示す免疫蛍光画像は、公開されたPA6間質細胞の分化プロトコル12,13を使用して分化を以下PITX3プロモーターによって駆動されるEGFP発現を示す。 EGFPの共局在は、FOXA2（赤）（ 図3A）およびチロシンヒドロキシラーゼ（TH;赤色）などの中脳ドーパミン作動性ニューロンのマーカーで観察することができ、（ .......
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ディスカッション
レポーター細胞株の生成は、追跡し視覚化し、ヒトES細胞から誘導された不均質な集団から目的の細胞を単離するための強力な手段を提供しています。しかし、従来の相同組換えによる遺伝子ターゲティングは、ヒトESC 3に極めて非効率的であることが証明されている。このプロトコルでは、ZFNを一緒に広く利用可能なターゲティングベクターを用いて、ヒトES細胞で、エクソンPITX3座の一つに、RPを導入するための比較的簡単な手法について説明します。私たちの手では、遺伝子標的化システム（つまり、以前に公開された6と同様に）正確に標的PITX3遺伝子座を含むピューロマイシン耐性クローンの19％で、効率的である。
遺伝子ターゲティングを容易にするためのZFNの使用に制限が家の中でゼロからのZFNを設計する上での難しさである。このように、このプロトコルで私達は取得する高価なことができ、カスタム設計された市販のZFNはを使用した。＆＃160;より最近では、ターレンシステムは、相同組換え9.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もない。
謝辞
このプロトコルで説明する作業は再生医療のためのカリフォルニア研究所（CIRM）との共同提携の一環として、ビクトリア州政府からの資金提供によって可能になりました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| マウス胚性線維芽細胞 (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| ゼラチン | シグマ | G1393-100ML | |
| HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド (HBSS) | なし Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | ライフテクノロジー | ズA11105-01 | |
| Y27632 | 索Medchem | 軸索1683 | |
| セルストレーナー - 40 Μm | BDバイオサイエンス | 352340 | |
| 33 mm - 0.22 μmフィルター | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| エレクトロポレーター | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4 cm エレクトロポレーションキュベット | BioRad | 165-2088 | |
| ヒト TV-hPITX3-前方ターゲティングコンストラクト | Addgene | 31942 | |
| ZFN キット;ヒト PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| ピューロマイシン | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| マトリゲル | BD バイオサイエンス | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| ダルベッコ モディファイド イーグル メディウム (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| ウシ胎児血清、認定、熱不活化、米国原産 (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM非必須アミノ酸 (NEAAの) | ライフテクノロジー | 11140-050 | |
| GlutaMAX | ライフテクノロジー | ズ 35050-061 | |
| ß-メルカプトエタノール | ライフテクノロジー | ズ 21985-023 | |
| N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩溶液(サルコシル) (30%) | シグマ-アルドリッチ | 61747 | |
| EDTA | シグマ-アルドリッチ | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (プライマー): 5'TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3' | GeneWorks社(オーストラリア | ||
| hPITX3 L arm GFP R (プライマー): 5'ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3' | GeneWorks、オーストラリア | ||
| HyperLadder 1 kb | バイオラインオーストラリア | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience、オーストラリア | 41003 |
参考文献
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W.
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