リボヌクレアーゼに富むマウスの膵臓から高い完全性でRNAを単離する手順を報告します。
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この記事について
サマリー
要約
マウスの膵臓のようなリボヌクレアーゼに富んだ組織からの高品質なRNAの単離は課題を提示します。 膵臓の主な機能は消化を助けることであるため、マウスの膵臓には75mgのリボヌクレアーゼが含まれている可能性があります。 マウス膵臓からRNAを単離するための標準的なフェノール/グアニジンチオシアン酸溶解試薬プロトコルの改変を報告します。 グアニジンチオシアン酸塩は強力なタンパク質変性剤であり、ほとんどの条件下でリボヌクレアーゼの活性を効果的に妨害します。 しかし、リボヌクレアーゼが豊富な組織からRNAを成功裏に単離するためには、標準的なプロトコルに重要な変更を加える必要があります。 主なステップには、溶解試薬と組織比が高いこと、相分離前の未消化組織の除去、RNA溶液へのリボヌクレアーゼ阻害剤の包含などがあります。 これらの修飾やその他の修飾を使用して、RNA Integrity Number(RIN)が7を超えるRNAを日常的に単離します。 単離されたRNAは、日常的な遺伝子発現解析に適した品質です。 膵臓以外のリボヌクレアーゼが豊富な組織からRNAを単離するためのこのプロトコルの適応は、容易に達成可能であるべきです。
概要
高い整合性を持つRNAの単離は、ノーザンブロット法9、定量RT-PCRの1または5の遺伝子発現プロファイリングなどの日常的な分子生物学の実験のために必要とされている。 RNA単離の最も現代的な方法は、グアニジンチオシアネートプロトコル2、3の修正に基づいている。グアニジンチオシアネートは、強力なタンパク質変性剤であり、効果的に、最も条件の下でリボヌクレアーゼの活性を破壊します。をChomczynskiおよびSacchi 3の一般的な方法は、約4時間までの単離時間を短縮する、チオシアン酸グアニジン溶解溶液にフェノールを組み合わせる。多くの市販のRNA抽出試薬をChomczynskiおよびSacchi法3に基づいている。
例えば、ヒトやマウスの膵臓リボヌクレアーゼ多い組織は、RNAを分離するための新たな課題が発生します。マウスの膵臓は、そのうちのいくつかは、ドゥリンリリースされるリボヌクレアーゼ6の75ミリグラムを含有することができるg組織の自己消化、その結果膵臓組織の破壊。グアニジンチオシアプロトコルの改変に成功し、高い完全性2、4、7、10の膵臓からRNAを単離するために使用されてきた。RNA安定化試薬の注入マウスの膵臓中へ、高い整合性4、7、10の一方注入をRNAの単離を容易に膵....
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プロトコル
1。準備
次のプラクティスは機関の動物実験委員会（IACUC）によって設定されたポリシーに準拠しています。
- これは、任意の日にはもう6よりもマウスの膵臓を分離することをお勧めします。清潔でオートクレーブし、すべての手術器具、動物あたり1セットがあります。
- すべてのマイクロ遠心チューブにラベルを付けます。動物あたり4つの2 mlチューブ。
- 氷上の50ml遠心管中で溶解試薬の8ミリリットルを配置します。注：精製キットは、膵臓の分離に適していますグアニジンチオシアネートフェノール試薬が付属していますが、溶解試薬があるため、分離ごとに必要な大量の使用されています。
- ホモジナイザーのブレードを洗浄するための15ml遠心チューブに以下の溶液約10mlを分注する。エタノール、70％（2本）、HPLCグレードの水（1管）とアウェイのRNaseの約200μLを含むHPLCグレードの水または同等のリボヌクレアーゼ不活性化。
2。手術、膵臓の解剖及び均質化
- コットンガーゼやペーパータオルを含むJARにイソフルラン1〜2mlのを配置します。マウスはイソフルランのソースに到達するのを防止するプラットフォーム上に配置されている。前各マウスを麻酔にジャーに新鮮イソフルランを追加します。
- 優しくイソフルランを含むJARにマウスを....
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結果
溶解ホモジネートの1ミリリットルからの全RNAの収量は20〜40μgのです。 OD 280分の260の比率は、典型的には約2.0であり、RINは7.0よりも一貫して大きい。 RINは6≤されている場合は、アイソレーションが繰り返される必要があります。時々、8.0より高いRINが達成される。
前膵臓の除去にマウスを安楽死させる2つの最も一般的に使用されている方法は、CO 2窒息またはイソフルランの吸入である。両方の技術は、頸椎脱臼に続いている。それは、化学剤及び/又は処置時間は、RNAの完全性に影響を与える可能性があることが可能であるので、マウス膵臓RNAのRINは、両方の技術を用いて単離し比較した。マウスをCO 2窒息またはイソフルラン吸入を用いて麻酔した。両方の技術は、頸椎脱臼により追跡した。動物を麻酔の際には、事前の頸椎脱臼にisoflに比べて、CO 2窒息のために、約1から2分長かったurane。イソフルランの吸入後単離したRNAは、CO 2窒息のための2.2±0.3のRIN（P <.......
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ディスカッション
リボヌクレアーゼが豊富な組織からRNAを単離することは分子生物学的実験のための大きな課題を表しています。様々な試薬およびキットは、主にRNA抽出のフェノールグアニジンチオシアネート法に基づいているが市販されている。グアニジンチオシアネートは、タンパク質を変性し、このようにリボヌクレアーゼ活性を低下させる。しかし、膵臓リボヌクレアーゼの膨大な大きさは、RNA単離の標準プロトコルへの追加の変更が必要になります。プロトコルは標準のグアニジンチオシアネート法に基づいていること、ここで報告されていな膵臓リボヌクレアーゼ豊富な組織からのRNAの成功を単離するためのいくつかの重要な修正だけでなく、ヒントが含まれています。
RNAを単離するための標準的なガイドラインは、留意されるべきである。これらの技術は、さらに少ないリボヌクレアーゼが豊富な膵臓よりも標本から、RNAの成功の単離に重要である。いくつかの例は、分子生物学グレードのWAを使用することを含むTER、リボヌクレアーゼフリーの消耗品や使い捨てのプラスチック製食器ではなく、ガラス。それは、それぞれの分離の間に手袋を変更することをお勧めします.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
我々は彼らの有益なコメント、提案やそのプロトコルの共有のため建華玲、レイモンド·マクドナルド、ガルビンスウィフト、ミシェル·グリフィン、ポールGrippoとSatyanarayana Rachaganiに感謝します。この作品は、付与U01CA111294、オハイオ州立大学学内研究プログラムからのアイデア開発賞によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| パワージェネレーション500 | フィッシャーサイエンティフィック | 14-261-03 | ホモジナイザー |
| 5424R | エッペンドルフ | マイクロセンティフゲ | |
| トリゾール試薬 | Invitrogen | 15596018 | 溶解試薬 |
| 学生バンナス 春はさみ | フィッシャー | 91500-09 | 付着した組織から膵臓を切除するために使用します |
| 外科用ハサミ、6インチ | フィッシャー | 08-951-20 | |
| 端の鉗子 | フィッシャー | 1381239 | |
| イソフルラン USP | アボット ラボ | 4/8/5210 | 麻酔 |
| 薬 Rnase アウト (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | 一般Rnase不活性化剤 |
| HPLCグレードの水 | フィ | ッシャーW5-4 | ホモジナイザーブレードの洗浄用 |
| 分子生物学グレードの水 | Hyclone | SH30538.03 | RNAの溶出 |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 mlの微量遠心チューブ、認定されたRnase Dnase | フリーUSA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml遠心分離管ファ | ルコン | 352099 | |
| 70%エタノール | フィッシャー100 | ||
| %エタノール | ッシャー200 | ||
| µl ピペットチップ | レイニン | GPL200F | ホモジナイザーブレードのクリーニング用 |
| クロロホル | ムフィッシャー | BP1145-1 | |
| ナノドロップ | サーモ | ND-1000 | 分光光度計 |
| バイオアナライザー | アジレント | キャピラリー電気泳動アナライザー RNAインテグリティ | |
| を測定する RNAlater | Ambion | RNA 安定化試薬 | |
| RNeasyの スピンカラム | Qiagen | Spinカラム miRNeasy Miniキットの一部として | |
| マウス | Chales River | Strain C57BL/6 | 彼らの年齢は4ヶ月から12ヶ月の範囲でした。 |
| マウス | ジャクソンラボ | 129株 | 彼らの年齢は4ヶ月から12ヶ月の範囲でした。 |
参考文献
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J.
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再版と許可
