この記事は、生化学的および免疫細胞化学的分析のための純粋な軸索サンプルを大量に取得するために使用できるニューロン培養システムについて説明しています。この技術により、正常な軸索生理学と神経変性につながるシグナル伝達経路の理解を深めることができます。
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この記事について
サマリー
要約
ニューロンの軸索は、特定のメカニズムを使用して伸展を仲介し、完全性を維持し、変性を誘発します。これらの事象の適切なバランスは、機能的なニューロン回路を形成するために必要です。ここで説明するプロトコルは、多孔質膜(フィルター)を有する細胞培養インサートを使用して、従来の生化学的または免疫細胞化学的手法による検査に適した純粋な軸索調製物を大量に得る方法を説明しています。これらのフィルターインサートの機能は、胚性後根神経節の外植片を使用して、発生剪定とウォーラー変性のモデルで実証されます。軸索の完全性と機能は、さまざまな神経変性疾患で損なわれます。実際、軸索機能障害は、いくつかの神経変性疾患におけるニューロン体細胞の喪失よりも、疾患の経過のはるかに早い段階で現れることが今では明らかであり、軸索特異的プロセスが主にこれらの疾患で標的とされていることを示しています。分子的および生化学的手法による分析のために純粋な軸索サンプルを取得することにより、この技術は、軸索の生理学および病態生理学を調節するメカニズムに新たな光を当てる可能性を秘めています。これは、神経系の変性疾患を引き起こすプロセスの理解に影響を与えます。
概要
神経細胞の軸索の区画は、体性樹状区画から機能的自立度が大きく表示されます。投射ニューロンでは、軸索は、神経タンパク質1,2のほとんどが含まれています。最近の研究では、早期の軸索の機能障害は、神経変性疾患や精神神経疾患3の共通の特徴であるように思われることが示されているので、軸索の生理学および病態生理学の研究では、神経科学のコミュニティで勢いを得ています。これは、正常および病的条件下における軸索独占的メカニズムのよりよい理解が機能障害を運転初期事象を解明する可能性が高いようです。
この議定書は、生物化学的に適しており、免疫細胞化学分析の純粋な軸索材料を大量に取得するために多孔質膜（フィルター）を有する培養インサートを使用する方法について説明します。軸索生物学を研究するためのフィルターインサートの使用は、最初のスチュワードによって実装され、同僚4、さらにその現在の構成にトウィスと同僚5によって開発された。技術が研究されたニューロンの集団に対応するために、それぞれの場合にわずかな変更を加えて、軸索と樹状突起生物学のさまざまな側面を研究するグループによる、現在使用中である、行わトリートメント、生化学的分析のタイプは6-9を使用していました。この議定書は、アプリケーションのような様々なすべての選択肢に対応するつもりではなく、ほとんどのアプリケーションに適しています簡単な方法を提供していません。具体的には、ここで説明するプロトコルは、撤回し、栄養因子9から奪わとき速く退化少ない軸索を生産生化学分析のための軸索の歩留まりを最大化し、文献に記載された軸索変性、他のコーティングを勉強するのに最適であるトリプルコーティングを使用しています。
この手順では、神経細胞体は、フィルターの上に分離されたままのWHパリの軸索は、孔を通過し、その底面に沿って成長する。フィルタの下面に成長する（グリアおよびニューロン細胞体の混入物を含まない）純粋な軸索 は、生化学分析のために収集することができ、またはその場で固定し、免疫細胞化学的技法9により調べることができる。手順は、後根神経節（DRG）からの胚性感覚ニューロンの使用に依存している。神経成長因子（NGF）に維持するとき、これらの細胞からの神経突起は、インビトロで迅速かつ強固な増殖を受けるので、この要因を奪われたとき、彼らは急速に変性を受けるため、胚性DRGを広く軸索の生物学を研究するために使用される。この方法で収集されたすべての神経突起は、純粋に軸索になるように、また、DRGニューロンは、樹状突起を欠いている。
フィルタインサートは、軸索を研究するために使用される他のアプローチに比べて大きな利点を示す。 Aのものとは細胞体で発生するプロセスを区別するために顕微鏡を使用することに頼った研究xonsは、限られた生化学的な情報を提供します。別の例として、区画化培養システム（ 例えば 、Campenotチャンバー10又はマイクロ流体デバイス11）は、撮像アプローチのためおよび細胞区画の差分治療に有用であるが、軸索の材料を少量しか提供し、必要とする生化学的分析のためのこれらの技術の使用を排除する試料の比較的大量。また、それらの使用はかなりの訓練並びに特殊な装置を必要とし、それらは時間がかかる。多くの場合、外植片からの軸索を単離するために使用される別のアプローチは、手動で、軸索試料収集の前に（ニューロン細胞体を含む）を外植片の中心部を除去することである。これは軸索に富む準備を大量に生成することができますが、この準備の軸索は、グリアに包まれ、急速に連続して（最小限の実験の例として）6ウェルから20外植片の本体を取り外すことができ、時間がかかり、実現可能性の限界にある。
対照的に、ここに示された方法は、次いで、ウェスタンブロット、免疫沈降6、ノーザンブロット5質量分析計6、RNA精製の ような一般的に全細胞溶解物を分析するために使用される実質的に任意の生化学的手法で分析することができ、豊かで純粋な軸索 の製剤を生成する7,12,13等が挙げられる。それはさらに、IFによってそれらを調べるために、フィルタの下側で成長する軸索を固定することができるように、また、このプロトコルは、免疫蛍光（IF）技術を適用することができる。ない細胞体は、最終的な準備ではありませんので、このアプローチは、大幅に軸索固有のプロセスの分析を容易にします。細胞体からの高免疫蛍光信号は、多くの場合、軸索のような薄い構造から生じる弱い信号の検査および分析を損なうので、これは重要な利点である。
軸索変性ARを研究する培養方法の2つのアプリケーションE説明し;発達剪定や損傷誘発変性のモデルのモデルは、（一般的にウォーラー変性と呼ばれる）。発達剪定のモデル化は、 生体内での感覚ニューロンがターゲット由来のNGFの量を制限し、それらが十分な栄養サポート縮退14の受信に失敗のために競争するという事実に基づいています。この現象は、インビボで起こるように、細胞体の破壊に続いて軸索変性を開始し、培養培地からNGFを引き出すことによって、胚DRG培養物に模倣することができる。ウォーラー変性をモデル化するために、細胞体を持つフィルタの上面が削り取られている。物理的に細胞体から分離し、その後、最初の1850年16現象を報告したA. Wallerの名にちなんで名付けウォーラー変性症15、として知られている迅速かつステレオタイプ変性過程を経るとなり、フィルタの下側に成長していた軸索。
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プロトコル
注：以下の手順は、動物管理のカナダ人評議会によって承認されたガイドラインに従っている。すべての努力は、処置中の疼痛および動物の苦痛を最小限にするために行われる。
フィルタの1。コーティング
注：培養フィルターインサートがマルチウェルプレートのウェルに配置された場合、二つの区画が定義されています。トップのコンパートメントは、挿入の上の領域であり、ボトムのコンパートメントは、挿入図1A.ab下の1である。外植片を、それらがフィルタの上側に取り付けられる上部コンパートメントに播種する;多くの軸索は、フィルターを通して成長し、底部区画図1A.c内に、フィルタの下側に延びている。 （ すなわち、コーティング液、洗浄液、培養培地などを適用するための）標準ワーキングボリュームは上部区画のために底部区画2および1mlであり、「のようなプロトコルで言及されようとしている;標準ボリューム」。インサートとウェルの側面との間の隙間にピペットの先端を配置することによって、ボトムのコンパートメントで始まるソリューションを追加します。フィルターの底にトラップされる気泡を防止するためのソリューションを分配しながらも、一方の側に挿入を傾ける。
- フィルターをメッキ前日にコーティング開始します。滅菌組織培養フードの下で、6ウェル受けプレートに24ミリメートルフィルターインサートを配置します。一番下の区画に2ミリリットルとトップでの1ミリリットル：標準ボリュームを使用して室温で1時間、水中のポリ-D-リジン（1ミリグラム/ ml）で挿入をインキュベートする。
- 吸引ポリ-D-リジン、水で1回すすいでください。吸引水、ふたを閉じて、フードのO / N中で乾燥プレートを残す液体の吸引中に、直接、フィルタの下に閉じ込められた液体の残骸を削除してください。
- 翌朝、水にラミニン（10μg/ mlの）を希釈して混ぜて暖かい37℃でCELにラミニン1時間で挿入をインキュベート標準ボリュームを使用して37℃でLインキュベーター、。
- 吸引ラミニン、水にコラーゲン（0.1 mg / mlの）を追加し、室温で1時間インキュベートする。この場合、最上部のコンパートメントのために一番下の区画のための2ミリリットルと2ミリリットルを使用しています。
- 吸引コラーゲン、滅菌水で1回洗浄する。 STEP 3に記載されるようにフィルタが、現在培養培地およびDRG外植片を受信する準備ができている。
2。解剖胚後根神経節（DRG）外植片
- アベルチン（250 mg / kg）のIP注射により13日間の妊娠雌マウスを麻酔。 10〜15分待ってから、角膜とペダル撤退反射の欠如を確認してください。反射神経が存在しないと、頸椎脱臼を行う。
- 70％エタノールですべての手術器具と女性の腹部を消毒。楽器を乾燥させる。腹部の皮膚を保持し、腹腔を露出させ、皮膚と筋肉の層を通ってカット。
- 子宮頸部および卵巣から取り外すことにより、子宮を除去します。殺菌中ル·フード、ハサミで子宮から胚を除去し、氷冷L15メディアで満たされたペトリ皿にそれらを収集。氷の上においてください。
注：妊娠17,18の13日の胚を取得する方法についての詳細は、以前の技術レポートをご参照ください。 - 顕微鏡下で、側に胚を置き、頭部を取り除くために、小さな春のはさみを使用しています。胸、腹、手足や尾を廃棄するように側面に沿って切開する。背骨を含む背中を保つ、腹側を上に置き、すべての内臓を取り除く。
- 小さな春のはさみで、正中線に沿って腹側から脊柱を切断することにより、脊髄全体を公開します。鉗子の1組（＃3）でカーカスを押しながら、その最も頭側視点で脊髄を保持するために第二の対を使用しています。
- ゆっくりと静かに椎骨の空洞からコードを引き出し、超薄型鉗子（＃5）を使用して、脊髄からのDRGをピンチオフ。グループDRGを上で収集される皿の底。
- その開口部を拡大するために切断された200μlのピペットチップで吸引することによりグループ化されたDRGを収集します。チューブ内のDRGを置き、DRGの収集が完了するまで氷上にしておきます。
注：DRGを、この先端部の壁面に付着しないので（標準黄色チップと比較して）ホワイト/透明ヒントが好ましい。使用前にメディアとヒントをフラッシュすると、さらにその壁に付着するのDRGを防ぐことができます。
フィルターに3。播種し、後根神経節外植片のメンテナンス
- 標準ボリュームを使用してコーティングされたインサートに37℃で完全DRGのメディアを追加します。 NGFのないトップのコンパートメントを維持しながら、NGFの15 ng / mlの底の区画メディアを補完する。
NOTE：NGFを効率的にフィルタを横切って拡散し、その濃度は時間以内に平衡が、我々は直接播種する前に、底部区画にNGFを適用すること有意Bの軸索の収率を増加させることを観察したフィルターのottom表面。 - その開口部を拡大するためにトリミングされたチップで千μLピペットを用いてフィルターにチューブからのDRGを転送します。
- のDRGを収集する前に、先端2〜3倍にメディアを描画します。これは、先端の内側に付着するのを防ぐことができます。同じチップを全てのウェルに再使用することができる。 （標準ブルーチップに対して）無着色のヒントを使用すると、先端面にDRGの付着を低減します。
- のDRGを転送するには、800μLのピペットを設定します。吸引除去フィルタの上側からのメディアの約200μlを、そしてDRG-含むチューブに移動して、上下に小さな体積をピペット - 底に沈めてきたのDRGを再懸濁する。全編、インサートの中央に先端を沈めるピペットのDRGを吸引。
- 一度すべての挿入がロードされ、プレートの蓋を閉じて、プレート10倍渦巻、各スワール間フードベンチに静かに叩く。これらの動きはDRG外植片シンク支援することにより、軸索の収率を増加させフィルターに付着する。これはまた別の外植片からの軸索が重ならないように均等に外植片を分配するのに役立ちます。
注：前の手順で説明した外植片の播種手順が大幅に（75％まで）基板に外植片の添付ファイルの全体的な速度を増加させる。最も重要なことは、ピペットする手順を容易に媒体表面上に浮遊代わりに、インサートの底に沈んでから外植片を防止する。 - 生化学的分析のために、フィルターごと（30前後）1胚からのシードのDRG。形態学的分析のために、半分または1胚（10〜15）からのDRGの第三のいずれかを使用する。チューブのすべてのDRGは、（それが30、15、または10のDRGであるかどうか）単一のウェルに播種されるように、この決定は、チューブにDRGをを収集する前に行わなければならない。
- 2〜3日ごとにメディアを変更し、37℃で細胞培養器内の文化を維持している。メディアを変更するには、下のコンパートメントに続いて、最初のトップのコンパートメントを吸引する。標準ボリュームに新鮮な培地を追加下部コンパートメントから始まるのです。
注：乾燥から細胞/軸索を防止するために、同時に複数の3の挿入にメディアを変更しないでください。 NGFの存在下でフィルター上に成長したDRGを培養液中で2日後に2ミリメートルまで到達し、長い軸索を拡張します。
4。栄養因子撤退トリートメント
NGFの撤退は最初の撤退後の約12時間後に表示されます（位相差とβ-III-チューブリンIFによって決定）軸索の断片化と軸索変性を誘導する。完全な断片化は、36時間までに達成される。どのくらい変性は進行したままにする実験計画に従って、エンドユーザによって選択されなければならない。
- NGFを欠いており、残りの（または内因性に産生される）、NGFを隔離する抗NGF抗体（1μg/ mlの）が含まれているメディアへの上部と下部の区画からの2日間の軸索伸長相、変化媒体の後。
- 可能にするために細胞インキュベーター（37℃）にプレートを戻す所望の時間進行さNGF離脱誘発性の変性。
- ウェスタンブロットによる検査のためにタンパク質抽出する（ステップ6）を行って、または直接場合（ステップ7）することで、フィルタを調べます。
ウォーラー変性を誘導するために5。軸索切断
この手順は、それらの細胞体から離脱フィルタの下側に軸索を残し、それ以外は無傷。その後、これらの軸索は急速ウォーラー変性を開始する。最初の切断後3時間で表示されます（IF位相コントラストまたはβ-III-チューブリンによって証明）軸索断片化; 9時間で、軸索は完全に断片化され、フィルタから切り離されています。どのくらい変性は進行したままにする実験計画に従って、エンドユーザによって選択されなければならない。
- 細胞スクレーパーで、成長したDRG外植片を含む、フィルターの上側をこすり。 X軸、Y軸、および円形にスクレーパーを移動することで、トップの材料の完全な除去を確実方向。
- フィルターから掻き取り、NGF（10 ng / mlの）を含む予め温め、完全のDRG培地1mlと交換された浮遊植片を含むトップのコンパートメントからメディアを捨てる。
- ウォーラー変性がエンドユーザによって選択された時間だけ進行させるためにインキュベーター（37℃）、細胞をプレートに戻す。
- ウェスタンブロットによる検査のためにタンパク質抽出する（ステップ6）を行って、または直接場合（ステップ7）することで、フィルタを調べます。
軸索のサンプルの6。タンパク質抽出
- レムリ試料緩衝液の75μlのコレクションチューブ（1.5ミリリットル）を入力します。フィルタのセット全体から軸索を収穫しながら、氷の上でチューブを保持します。
- PBSにDRG外植片でフィルターを洗浄し、フィルターの上側をこすり。プレートからカバーを取り外し綿チップアプリケーターでフィルターの上面をきれいにし、上側と下側から余分なPBSを吸引除去する。
- 場所インサート逆さまベンチに鋭いメスを用いて、インサートからフィルタをカット。鉗子、ボトムアップのフィルタを保持する。はさみでフィルタの中心周から切断を行う。
- 収集チューブの上に置き、フィルタ、およびピンセットで、チューブダウンフィルタの中心を押してください。これを実行しながら、漏斗が形成すべきである。それはLaemmliサンプル緩衝液中に浸漬されるように、チューブの底部に漏斗状のフィルタを押してください。
- 4分間のチューブを煮沸完全なタンパク質の抽出。管の上部に上下逆に配置する鉗子を使用し、簡単なスピン（15秒2000 XG）を実行するフィルタを削除します。乾燥したフィルターを廃棄します。
- 目的のタンパク質を検出するために、ウェスタンブロットに続くSDS-PAGEにおける軸索タンパク質調製液10μlを解決します。
NOTE：参考として、20外植片を2日間増殖させ、RIPA溶解緩衝液100μlで溶解製剤からの軸索は4-6のタンパク質濃度を有する。μgの/μL。
フィルターに軸索の7。免疫蛍光検査
次の手順は、β-III-チューブリンの検出により例示フィルターインサート上で染色した場合に実行する一般的な操作の概要を説明します。固定剤、インキュベーション時間、濃度およびその他の詳細は、他の抗原抗体対に対して最適化されるべきである。
- インサートの次の洗浄およびインキュベーションのために完全に洗浄以前に使用した6ウェルプレートを利用する。
- 簡単に言えば、PBS中のインサートを洗う。シェーカー上で室温で10分間PBS中の新たに調製した4％パラホルムアルデヒドで固定します。
- 固定後、フィルターの下面に排他的に成長した軸索を収集するために、インサートの上面をこすり、清掃。 IFのための標準的なインキュベーションを進める。
- 穏やかに振盪しながらRTで1時間、標準的なボリュームを使用して、（TBS、0.05％のTween20、5％スキムミルク）をブロッキング溶液中にインサートをインキュベートする。
- 転送は、標準的なボリュームを使用して、バッファー（抗β-III-チューブリン、1:5,000）をブロックで希釈した一次抗体に挿入されます。穏やかに振盪しながら4℃でO / N（〜18時間）インキュベートする。
- PBSで2回、第一の抗体（室温で2×10分間）洗浄します。
- 転送は、標準的なボリュームを使用して、（1:2,000をヤギ抗マウス）を、ブロッキング緩衝液中に希釈し、蛍光結合二次抗体に挿入する。穏やかに振盪しながら室温で2時間光から覆わインキュベートする。
- PBS（室温で3×10分）で、二次抗体3回洗浄します。
- IFが完了したら、出挿入取る最後の洗浄から、PBSを離れて注ぎ、綿チップアプリケーターでフィルターの上面を清掃してください。上側と下側から任意の液体を吸引する。
- 場所はベンチに上下逆に挿入して、鋭いメスでインサートの外にフィルタをカット。
- 、ピンセットでフィルターを保持するまで下振れし、顕微鏡スライド上に配置します。カバーガラスと蛍光互換MOUとオーバーレイntingメディア。光から覆わ低温室で乾燥フラットを、してみましょう。検査し、蛍光顕微鏡を用いて画像を取り込む。
NOTE：4℃で保存し、光から保護した場合、これらの製剤は、蛍光の損失を最小限に抑えて週間にわたって維持することができる。 - オプション：別の方法として、IFが挿入から削除されたフィルタで実行することができます。そのためには、直接、固定後のフィルターの上側をこすりして清掃してください。
- 6ウェルプレートの底に鋭いメスで、場所フィルター軸索アップしてインサートからフィルタを取る。
- 7.4から7.8と7.11に示すように、その後、IFのためのインキュベーションを行う。この代替の利点は、例えば、インキュベーションボリュームが（7.1から7.11に示すようにフィルターを直接インサート上で染色されているときに使用される3ミリリットルと比較して）500μLにまで行くことができ、ので、それは、試薬を保存することです。
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結果
E13.5マウスから後根神経節外植片を培養液中で2日以内に、2ミリメートルまで到達し、フィルター上で広範囲にポリ-D-リジン、ラミニンおよびコラーゲン（ 図1B、左）でコーティングされた順に成長する。この基質の組み合わせは、特に熱狂的な成長をもたらす。他の組み合わせは、かなり短い軸索得た（ 図1B、右）。また、フィルターに保持さDRGをプラスチック図1c上に成長したDRGよりも長い軸索を伸ばす。
このプロトコルで使用される、直径1μmの細孔を有するフィルター、許可神経突起は孔を通って成長し、底面に拡張しながら、フィルターの上側に細胞体を保持します。これは明らかに核について染色したフィルタの落射蛍光顕微鏡（DAPI）およびβ-III-チューブリン図1Dに示されている。無傷のフィルタでは、ニューロンおよび非両方から、細胞核を観察することが可能であるそこから外植センターおよびいくつかの照射に集中して神経細胞、。しかし、フィルタの上面側が削られた場合に、...
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ディスカッション
この技術を適応させる際に考慮すべき重要なパラメータは、検討するニューロン集団は、基板、フィルターの細孔径および表面積を含む。これらのすべてのパラメータが得られ、神経突起の準備の特異性、質と量に影響を与える、とエンドユーザーが慎重に検討されなければならない。このプロトコルで示す実施例では、DRGニューロンの使用は、純粋な（特定の）軸索の製剤を与えるだけ軸索を伸長するという利点を有する。
胚のDRG軸索の成長が非常に速い軸索のサンプルは、培養中のわずか2日後に調製することができるように、中枢神経系のニューロンと比較される。 1μmの孔径は、成長する軸索の効率的な通過を可能にしながら、底面に移動するの細胞体を防ぐために十分に小さいことが証明されている。利用可能な小さいサイズ（ すなわち 0.4ミクロン）に比べ、薄い軸索に対する選択性を課しません。DRG外植片の研究のために、（6 - ウェルプレートに使用するための）24ミリメートルフィルタインサートは、しばしば、タンパク質の入力を多量に必要とする免疫沈降、を含むほとんどの技術は、軸索のためのタンパク質試料の十分な量を生...
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
このプロジェクトは、カナダ衛生研究所からの助成金MOP62827によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| CD-1マウス、E13時限妊娠 | ルズリバー | では、マウスを交配し、膣栓をチェックすることで時限妊娠を行うことができます(E0日目) | |
| ファルコン細胞培養インサート | コーニング | 353102 | 1&マイクロ;m孔径、6ウェルレセプトプレートに適合 |
| ファルコン細胞培養コンパニオンプレート | コーニング | 353502 | インサート用レセプティングプレート |
| ポリ-D-リジン | Sigma-Aldrich | P6407 | 水中1mg/mlで使用します。一度再利用できます。 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 10 & micro で使用。g/mlの水で。-80 °から100倍のストックを取ります。Cと4°でO / Nを解凍します。C |
| PureCol ウシコラーゲン溶液 | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | DMEM |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, β subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| 抗NGF抗体 | Acheson, A. et al. 線維芽細胞およびシュワン細胞における脳由来神経栄養因子様活性の検出:NGFに対する抗体による阻害。ニューロン。7、265-75、(1991)。 | ||
| Alomone Labs | AN-240 | 市販オプション | |
| 抗チューブリン抗体 | ミリポア | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 ヤギ 抗マウス抗体 | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG 培地 | |||
| Neurobasal Medium 2% B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1% Penicillin-streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (底部コンパートメントのみ) | |||
| 1x Laemmli sample buffer | |||
| 2% SDS 50 mM DTT 60 mM Tris (pH 6.8) 5% Glycerol 0.01% (w/v) ブロモフェノールブルー |
参考文献
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