方法論記事

ラベルフリーDNAハイブリダイゼーション分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ

DOI：

10.3791/51797

⸱

2014年9月10日

 ,  ,  ,  , 
1MEMS Sensors and Actuators Laboratory (MSAL), Department of Electrical and Computer Engineering, Institute for Systems Research, University of Maryland, 2Institute for Bioscience and Biotechnology Research, Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、DNAハイブリダイゼーション検出のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップを提供する。のssDNAプローブ官能化に続いて、特異性、感度、および検出限界は、相補的および非相補的なssDNA標的と研究されている。結果は、3.8 nMでの検出限界で、電気化学システム上のDNAハイブリダイゼーション事象の影響を例示する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マイクロスケールに分析ベンチトップ手順の小型化、反応時間、コスト、及び前処理ステップの統合に関して有意な利点を提供する。それはポイント·オブ·ケア各種疾患のバイオマーカーでのリアルタイム評価のための技術を提供するためのDNAハイブリダイゼーション事象の解析に向けて、これらのデバイスを利用することが重要です。しかし、デバイスのフットプリントは、さまざまな物理現象の増加優位性を低下させる。これらの現象は、加工精度や装置の動作信頼性に影響を与える。したがって、正確な全体的なパフォーマンスを改善するために、再現可能な方法でこれらのデバイスを製造し操作する大きな必要性がある。ここでは、プロトコルおよび製造およびDNAハイブリダイゼーション事象の正確な分析のためのマイクロ流体ベースの電気化学バイオチップの動作に用いられる方法を記載する。バイオチップは2つの部分から構成されています。マイクロ流体チップを搭載した3ポリジメチルシロキサン（PDMS）からなる平行マイクロチャネル、及び3×3配列の電気化学的マイクロチップ。 DNAハイブリダイゼーション事象は、電気化学インピーダンス分光法（EIS）分析を用いて検出される。 EISの分析は、これらの長さスケールでの支配的な電気化学システムのプロパティの監視のバリエーションを可能にします。バイオセンサーの両方の電荷移動と拡散抵抗の変化をモニターする能力によって、私達は20分以下、相補鎖DNA標的に対する選択性は3.8 nMでの計算された検出限界、および他の非相補的ssDNAを13％の交差反応性を実証インキュベーション。この方法は、マイクロスケールの領域における拡散の挙動に解明することによって、およびDNAハイブリダイゼーション事象の研究を可能にすることによって、小型化デバイスの性能を向上させることができる。

概要

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マイクロ流体ラボ·オン·チップ（LOC）のデバイスは、臨床診断、環境モニタリングおよび生物医学研究に多くの利点を提供する。これらのデバイスは、処置の多様な試薬の混 ​​合、結合ベースの親和性、シグナル伝達、および細胞培養を含む1-4に行うことができるチップの領域に流体の流れを制御するためのマイクロ流体チャネルを利用する。マイクロフルイディクスは、マイクロウェルプレートリーダーまたは電気泳動ゲルシフトアッセイのような従来の臨床診断ツールに比べて多くの利点を提供します。マイクロ流体デバイスは、同様のアッセイを実行するために大きさの2から3桁（マイクロリットルとは対照的にナノリットル）より少ない試薬を必要とします。また、これらのデバイスは、いくつかの生物学的事象は、チャネル5,6内の種の小さい閉じ込めに起因し発生することにより、速度を増加させることができる。第三に、センサは、無標識de​​tectioを提供することができるリソグラフィ及びエッチング技術を用いて、マイクロ流体デバイス内に統合することができる。nは。最後に、これらのデバイスは製造が安価であり、7〜10を動作させるために、技術者の一部にはほとんどの作業を必要とします。

ラベルフリー検出は、典型的には、光学的または電気的変換器を用いて行われる。光デバイスが原因サンプル中の分析でより低い干渉により良いセンシング性能を提示することができます。それにもかかわらず、その性能は、サンプルのバックグラウンドは、センサ11と同じ共振波長を有する場合において損なわれる。マイクロ流体システムにおいて生物学的および化学的検出を行うために電気信号を使用することには多くの利点がある。これらのセンサは、一般的にのみ作動するようにパターニングされた電極を必要とするため製造が本質的にあまり複雑である。他の信号のモダリティは、信号12-15に変換するための変換器が必要になることがありながら、また、電気信号は、直接、ほとんどの測定機器とインターフェースすることができます。電気センサーは、一般的にimpedancの変化を測定電子16,17、容量18、またはレドックス活性が19。これらのシステムは小型化されるが、新たな課題が提示される。克服すべき最も重要な課題は、（低いサンプル体積及びレイノルズ数に対する）流体の試料調製、混合、（建設資材と分析物との間の毛管力、表面粗さ、化学的相互作用を含む）の物理的及び化学的効果、低い信号 - を20-23、複雑な生物学的サンプル（ 例えば 、血液および唾液）における電気活性分析物からの潜在的な干渉（縮小表面積および体積によって生成される）信号対雑音比。これらの効果の詳しい調査の結果、彼らの全体的なパフォーマンスを改善だろ再現可能な方法で、これらのデバイスの正確な製造および操作のためのガイドラインになります。

DNAハイブリダイゼーションの検出は、遺伝性疾患24,25とCANCのさまざまな形態を診断するために広く使用されているえー26。毎年、インフルエンザの複数の株は、DNAハイブリダイゼーション技術27からの結果を使用している患者において同定される。インフルエンザウイルスは、米国だけで28人が死亡、毎年36,000を占めています。このような例としては、感度または特異性を犠牲にすることなく低いサンプル体積とし、わずかなコストでプレートリーダーまたはゲルシフトアッセイと同じアッセイ技術を実行することができるベンチトップマイクロ流体デバイスから利益を得ることができる。によるラベルフリー電気化学センシングの多くの利点には、DNAハイブリダイゼーション事象29,30の検出のために広く使用されている。 （ミリメートルの範囲内）マクロスケール電極が関心の溶液ビーカー中に浸漬されている設定は、それらの一致する相補的配列への一本鎖DNA配列の結合キネティクスに関する非常に機密性の高いデータを提供するために使用することができる。最近では、MICR電気化学センシングを組み込んでも数少ない進歩があったDNAハイブリダイゼーションのためのofluidics。研究は、ハイブリダイゼーション動力学31とマイクロ流体チャネルにおける検出するためのセンサ15の統合に関して行われてきた。しかし、依然として複雑な試料調製工程なしで並列にDNAハイブリダイゼーション事象を分析することができる迅速なハイスループットマイクロ流体装置の必要性が存在する。

この研究で提示デバイスは、複数の相互作用が並行して、複雑な試料調製工程なしでスクリーニングされるのを可能にするプラットフォームを提供する。私たちのプロトコルは、電気化学バイオチップは、微小電気機械システム（MEMS）技術32,33で微細加工されているかを、マイクロ流体ベースの紹介。私たちは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）製のマイクロ流体チップ、および電極のアレイで構成される電気化学チップ、両方の製造プロセスを説明する。一本鎖DNAプローブを用いたバイオチップの化学的機能も対処される。最後に、ABIL具体的なssDNA標的を検出および分析するためのバイオセンサーのITYが実証される。全体的に、マイクロ流体ベースの電気化学バイオチップは、迅速かつハイスループット分析技術である。これは、生物学的分子と導電性の変換器間の相互作用を調査するために使用することができ、ラボオンチップ、さまざまな用途に利用することができる。

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プロトコル

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マイクロ流体チップの微細加工1。

  1. 電気化学チップを準備する
    1. 柄ゴールド電極
      1. アセトン、メタノール、及びイソプロパノール（「AMI」クリーン）ブランク4インチシリコンウェハ（プライムグレードの品質）をすすぐ。 N 2銃で乾燥させ、脱イオン水（DI）で、ウェハからイソプロパノールを洗い流す。
      2. プラズマ強化化学蒸着（PECVD）ツールを使用して厚さ1μmのSiO 2パッシベーション層を成長させる。 DCスパッタツールでの金の2000オングストロームの厚さの層に続いて、クロムの200オングストロームの厚さの層を堆積させる。
      3. スピン "PR1"ポジ型フォトレジスト（スピニングパラメータ：3000回転、1000回転/秒、30秒）は、1.6μmの厚さの均一なフィルム〜を作成します。ホットプレート上で100℃で1分間、ウェーハプリベーク。
      4. 190 MJ /フォトマスクを介して405nmの波長でのcm 2のウェハを公開します。 352 devに30秒間ウェハを開発するDIを有するウェハおよびN 2銃で乾燥をeloperとすすぎます。
      5. 1.5分間の金エッチング液で金をエッチングする。 〜30秒間クロムエッチング液でクロムをエッチングする。 DIを有するウェーハをすすぎ、N 2銃で乾燥。
      6. 「AMI」きれいな手順でフォトレジストを除去。
        注：強い酸化剤および潜在的に爆発。
      7. 1 H 2 SO 4：4：4でウェハをクリーニングし、H 2 O 2混合物（ "ピラニア"クリーン）を1分間。 DIを有するウェーハをすすぎ、N 2銃で乾燥。
    2. パターンプラチナ電極
      1. スピン「PR2」ポジ型フォトレジスト（スピニングパラメータ：3000回転、1000回転/秒、30秒）は、1.4ミクロンの厚さの均一なフィルム〜を作成します。ホットプレート上で100℃で1分間、ウェーハプリベーク。
      2. フォトマスクを介して405nmの波長では30mJ / cm 2のウエハを露光する。ホットプレート上で125℃で45秒間ウェハを焼く。洪水公開するを1000mJ /フォトマスクなしで405nmの波長でのcm 2のウエハ。 6の2分間、ウェーハを開発する：1 AZ400K開発者およびDIを有するウェーハをリンスし、N 2銃で乾燥。
      3. 電子ビーム蒸着装置を用いて、白金を1,600オングストロームの厚さの層に続いてチタンの400オングストロームの厚さの層を堆積させる。
      4. アセトンとイソプロパノールですすぎ、続いて5分間超音波アセトン浴中にフォトレジストをオフに持ち上げます。 DIを有するウェーハをすすぎ、N 2銃で乾燥。
  2. アッセイチャネルを準備
    1. アッセイチャネル用の金型を準備する
      1. 「AMI」きれいな手順で空白の4インチシリコンウェハ（テストグレードの品質）をすすぐ。 DIとウェハからイソプロパノールをすすぎ、N 2銃で乾燥させた。
      2. スピン「PR3」ネガ型フォトレジスト（2段階の回転パラメータ：ステップ1 - 600回転、120回転/秒、10秒2のステップ - 1150 rpmで383回転/秒、〜100μmの厚さの均一な膜を作成するための27秒）。ホットプレート上のウエハ（2段階のベーキングパラメータプリベーク：ステップ1 - 300℃/ hrで65℃まで室温から立ち上げ、10分間温度を保持するステップ2 - 95℃まで上昇します。 300℃/時間で30分間温度を保持する）。
      3. 2,500 MJ /フォトマスクを介して405nmの波長でのcm 2のウェハを公開します。ポストベークウェハ300℃/ hrで95℃まで上昇させると、ホットプレート上で10分間温度を保持することによって。プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート（PGMEA）、開発中で10分間、ウェーハを開発する。イソプロパノールでウェーハを洗浄し、そしてN 2銃で乾燥。
    2. アッセイチャネルを製作
      1. 20分間の真空チャンバ内に1ポリジメチルシロキサン（PDMS）混合物（エラストマーを20g、硬化剤の2g）および完全に脱ガス：10を準備する。
      2. アルミホイルでモールドウエハの周囲のエンクロージャを定義して、ゆっくりと未硬化PDMSを注ぐ金型の上。
      3. 箱型炉内のPDMSを有する型焼く（2段階のベーキングパラメータ：ステップ1 - 5分で80℃、室温からランプアップステップ2 - 17分間80℃で保持）。
      4. アルミ箔上のカビや場所からピール離れてPDMS。外科医ナイフでアッセイチップをカットし、生検パンチツールで穴を定義します。

2デバイスを組み立てる

  1. 手動での電気化学チップ上の作用電極とPDMSアッセイチャンネルを合わせます。 PDMSはチャネルを密閉し、漏出を防ぐ、電気化学チップによく付着する。
  2. プラスチック肘やストレートコネクタアダプタ（OD 0.1875 'とID 0.0625' '）として、短いフレキシブルチューブを使用してフレキシブルチューブ（外径0.087'とID 0.015を ''）を接続します。デバイスの穴パンチの入口のそれぞれにコネクタを接続します。
  3. のもう一方の端にシリンジを接続しますチューブとシリンジポンプにシリンジを配置します。交互にセクション3の必要な手順のステップとそれに対応する解決策に従った注射器のセット、チューブ、コネクタを変更してください。

3 DNAハイブリダイゼーションを分析

注：チャネル全体が満たされるまでに200μl/時の流量で流路にゆっくりと各ソリューションを紹介。

  1. 別の一本鎖DNAプローブ配列を持つ各垂直マイクロチャネルを機能化（3つの別個の垂直マイクロチャンネルを並列に実行します）：
    1. それぞれ異なるssDNAのプローブインキュベーション溶液でマイクロチャネルを埋める（10 mMリン酸緩衝液、100mMのNaCl、10μMのトリス（2 - カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）、および1μMのプローブのssDNA）、およびマイクロチャネルをすすぎ、続いて1時間インキュベートPBSで。
    2. 10mMのPBS緩衝液中に6 - メルカプト-1 - ヘキサノール（MCH）の1mMのを含む溶液でマイクロチャネルを充填し、100mMのNaClおよび1.395 mMのTCEP、及びincuPBSでマイクロチャネルをリンスし1時間譲り。
  2. 、PDMSを持ち上げ水平方向に90°回転し、独特のカウンターと基準電極（図S1）を含む各行に反応室の個別の行を公開するダウン置く。
  3. 4倍の対照測定溶液でマイクロチャネルを充填し、生理食塩水クエン酸ナトリウム（SSC）緩衝液を濃縮し、20分間インキュベートする。
  4. バックグラウンド測定は;（作業、カウンタに接続されたポテンショスタットを用いて、参照電極を5mMのPBS溶液中/ 5mMのフェロシアン化をフェリシアンでマイクロチャネルを満たし、（EIS電気化学インピーダンス分光法）、異なる周波数のための電気化学システムのインピーダンス値を記録EISパラメータ：1メガヘルツから0.1ヘルツ、年間あたり10周波数データ点、25 mVの振幅、参照電極に対して5mVの偏光）の周波数範囲。マイクロチャネル内の各作用電極のために、この測定を繰り返します。
  5. （各非相補相補鎖DNAのターゲットに対して実行する）DNAハイブリダイゼーションを測定します。
    1. 4倍の目標のssDNA測定溶液とマイクロチャンネルを満たし、目標のssDNAの1μMを含むSSC緩衝液を濃縮し、20分間インキュベートする。 3.4段階に記載のDNAを測定します。

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結果

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実験装置のための制御可能かつ正確な製造プロセスは、研究に不可欠である。これは、研究者が再現可能なハイスループット実験を得ることができる。ここでは、マイクロ流体ベースの電気化学バイオチップ（ 図1）の高い収率、高い再現性の微細加工プロセスを実証している。低い故障率で、いくつかのデバイスは、溶液の漏れにつながる接合の問題を示している。バイオチップの電気化学的活性を検証するために、サイクリックボルタンメトリー測定は、電気活性酸化還元対フェリシア/フェロシアンで満たされたマイクロチャネルで行われます。 図2は、チップ上の9つの異なる作用電極の再現可能な電気化学的応答を示している。これらの結果は、電気化学的活性は、ハイスループット測定を可能にするバイオチップのすべての9のチャンバで同じであることを示している。

ほとんどのDNAハイブリダイゼーションセンサのssDNAを固定化するセンサー表面上にプローブ。金パターンにマイクロ流体デバイスのための検出電極を使用しているように、チオールは、センサ表面34との強...

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ディスカッション

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私たちの手順は、マイクロ流体ベースの電気化学バイオチップの製造およびDNAハイブリダイゼーション事象の分析のためのその利用を実証する。高収量制御微細加工プロセスを通して、私たちは、電気化学変換器のアレイに統合マイクロスケールチャネルから構成デバイスを開発しています。私たちは、反復的なアプローチを通じて、電気化学チップとマイクロ流体チャネル型のフォトリソグラフィ手順のための制御された処理パラメータを考案した。これらのステップは、他の小型化された分析装置の未来を作成するためのガイドラインを提供しています。重要なことに、それらは信号対雑音比、安定性、感度などのさまざまなバイオセンシングパラメータを最適化する方法を提供する。デバイス製造の後、私たちはユニークな分析の目的を提供し、バイオレセプターとして一本鎖DNAプローブを用いた電気化学振動子を官能。これらの手順は、低デバイスの故障率を実証したが、液漏れが魔女であることを示しデバイスのとDNAハイブリダイゼーションアッセイの実施中に組み立て後のrの問題。このような装置でボンディング不良のさらなる調査は、プロセスの歩留まりを改善し、マイクロバイオシステムの研究のために理想的になるだろう。

...

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開示事項

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著者らは、開示することは何もない。

謝辞

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著者は、財政支援のためにロバート·W·ドイツ財団、防衛脅威削減局（DTRA）、研究とイノベーションの国立科学財団新興フロンティア（EFRI）を認める。著者はまた、クリーンルーム施設のサポートのためにメリーランド州NanocenterとそのFablabに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4インチシリコンウェーハUltrasil4-5664片面研磨。Pタイプ;ホウ素がドープされました。オリエンテーション 1-0-0;厚さ500ミクロン;抵抗10-20オーム·cm
Shipley 1813 フォトレジスト ("PR1")Microchemポジ フォトレジスト
AZ5214 フォトレジスト ("PR2")Hoechst Celanseポジ フォトレジスト
SU-8 50 フォトレジスト ("PR3")Microchemネガ フォトレジスト
金エッチャントトランセンTFA希釈なし
クロム エッチング液トランセン1020AC希釈なし
PDMSエラストマーダウコーニング30973661004PDMS
硬化剤ダウコーニング3097358 1004
生検パンチングツールHealthlinkBP20
タイゴンフレキシブルチューブコールパーマー R 36030.015"
タイゴンフレキシブルアダプターコールパーマー 06417-410.0625インチ
1 ml シリンジベクトン・ディッケンソン301025
一塩基性リン酸カリウムフルカ1551139
リン酸カリウム二塩基性無水シグマRES20765-A7
塩化ナトリウムシグマ・アルドリッチS7653
トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンアルドリッチC4706
6-メルカプト-1-ヘキサノールAldrich 451088
20x 濃縮生理食塩水-クエン酸ナトリウムバッファーSigma93017
ヘキサシアノフェレートカリウム(III)Aldrich455946
Complementary ssDNA #1Integrated DNA Technologies (IDT)100 nmole DNA oligo5'-GGGACGTCCACGGAGCGCTA
TCGGAGCTTT-3'
ターゲット ssDNA #2Integrated DNA Technologies (IDT)100 nmole DNA oligo5'-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA
ATCGATGAGT-3'
Complementary ssDNA #2Integrated DNA Technologies (IDT)100 nmole DNA オリゴ5'-ACTCATCGATTCGTCAATGA
CCTGACCCGT-3'
ターゲット ssDNA #3Integrated DNA Technologies (IDT)100 nmole DNA oligo5'-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA
CCCATGATGA-3'
Complementary ssDNA #3Integrated DNA Technologies (IDT)100 nmole DNA オリゴ5'-TCATCATGGGTCTAACTACT
GGATCTAGGT-3'
Instrument
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD)オックスフォード・インストゥルメンツPlasmaLab System 100チャンバー圧力 1,000 mTorr, Tempreture 200 °C、RF電力20 W、ガス:a)N2O流量710 sccm;b)5%SiH4および95%N2ガスの組成物流量170 sccm、SiO2成長率690Å/min。
DCスパッタリングユニットAJAインターナショナルATC 1800-Vクローム用:チャンバー圧力10 mTorr、アルゴン流量20 sccm、供給DC電源200W、スパッタレート10 nm/分。金の場合:チャンバー圧力10 mTorr、アルゴン流量20 sccm、供給DC電源200 W、スパッタレート36 nm / min。
電子ビーム蒸発システムデントンチタン用にカスタムメイド: チャンバー圧力 < 2 x 10-6 Torr, 電子銃への供給電力 7.5 kW、フィラメント電流 150-200 mA、蒸発速度 6-10 Å/秒。プラチナの場合:チャンバー圧力<2 x 10-6 Torr、e-gun 7.5 kW に電力を供給、フィラメント電流 150-200 mA、蒸発速度 2-3 Å/秒。
ポテンショスタットCHインスツルメンツ660D
シリンジポンプKDサイエンティフィックKDS230

参考文献

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