リンパ節間質細胞の単離は、線維芽細胞網様体細胞、リンパ管および血液内皮細胞を得るための酵素消化と機械的脱凝集を含む多段階の手順です。記載された手順では、短時間の消化と自動機械的脱凝集を組み合わせて、生存リンパ節間質細胞の表面マーカーの劣化を最小限に抑えます。
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この記事について
サマリー
要約
リンパ節を含む二次リンパ器官は、リンパ球の恒常性、活性化、分化のための構造環境を提供する間質細胞で構成されています。接着分子CD31および糖タンパク質ポドプラニン(gp38)、Tゾーン網状細胞または線維芽細胞網状細胞、リンパ内皮細胞、血液内皮細胞、およびダブルネガティブ細胞集団内のFRC様周皮細胞の発現により、さまざまな間質細胞サブセットが同定されています。すべての集団について、異なるコンパートメントの分離とライニング、異なる細胞タイプの引力と相互作用、排出流体のろ過、リンパ管の収縮など、さまざまな機能が説明されています。ここ数年、さまざまなグループが、宿主にとって潜在的に危険な細胞傷害性T細胞応答のオーケストレーションと調節における間質細胞のさらなる役割について説明しています。
リンパ節は、多くの異なる細胞タイプを持つ複雑な構造であるため、目的の細胞集団を分離するための適切な手順が必要です。現在、リンパ節間質細胞の単離のためのプロトコルは、さまざまなインキュベーション時間での酵素消化に依存しています。しかし、間質細胞とその表面分子はこれらの酵素に感受性があり、その結果、表面マーカーの発現が失われ、細胞死が起こります。ここでは、リンパ節間質細胞の生存可能な単一細胞懸濁液を得るための自動化された機械的破壊と組み合わせた短い酵素消化プロトコルが提案されています。
概要
リンパ節は、外国と自己抗原に対する適応免疫応答が開始され、調整されている特殊なコンパートメントである。ここに提示手順は、リンパ節単一細胞懸濁液を得て、いくつかの分子の表面発現を維持する実行可能な節間質細胞へのアクセスを得るために自動化された機械的ピペッティングと組み合わせる短い酵素消化を記載している。
リンパ節間質細胞、リンパ節の足場を形成し、三つの主要な機能を果たす：最初それらは存在する抗原、病原体およびそれらの病原体関連分子パターン（PAMPに）、ならびにサイトカインおよび危険性関連分子パターン（DAMPS）をサンプリングするために体液をフィルタリング体内で。第二に、それらが相互作用し、適応免疫応答を開始するための抗原提示細胞（APC）およびリンパ球を誘引し、指示する。第三に、それらは、リンパ球1の恒常性および分化のための構造的な環境を提供する-3。炎症リンパ節間質細胞は、成長因子、サイトカイン及びケモカインを産生中に、樹状細胞（DC）との相互作用を整理することにより、T-およびB細胞膨潤に適応する。免疫応答のオーケストレーションは、異なる間質細胞集団によって形成される複合体の構造的アーキテクチャにのみ可能である。
リンパ節間質細胞は、CD45陰性細胞で、線維芽細胞および内皮細胞においてCD31の発現またはGP38によって1-6を区別することができる。 GP38 ....
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プロトコル
このビデオ出版物およびプロトコルでは、すべての動物手順は州立機関バーゼル=シュタット、スイスで承認された動物プロトコルに従って行った。
1。リンパ節の準備と消化
- 加熱プレートとマグネチックスターラー上で37℃にビーカー内の前の熱水。
- 次のような基本的なミディアムを準備したDMEM培地（ピルビン酸なし）、2％FCSを補充し、1.2mMのCaCl 2およびペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン100単位、ストレプトマイシン100μgの）。
- 使用前にすべての解剖器具を滅菌する。
- CO 2窒息あたりのリンパ節ドナーマウスを安楽死し、無菌的にリンパ節を解剖。周囲の脂肪を解剖しないでください。注：このプロトコルは、末梢皮膚流入領域リンパ節（鼠径、上腕、腋窩）に最適化されています。
- 2ミリリットルの氷冷塩基性媒体を含む滅菌ペトリ皿にリンパ節を配置します。
- リンパ節CAを混乱させる1mlシリンジに固定された2つの25のGの針を使用してpsule。
- 1 mg / mlのコラゲナーゼIVおよび40μg/ mlのDNアーゼIを補充した750μlの基本培地を含む5ミリリットルのポリプロピレン丸底チューブ内の破壊されたリンパ節組織を転送
- 各チューブ内の1つの無菌磁気攪拌機を追加します。
- ....
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結果
現在のプロトコルが原因自動化されたマルチチャンネルピ ペットで機械的に解離に短い消化時間（45分以内）にリンクら 、2007 6によって公開修正された消化プロトコルです。また、手順はより標準化され、異なるリンパ節間質細胞上の表面マーカーの劣化を最小限に抑え、同時に複数のサンプルの処理を可能にする。
コラゲナーゼIVおよびコラゲナーゼDリンクプロトコル6と現在のプロトコルまたはコラゲナーゼP内およびディスパーゼFletchersプロトコルでの13リンパ節間質細胞の生存率を維持し、CD45、GP38およびCD31を含むいくつかの表面マーカーの消化を惜しま。テストするために現在のプロトコル、腋窩、上腕および鼠径リンパ節を取り出し、それらの間質細胞を単離するために消化した。 CD45、GP38およびCD31発現の分析を、C57BL / 6メートルから分離されたTRC、LEC、BECおよびDN細胞の存在を実証した氷（ 図1、ゲート戦略）。
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ディスカッション
リンパ節間質細胞の研究は、最近公開された消化による2プロトコル6,13の開発に研究の焦点となった。両方のプロトコルは、単一のリンパ節間質細胞を獲得するのに十分であるが、消化酵素と消化の時間の使い方が異なります。間質細胞およびそれらの表面マーカーは、酵素消化および機械的応力に敏感であるため、最適化されたプロトコルが必要とされる。
新鮮に解剖し、リンパ節から実行可能なリンパ節間質細胞の単離は、表現型および機能解析を実行するための最初のステップです。したがって、慎重に安定した温度及び示された時間のために、酵素の規定された濃度で消化することが重要である。二つ消化プロトコルがしかしかなり長い消化ステップで、6,13に記載されている。消化の時間を短縮するために、機械的な分解が含まれ、マルチチャネルピペットを用いて標準化した。上の現在のプロトコルの利点の電子はしたがって、消化酵素とのインキュベーション時間を最小限に、わずか45分で間質細胞の単離を可能にすることである。また、消化中の一定の撹拌は、リンパ節構造への消化酵素の最適なアクセスを可能.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
著者は、現在のリンパ節消化プロトコルを確立するための有益な議論を提供してくれたSanjiv Lutherとその同僚に感謝します。この作業は、SNFの助成金PPOOA-_119204およびSWRへのPPOOP3_144918によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | 最終濃度 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | 最終濃度 1.2 mM |
| コラゲナーゼ IV | Worthington Biochemical Corporation | > 1 mg 乾燥重量あたり 160 単位、最終濃度 1 mg/mL で使用 | |
| ラゲナーゼ D | ロシュ | 11088882001 | 3.5 mg / ml |
| DNAse I | Roche で使用します。 | 11284932001 | 40&マイクロで使用します。g / ml |
| 攪拌磁石 | FAUST5mm | 長-2mmø | |
| ポリスチレン丸底チューブ 5ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| 加熱機能付きマグネチックスターラー | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| ペトリ皿 100 mm、滅菌TPP | 6223201 | ||
| 25 G 針 | テルモ | ||
| 抗マウス CD45 Ab | バイオレジェンド | クローン 30-F11 | |
| 抗マウス CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| 抗マウス ポドプラニン Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| 抗マウス CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel | Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 & マイクロ;l max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD 固定可能近赤外死細胞染色キット | Invitrogen | L10119 |
参考文献
- Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
- Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).<....
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