方法論記事

ネズミリンパ節間質細胞の単離

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DOI：

10.3791/51803

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2014年8月19日

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1Department of Biomedicine, Immunoregulation, University of Basel and University Hospital Basel

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

リンパ節間質細胞の単離は、線維芽細胞網様体細胞、リンパ管および血液内皮細胞を得るための酵素消化と機械的脱凝集を含む多段階の手順です。記載された手順では、短時間の消化と自動機械的脱凝集を組み合わせて、生存リンパ節間質細胞の表面マーカーの劣化を最小限に抑えます。

要約

リンパ節を含む二次リンパ器官は、リンパ球の恒常性、活性化、分化のための構造環境を提供する間質細胞で構成されています。接着分子CD31および糖タンパク質ポドプラニン(gp38)、Tゾーン網状細胞または線維芽細胞網状細胞、リンパ内皮細胞、血液内皮細胞、およびダブルネガティブ細胞集団内のFRC様周皮細胞の発現により、さまざまな間質細胞サブセットが同定されています。すべての集団について、異なるコンパートメントの分離とライニング、異なる細胞タイプの引力と相互作用、排出流体のろ過、リンパ管の収縮など、さまざまな機能が説明されています。ここ数年、さまざまなグループが、宿主にとって潜在的に危険な細胞傷害性T細胞応答のオーケストレーションと調節における間質細胞のさらなる役割について説明しています。

リンパ節は、多くの異なる細胞タイプを持つ複雑な構造であるため、目的の細胞集団を分離するための適切な手順が必要です。現在、リンパ節間質細胞の単離のためのプロトコルは、さまざまなインキュベーション時間での酵素消化に依存しています。しかし、間質細胞とその表面分子はこれらの酵素に感受性があり、その結果、表面マーカーの発現が失われ、細胞死が起こります。ここでは、リンパ節間質細胞の生存可能な単一細胞懸濁液を得るための自動化された機械的破壊と組み合わせた短い酵素消化プロトコルが提案されています。

概要

リンパ節は、外国と自己抗原に対する適応免疫応答が開始され、調整されている特殊なコンパートメントである。ここに提示手順は、リンパ節単一細胞懸濁液を得て、いくつかの分子の表面発現を維持する実行可能な節間質細胞へのアクセスを得るために自動化された機械的ピペッティングと組み合わせる短い酵素消化を記載している。

リンパ節間質細胞、リンパ節の足場を形成し、三つの主要な機能を果たす：最初それらは存在する抗原、病原体およびそれらの病原体関連分子パターン（PAMPに）、ならびにサイトカインおよび危険性関連分子パターン（DAMPS）をサンプリングするために体液をフィルタリング体内で。第二に、それらが相互作用し、適応免疫応答を開始するための抗原提示細胞（APC）およびリンパ球を誘引し、指示する。第三に、それらは、リンパ球1の恒常性および分化のための構造的な環境を提供する-3。炎症リンパ節間質細胞は、成長因子、サイトカイン及びケモカインを産生中に、樹状細胞（DC）との相互作用を整理することにより、T-およびB細胞膨潤に適応する。免疫応答のオーケストレーションは、異なる間質細胞集団によって形成される複合体の構造的アーキテクチャにのみ可能である。

リンパ節間質細胞は、CD45陰性細胞で、線維芽細胞および内皮細胞においてCD31の発現またはGP38によって1-6を区別することができる。 GP38 + CD31が- （もFRCとしても知られ、TRC、：線維芽細胞細網細胞）、Tゾーンの網状細胞を定義して、GP38 + CD31 +がリンパ管内皮細胞（LEC）を定義して、GP38 - CD31 +は、血液内皮細胞（BEC）を定義します。さらに、集団の特徴付けは、他のリンパ節間質細胞の存在が明らかになった。実際、小周皮細胞様細胞集団内で特徴づけられたGP38 - CD31 -人口7。したがって、単離手順の適応は、異なるリンパ節間質細胞の機能的特性の同定および特徴付けのために有利である。

リンパ節間質細胞消化の開発の前にリンパ節間質細胞の研究は、組織切片や顕微鏡を用いてその場観察にに限られていたプロトコル。それにもかかわらず、構造的および機能的研究は、リンパ節間質細胞の重要な特徴を示した。リンパ節間質細胞は、高内皮へのリンパ節の被膜下洞からリンパおよび関連する低分子量タンパク質を輸送する導管システムと呼ばれる複雑な3次元構造を形成するポドプラニン、コラーゲンおよび細胞外マトリックス（ECM）タンパク質と関連しているT細胞ゾーン8に静脈。 DCは、間質細胞と密接に接触している管状詐欺に突出観察することができるduit構造は、流体サンプルと抗原8を検出する。 DCとリンパ節間質細胞（TRCはとのLEC）の相互作用はケモカインCCL21とCCL19 9,10の放出および提示によって媒介される。 CCL19およびCCL21は、リンパ節のT細胞領域4,11に移行するDCおよびT細胞を促進するCCR7受容体によって認識される。類似したケモカインを使用しているにもかかわらず、DCとT細胞は、リンパ節12内に異なった移動ルートを持っている。その後、リンパ節および純粋なリンパ節間質細胞の単離の酵素消化を使用して、機能的研究は、異なるリンパ節間質細胞の役割とDCおよびT / B細胞6,13と相互作用するその能力に基づいて行った。まず、IFN-γ産生エフェクターT細胞及びリンパ節間質細胞間のクロストークは、二次リンパ器官14-16にT細胞応答および増殖を弱めることが示さ代謝産物一酸化窒素の産生を誘導する。第二に、リンパnはオード間質細胞は、IL-10の産17を介して規制DCサブセットの分化を支持すること、およびIL-7 6,18の産生を介してナイーブT細胞の恒常性を調節することが報告されている。第三に、リンパ節間質細胞におけるTLRの発現は、間質細胞は、組織傷害において放出、感染または自己分子に由来する信号の影響を受けやすいことを示唆している。実際に、TLR3ポリリガンドとリンパ節間質細胞の処理は、（I：C）は、結果として共阻害分子PD-L1のではなく、共刺激分子の主要組織適合性複合体クラスIの発現及び上方制御の控えめな上方制御を誘導する末梢組織抗原発現の19の劇的な変化。いくつかのグループが、リンパ節間質細胞は、末梢組織抗原を発現し、自己反応性T細胞19,21-27の寛容を誘導することが示されている。したがって、リンパ節間質細胞および他の遊走および再間の相互作用を理解することsidentリンパ節細胞は、炎症の間に活性化または免疫応答の抑制を可能にする新たな標的分子を見つけるために役立つ。したがって、リンパ節の公開酵素分離の実施が必要である。

以前公開されたプロトコルは、低機械的ストレス6,19,20とコラゲナーゼベースの酵素消化の異なる組み合わせを使用しています。しかし、消化酵素または消化酵素の異なる組み合わせの長いインキュベーションは、活性化状態を分析するために、新たなリンパ節間質細胞を同定するために必要な各種表面分子を劣化させるかもしれない。間質細胞分析の種類に応じて、リンクプロトコルまたはフレッチャー·プロトコルは、より適しているかもしれません。記載された手順では、わずかに短い酵素消化は、実行可能なリンパ節間質細胞の表面マーカーの劣化を最小限にするために自動化された機械的解離と組み合わされる。この手順では、再現性の高い分離を可能にし、低い変動性と95％以上の生存率を有するリンパ節間質細胞集団の区別。新たに単離したリンパ節間質細胞は、 インビトロで直接機能アッセイを実行するために、表面マーカー発現、タンパク質分析、および転写の研究、ならびに間質細胞株の樹立のために使用することができる。

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プロトコル

このビデオ出版物およびプロトコルでは、すべての動物手順は州立機関バーゼル=シュタット、スイスで承認された動物プロトコルに従って行った。

1。リンパ節の準備と消化

  1. 加熱プレートとマグネチックスターラー上で37℃にビーカー内の前の熱水。
  2. 次のような基本的なミディアムを準備したDMEM培地（ピルビン酸なし）、2％FCSを補充し、1.2mMのCaCl 2およびペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン100単位、ストレプトマイシン100μgの）。
  3. 使用前にすべての解剖器具を滅菌する。
  4. CO 2窒息あたりのリンパ節ドナーマウスを安楽死し、無菌的にリンパ節を解剖。周囲の脂肪を解剖しないでください。注：このプロトコルは、末梢皮膚流入領域リンパ節（鼠径、上腕、腋窩）に最適化されています。
  5. 2ミリリットルの氷冷塩基性媒体を含む滅菌ペトリ皿にリンパ節を配置します。
  6. リンパ節CAを混乱させる1mlシリンジに固定された2つの25のGの針を使用してpsule。
  7. 1 mg / mlのコラゲナーゼIVおよび40μg/ mlのDNアーゼIを補充した750μlの基本培地を含む5ミリリットルのポリプロピレン丸底チューブ内の破壊されたリンパ節組織を転送
  8. 各チューブ内の1つの無菌磁気攪拌機を追加します。
  9. 37℃でビーカー内の場所チューブは、水を予熱し、30分間ゆっくりとした速度（1ラウンド/秒）で、チューブをかき混ぜる。
  10. 加熱板と磁気攪拌機からチューブを外し、リンパ節の断片が安定しましょう​​。
  11. 慎重に「非間質細胞」が濃縮された上清を除去。注：T、B、樹状細胞およびCD45を分析する場合- GP38 - CD31 -は予見され、「非間質細胞」部分を保存します。
  12. 洗浄は750μlの基本培地で1回リンパ節組織を残り。注：この手順は、免疫能力のあるマウスを操作する場合にのみ必要です。
  13. リンパ節断片が沈降しましょう​​。
  14. 削除する非間質細胞浮遊割合。
  15. リンパ節フラグメントに750μlの基本3.5ミリグラムを添加した培地/ mlのコラゲナーゼDを追加し、40 / mlのDNアーゼI。
  16. バックを37℃予熱した水を入れたビーカー内チューブを配置します。
  17. ゆっくり攪拌しながら5分間リンパ節組織を消化。
  18. ピペッティングによりリンパ節組織断片を分解し、自動マルチチャンネルピペットを用いて最大速度で10サイクル700μlの混合。注：これは消化を改善するためにリンパ節組織を破壊する。
  19. 37℃の予熱された水で戻ってビーカー内チューブを配置します。
  20. ゆっくりと撹拌しながらさらに10分間、リンパ節組織断片を消化。
  21. ピペッティングによりリンパ節組織断片を分解し、自動マルチチャンネルピペットを用いて最大速度で99回混合する。
  22. 単一細胞懸濁液の維持を確実にするために、0.5MのEDTA 7.5を添加する。
  23. パイプによってリンパ節組織断片を分解準自動化されたマルチチャンネルピペットを用いて、最大のスピードで99サイクルで混合。
  24. 750μlの塩基性媒体を追加し、70μmのナイロンメッシュを通して細胞を渡します。
  25. 1500×gで、4℃で遠心細胞懸濁​​液を5分間。
  26. 間質細胞は現在、さらなる分析のために使用することができる。

リンパ節間質細胞の染色2。

  1. 成功したTRC、LEC、BECおよびDN細胞を認識するために抗CD45、抗ポドプラニン（GP38）、抗CD31抗体の組み合わせを使用してください。
  2. 2を含む100μlのHBSS中の抗GP38-PE（1：200）、抗CD31-APC（200 1）：ライブ/デッドトラッカー、抗CD45-FITC（200 1）で消化したリンパ節組織をインキュベート暗所で少なくとも20分間％のFCS、4°C、。
  3. 2％FCSを含むHBSSの500リットルを追加し、細胞を洗浄
  4. 1500×gで、4℃で遠心細胞懸濁​​液を3分。
  5. 2％FCSを含むHBSS100μl中に再懸濁する。
  6. equippフローサイトメーターで染色された細胞を実行します以下の光学系とED：励起最大3つのレーザーを持つソース：青（488nmで、空冷式、20 mWのソリッドステート）、赤（633nmで、17 mWのヘリウムネオン）、バイオレット（405nmで、30 mWのソリッドステート） 。
  7. 門CD45 -細胞は造血細胞を排除する。
  8. ダブレットと死細胞を除外するためのゲート·シングレット（FSC-W）と生細胞（LIVE / DEADトラッカー）。
  9. 、LEC（GP38 + CD31 +）、BEC（GP38 - CD31 +）およびDN（GP38 - CD31 - ）細胞（ 図1参照） - TRC（GP38 + CD31）を可視化する、CD31 対プロットGP38。

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結果

現在のプロトコルが原因自動化されたマルチチャンネルピ ​​ペットで機械的に解離に短い消化時間（45分以内）にリンクら 、2007 6によって公開修正された消化プロトコルです。また、手順はより標準化され、異なるリンパ節間質細胞上の表面マーカーの劣化を最小限に抑え、同時に複数のサンプルの処理を可能にする。

コラゲナーゼIVおよびコラゲナーゼDリンクプロトコル6と現在のプロトコルまたはコラゲナーゼP内およびディスパーゼFletchersプロトコルでの13リンパ節間質細胞の生存率を維持し、CD45、GP38およびCD31を含むいくつかの表面マーカーの消化を惜しま。テストするために現在のプロトコル、腋窩、上腕および鼠径リンパ節を取り出し、それらの間質細胞を単離するために消化した。 CD45、GP38およびCD31発現の分析を、C57BL / 6メートルから分離されたTRC、LEC、BECおよびDN細胞の存在を実証した氷（ 図1、ゲート戦略）。

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ディスカッション

リンパ節間質細胞の研究は、最近公開された消化による2プロトコル6,13の開発に研究の焦点となった。両方のプロトコルは、単一のリンパ節間質細胞を獲得するのに十分であるが、消化酵素と消化の時間の使い方が異なります。間質細胞およびそれらの表面マーカーは、酵素消化および機械的応力に敏感であるため、最適化されたプロトコルが必要とされる。

新鮮に解剖し、リンパ節から実行可能なリンパ節間質細胞の単離は、表現型および機能解析を実行するための最初のステップです。したがって、慎重に安定した温度及び示された時間のために、酵素の規定された濃度で消化することが重要である。二つ消化プロトコルがしかしかなり長い消化ステップで、6,13に記載されている。消化の時間を短縮するために、機械的な分解が含まれ、マルチチャネルピペットを用いて標準化した。上の現在のプロトコルの利点の電子はしたがって、消化酵素とのインキュベーション時間を最小限に、わずか45分で間質細胞の単離を可能にすることである。また、消化中の一定の撹拌は、リンパ節構造への消化酵素の最適なアクセスを可能...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

著者は、現在のリンパ節消化プロトコルを確立するための有益な議論を提供してくれたSanjiv Lutherとその同僚に感謝します。この作業は、SNFの助成金PPOOA-_119204およびSWRへのPPOOP3_144918によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEMLifeTechnologies-Gibco41965-039
FCS最終濃度 2%
CaCl2Sigma499609最終濃度 1.2 mM
コラゲナーゼ IVWorthington Biochemical Corporation> 1 mg 乾燥重量あたり 160 単位、最終濃度 1 mg/mL で使用
ラゲナーゼ Dロシュ110888820013.5 mg / ml
DNAse IRoche で使用します。1128493200140&マイクロで使用します。g / ml
攪拌磁石FAUST5mm長-2mmø
ポリスチレン丸底チューブ 5mlFalcon-BD Bioscience
加熱機能付きマグネチックスターラーIKA-RCT-standard9720250
ペトリ皿 100 mm、滅菌TPP6223201
25 G 針テルモ
抗マウス CD45 Abバイオレジェンドクローン 30-F11
抗マウス CD11c AbBiolegendClone N418
抗マウス ポドプラニン AbBiolegendClone 8.1.1
抗マウス CD31 AbBiolegendClone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel		Eppendorf4861 000.821/8301.250 & マイクロ;l max. volume
anti mouse CD140aBiolegendClone APA5
anti mouse CD80BiolegendClone 16-10A1
anti mouse CD40BiolegendClone 1C10
anti mouse I-AbBiolegendClone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1)BiolegendClone 10F.9G2
LIVE/DEAD 固定可能近赤外死細胞染色キットInvitrogenL10119
コ

参考文献

  1. Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
  2. Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).
  3. Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).
  4. Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
  5. Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).
  6. Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).
  7. Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).
  8. Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).
  9. Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).
  10. MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).
  11. Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).
  12. Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).
  13. Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35(2011).
  14. Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).
  15. Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6 (11), e27618(2011).
  16. Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6 (11), e26138(2011).
  17. Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).
  18. Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).
  19. Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).
  20. Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).
  21. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
  22. Lee, J. -W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
  23. Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
  24. Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
  25. Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
  26. Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
  27. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).

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