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方法論記事

TIRF顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のGタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化

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DOI:

10.3791/51805

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2014年10月20日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

この記事について

サマリー

クラスリン媒介性エンドサイトーシスは、シグナル伝達受容体を含む多くのタンパク質を内部化する急速で非常に動的なプロセスです。ここで説明するプロトコルは、個々のエンドサイトーシスイベントの動態を直接視覚化します。これは、エンドサイトーシス機構のコアメンバーがどのように互いに協調し、タンパク質カーゴがこのプロセスにどのように影響するかを理解するために不可欠です。

要約

多くの重要なシグナル伝達受容体は、クラスリン媒介性エンドサイトーシス(CME)のよく研究されたプロセスを通じて内在化されます。エンドサイトーシスの全体的な変化を測定する従来の細胞生物学的アッセイでは、CMEに関与する30を超える既知の成分が特定されており、生化学的研究により、これらの成分の多くの相互作用マップが生成されています。しかし、CMEは非常にダイナミックなプロセスであり、その制御は複雑で繊細であることがますます明らかになっています。この原稿では、全反射蛍光法(TIRF)顕微鏡を使用して、クラスリン媒介エンドサイトーシス機構の成分のダイナミクスを、生細胞内で、このプロセスを媒介する個々のイベントのレベルでリアルタイムに直接視覚化する方法について説明します。このアプローチは、生理学的調節に見られるように、エンドサイトーシスを全球的にブロックすることなく、エンドサイトーシスを変化させる可能性のある微妙な変化を解明するために不可欠です。この手法を使用して、新たな関心領域、つまり、異なるクラスリン被覆ピット(CCP)のダイナミクスを調節する貨物組成の役割を分析することに焦点を当てます。このプロトコールは、広く利用可能なさまざまな蛍光プローブと互換性があり、細胞表面から内在化される多くのカーゴ分子のダイナミクスの可視化に適用できます。

概要

クラスリン依存性エンドサイトーシス（CME）の過程は、小胞1-3に貨物を収集し、原形質膜を操作するクラスリン媒介エンドサイトーシス機構の多くのコンポーネントの時宜を得た到着時に依存している。 CMEは、膜が変形し、エンドサイトーシス1の発生期の現場で一緒になる貨物アダプタータンパク質によって開始されます。これらのタンパク質は、クラスリン被覆ピット（CCP）4を形成し 、かご状構造に組み立てるコートタンパク質クラスリンを募集。 CCPが完全に球状に組み立てられると、膜の切断は、主に大規模なGTPアーゼの作用を介して、ダイナミンは、無料のクラスリン被覆小胞（CCVS）5,6を生成します。この内在化は、コンポーネントが、CMEの複数のラウンドのために再利用することができるように、クラスリンコートの急激な分解をトリガします。

CMEに関与するタンパク質の発見および特徴は、伝統的なbiochに根付いてきたemical、遺伝的および顕微鏡技術4-6,8。これらのアッセイは、これらのエンドサイトーシスのコンポーネントの役割と相互作用点を解明した。売買機構の必須成分を定義するために非常に有用であるが、これらのアッセイは、高度CMEコンポーネントまたは貨物濃度の動的挙動を捉えることに限定されている。 CMEが定義されたステップにおけるタンパク質のモジュールのセットの振り付けアセンブリによって駆動されるので、これは重大な制限であり、そして個別のエンドサイトーシスイベントのダイナミクスの小さな変化は、エンドサイトーシスに大きな累積的な結果をもたらすことができるからである。さらに、最近のデータは、個別の清算機関がこのプロセスの生理学的調節が非常に空間的および時間的に9-14を拘束されていることを示唆している、組成物中にと行動の両方で異なる場合がありますことを示している。個別のエンドサイトーシス事象の可視化、したがって、複数の冗長CMEに関与するタンパク質とどのようにこれらのタンパク質は、Bを制御することかもしれないがある理由を理解することが不可欠であるyの生理学的信号は、貨物内在化を調節する。

ここでは、生きた細胞内の個別のCCPのダイナミクスのレベルでCMEを観測する全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の使用を記載している。 TIRFMは、カバーガラスとセル15,16の流体環境との間の屈折率の差に依存しています。励起光が臨界角以上で細胞に向けられるとき、それは内部カバースリップの上に、約100nmを拡張する照明の薄いフィールドを維持するエバネッセント波を作成し、反射される。これは、この狭いフィールド内の蛍光分子が励起されることを保証します。実際に、これは原形質膜上またはその近くの蛍光分子の励起を可能にし、細胞の内部部分からの蛍光を最小化する。これは、原形質膜、共同でイベントを視覚化するための有意に高い信号対雑音比、z軸の解像度を提供このような従来の落射蛍光または共焦点蛍光顕微鏡のようなより一般的に使用されるモードにmpared。また、入門、実用的なレベルで、個別の貨物エンドサイトーシスイベントの単純な形態学的特徴および動力学を分析し、定量するために一般に使用される画像解析プラットフォームの使用を記載している。

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プロトコル

培養細胞における蛍光タグ付きCMEのコンポーネントの1の発現

HEK293細胞は、GPCRの生物学およびエンドサイトーシスを研究するために広く使用されているので、このプロトコルモデルとして使用される有用なモデル細胞である。過剰発現および低い細胞毒性のない均一な表現を提供する任意のトランスフェクションプロトコールを使用してください。

  1. 無菌層流フード内のすべての細胞培養物を処理します。 10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダ​​ルベッコ改変必須培地（DMEM）1mlで12ウェルプレートの4ウェルを埋める。 HEK293細胞のコンフルエントT25フラスコから4つのウェルのそれぞれに、それぞれ1:50、1:25、1:16、1:10に希釈する。
    1. あるいは、製造業者の指示に従って、所望のサイズのマルチウェルプレートに細胞を播種する。 12ウェルプレートに2×10 4個の細胞- 0.4をシード。 5％CO 2および95％湿度で滅菌37°Cに一晩細胞を成長させる。
      注：その成長rを考慮のATEは、条件および細胞株に依存して変化し、それがトランスフェクションのために次の日、または二重にトランスフェクションを実施する可能性を理想的な密集度を確保するための複数のウェルに接種することが好ましいかもしれない。
  2. 翌朝、トランスフェクションのために〜70％コンフルエント（ 図1Bを参照）であるだけでなくを選択します。全くよくこの状態に達していない場合、別の日を待つ。
    注：70％の密集度は、HEK293細胞に最適です。細胞死および毒性がよりまばらな結果である細胞をトランスフェクトする。貧しい式の過コンフルエント細胞の結果をトランスフェクション。
  3. 製造業者のプロトコルに記載されているように60μlのバッファー（トランスフェクションキット）からECを追加し、コードするプラスミド400ngのは、1.5mlのマイクロチューブにGPCRを、および/またはクラスリン機構の成分、およびエンハンサーの2.4μlのタグ付き。 2秒間のボルテックスは、十分な混合を確実にし、下部の液体を回収するために2秒間2000×gで微量スピンする。
  4. 加えるのEffecteneμlの6製造業者のプロトコルに記載のように。マイクロフュージ中2秒間2000×gで2秒間ボルテックスし、スピンが下部の液体を収集します。トランスフェクション複合体ミセルの形成を可能にするために20分間待ちます。
  5. ウェルから培地を吸引除去し、トランスフェクトされる。静かにトランスフェクション試薬混合物に、10％FBSを含むDMEM 0.8mlのを追加し、ミセルを壊す減らすためにゆっくりとピペッティングして混ぜる。非常にゆっくりと横からだけでなく、メディアおよびトランスフェクション混合物を追加します。ピペットを用いて、マイクロチューブからウェルに残っているトランスフェクション混合物を追加します。
    注：必要に応じて、細胞の穏やかなトランスフェクションおよび下一過発現を生じる余分な栄養を与えるためにトランスフェクトウェルに10％FBSを含むDMEMの余分な0.5ミリリットルを追加します。
  6. 5時間37℃のインキュベーターにセルを返します。
  7. トランスフェクション混合物を含有する培地を吸引する。 10％FBSを含む1mlのDMEMと交換してください。許可する細胞は一晩成長させる。
  8. 次の日、以前にオートクレーブ滅菌コーティングされていないカバーガラスに細胞を渡す。
    1. 各ウェルに1 mMのEDTAでリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の0.5ミリリットルを追加します。代わりに、0.05％トリプシン-EDTAを0.5ミリリットルを使用しています。 1分間インキュベーター内にしておきます。
    2. 3ラウンド、6ウェルプレートの個別のウェルに滅菌した25mmのカバースリップを置きます。メディア2mlで各ウェルを埋める。静かにカバーガラスの底に成長してから細胞を防止するために、ウェルの底にカバースリップをプッシュ。
    3. 手動で井戸の底から細胞をリフトオフするだけでなくを攪拌。再懸濁するために10％のFBSを含むDMEMを1mlを追加します。 3カバーガラスに均等に12ウェルプレートの1ウェルから持ち上げ細胞を配布します。別の方法として、3ガラス底のディッシュに細胞をプレー。
  9. 細胞はイメージング前に少なくとも48時間、カバーガラス上で成長させる。細胞が広がって平られていることを確認します。

2。TIRFMを使用したCCPと貨物ダイナミクスのイメージング

  1. 製造業者のプロトコルに従ってアレクサフルオロタンパク質標識キットを用いてAlexa色素と共役M1抗FLAG抗体。あるいは、プレジュゲート抗体は、購入することができる。
  2. （イメージング、37℃で10分間、50mMのHEPES（pH7.4）および10％のFBS、10％のFBS、またはのOpti-MEMで予め温めリーボビッツ培地1mlで1,000希釈：1での抗体で細胞をプレインキュベート培地）、細胞表面上のFLAG標識GPCRを標識する。 GFPなどの遺伝的にコード化された蛍光タンパク質は、タグとして使用されている場合（詳細については説明を参照）の手順を省略します。
  3. 生細胞イメージング室にカバースリップを転送します。別の方法として、ガラス底ディッシュ、吸引抗体標識メディアの予め温めた画像形成媒体700μlのを追加します。
    1. ピンセットを使用したフックに25ゲージの針の先端を曲げる。
    2. 利き手でピンセットを持ちます。 OTHに曲がった針をホールドえー。下にしてガラス面に向けてフックカーブまで針を回します。それはカバースリップの上にフックまで、慎重6ウェルプレートの下部に、上下針、フック側をドラッグします。それは細胞を剥離するように、カバースリップの表面を傷つけないように注意してください。ゆっくりウェルの底からカバースリップを上に持ち上げます。サポートのためのウェルの壁にカバースリップのバランスをとる。
    3. カバースリップの縁付近に把握し、画像化チャンバにカバースリップセル側を上に移動し、チャンバーを組み立てるために鉗子を使用してください。予め温めイメージング媒体700μlの（あるいは適切な量）を追加します。割れや破損を防ぐために圧力なしに慎重にカバースリップを処理します。
  4. 顕微鏡にチャンバーを移し、ステージヒータまたは同封インキュベーターを使用し、37℃での細胞の温度を保つ。
  5. 100Xまたは60X TIRF油浸対物レンズ（上記1.45 NAまたは）を使用して焦点に細胞を持参してください。イメージ従来のエピ蛍光または詐欺のセル適切な構築物を発現する細胞を同定するための照明の焦点モード（ すなわちないTIRFM）。ピンボケ細胞は、それが困難焦点面および細胞を見つけることがTIRF照明の薄い深さはほぼ見えない。
    注：一部のシステムでは、臨界角より上のレーザーの入射角を移動することによって、従来の落射蛍光画像にTIRFMで同じレーザーを使用しています。重要な安全上の予防措置として、常にレーザビームの角度を認識しており、常に観察者から離れてそれを指示。
  6. 細胞周囲の原形質膜の輪郭が消え、セルの中心が表示されるまで発現する細胞の底面にまで焦点を当てる。これは、μ-オピオイド受容体（ 図2Aを参照）のように、原形質膜局在化カーゴタンパク質と最も明らかである。
  7. TIRFイメージングに切り替えます。
    1. 従来のエピ蛍光撮像に同じレーザを使用する場合は、の入射角を大きくする細胞の内部で焦点外の蛍光までレーザが消失し、細胞周囲の原形質膜のない輪郭が見られない。 （ 図2Aおよび2Bに図2Cの比較）
      注：TIRFMでは、焦点面を移動すると、フォーカスおよび/または薄暗いから完全に行くために画像を引き起こし、全体的な蛍光レベルは、照明の小さい深さに起因して減少する。 TIRFM照明に切り替える別の方法は、従来の/共焦点落射内のセルの中央にピントを固定しているため、その後は蛍光の大部分を失うまで、入射角を増加させ、その後、細胞膜にダウンして焦点を当てています。
    2. 一度TIRFMにおいて、励起レーザーを対物レンズを通して戻って反映しており、客観的な上記の表示されていないことを確認してください。レーザスポットが表示されているかどうかをチェックすることによって、これを確認してください。
      注：従来の落射蛍光または共焦点モードでは、レーザー照射は、客観的な上記の表示されている天井など。
    3. 鮮明な画像を得るために焦点を絞り込む。エンドサイトーシス機構の主なコンポーネントは、そのようなクラスリンなどの、涙点に表示されます。罰金にフォーカスを調整しますので、涙点は可能な円形のとおりである。
      注：糸状仮足が区別表示されるまで、膜局在貨物については、細かいピントを調整します。
    4. ミラーや全反射角など、すべての撮影パラメータを保存するために取得プログラムを使用してください。必要なすべての波長に対してこれを行います。
  8. 図3Aに示す例では、μ-オピオイド受容体とアダプターβ-アレスチン：すべての必要なエンドサイトーシスのマーカーを発現する細胞を見つけることをカバースリップの周りにスキャンします。表現するが、過剰発現されていないセルを選択します。詳細については、説明を参照してください。
  9. 細胞が同定されたら、10分間の画像毎に3秒を取得する。これらの条件下で撮像されたHEK293細胞におけるCCPの平均寿命は、アロであるので、これは、CCPの寿命を捕捉するのに十分であるウント40秒10-11。これは、CCPを観察する約12〜14フレームを可能にします。たとえば、 ムービー1を参照してください。画像追加のセルへのすべての手順を繰り返します。

手動検査によるエンドサイトーシスダイナミクス3。解析

CCP寿命の手動検証を大幅に検出することが可能と清算機関の数によって制限されていますが、静止画および検出アーティファクトの全体的な変化によって引き止められていない検出の正確な手段残る。詳細については、説明を参照してください。

  1. ImageJの中のファイルを開きます。画像は、インタリーブチャンネルのTIFFファイルの単一のスタックとして保存されます。 hyperstacksに画像を変換します。 Hyperstackへのイメージ> Hyperstacks>スタックに移動します。取得されたチャネル数を入力します（ すなわち 、β-アレスチンとμ-オピオイド受容体を画像化する場合には、2を入力します）、（TIRFMは単一の平面である）、Zスタックに1を入力して、映 ​​画のフレーム数（ すなわち 10分1フレームごとに3秒iにおける映画ポップアップウィンドウ内の200）。
  2. hyperstackフォーマットは2つのスクロールバーを持つウィンドウを生成します。時間を移動するチャネルおよび底部を通って移動するには、トップバーを使用します。寿命アッセイするタンパク質のチャネルにスクロールします。
  3. 全体の持続時間表示されていない既存の清算機関を含めることを減らすために、映画の10または15をフレームに移動します。無作為に選ばれたスポットを中心にカラーボックスを描画します。
  4. スポットが表示されているフレームの数をカウントします。
    注：エンドサイトーシス事象10,11,16-19の3形態学的分類の例については、 図3B及び図3Cを参照してください。

客観的認識によるエンドサイトーシスダイナミクス4。解析

客観的認識は、細胞内で画像化されたCCPの事実上すべての検出を可能にするが、誤構造のスプリアス検出の誤差を受けやすいことができます。 Eの長所と短所を計量する詳細については説明を参照してくださいACH法。特注のアルゴリズムを含むいくつかのプログラムは、客観的に清算機関を検出するために使用され得る。このプロトコルは、Imaris、画像解析ソフトを（ 材料を参照） を使用して、清算機関の客観的認識を説明しています。

  1. 開始するには、画像解析ソフトウェアで、RAW画像ファイルを開きます。デフォルトでは、マージされたカラー画像が表示されます。チャンネルの明るさを調整する「画面の調整」ウィンドウを使用します。表示された色を変更するチャンネルの名前をクリックします。その表示を防止するためのチャネルの横にチェックボックスをオフにした（ 図4Aを参照してください）。
  2. オレンジ色の斑点が付いたアイコンをクリックして、「スポット」を作成します。 図4Bを参照してください。セルの周囲関心領域（ROI）を選択します。 図4Cを参照してください。間違って明るく前縁とプラークを検出した領域を除外するようにROIを使用してください。別途異なる発現レベルを有する複数のセルを分析します。
  3. 専らするスポットの直径を測定しますアルゴリズムのデ初期推定。 「スライス」モードに切り替えて、その直径を測定するために、スポットの極性両端をクリックしてください。 図4Eを参照してください。形成後切断する前に、その安定性の高さで、CCPの指標と見て4または5ラウンドのスポットのためにこれを行います。ミクロンの四捨五入までの平均直径を計算するために、これらの測定値を使用します。
  4. スポットを検出。 「サーパス」モードに戻ります。検出のための適切なチャンネルを選択します。平均測定直径、通常は0.3または0.4ミクロンを入力してください。スポットを定量化するために青色の右矢印をクリックします。 図4Eを参照してください。スポットの直径が過小評価されている場合は、蛍光のスプリアス点がスポットとして識別されます。直径が大きすぎると、真のスポットは無視される。ときにわからない、少し低く推定し、それ以降の不正な検出を除外する。
  5. 品質によってスポットをフィルタリングします。バックすることなく、できるだけ多くのスポットを捕捉するフィルタを調整する地面。品質フィルタは、デフォルト20によって選択される。 図4Fを参照してください。
    1. 適切なしきい値を設定するためのガイドとして「品質」曲線を使用してください。曲線のこの最初のディップにマウスの左ボタンでフィルターの底のしきい値を移動します。この位置は通常は目に見えるスポットに検出を洗練ので、これは、フィルタのための良い出発点である。 図4Fを参照してください。
    2. 検出されたスポットは、球体または中央画素としてムービーに表示されます。 「色」タブを使用して、それが簡単にそれらを見るようにすること対照的な色にスポットの色を調整します。各フレーム内のスポットを確認するには、ムービーをスクロールします。目標は、その寿命全体のためにできるだけ多くのスポットを検出することである。
    3. 彼らは生涯の過程で十分に検出されないように、調光スポットを排除するか、後で手動での継続的なトラックに接続してください。
    4. 「強度」FIL明るい斑を削除するター、必要に応じて。新しいフィルタを追加するには、緑色のプラス記号をクリックします。 図4Fを参照してください。与えられた蛍光シグナルのスポットやフィルタリングする強度フィルタを作成します。しきい値を設定する（品質曲線に類似したが、4.5で説明します）、生成された強度曲線を使用してください。明るいスポットを表す曲線の極端な左端を削除するには、マウスの左ボタンを使用します。
      注：大プラーク構造は、セル内の明るい要素のうち通常は、それらは容易にフィルタで除外される。
    5. 清算機関は、スポットとして検出されず、明るい斑がもはや検出されたことを確認するために、ムービーをスクロールします。 図3Dは、（白い球で示される）のCCPの検出は、高品質のフィルターを用いて最適化したプラークが品質で除外されたセルを示しているフィルター。
    6. 品質のフィルタの明るいセルエッジを減らします。明るい物体は、まだ次のステップでは、手動で削除する必要があるかもしれません。青を続行矢印。
    7. 編集スポット画面で異常スポットを削除します。モードを「選択」に切り替えます。スポットをクリックします。それは黄色に変わります。 「削除」をクリックしてください。アルゴリズムの構築を継続して青い矢印をクリックします。 図4Gを参照してください。
  6. トラックを測定します。 「ブラウン運動は、「CCPはどんな監督の動き、原形質膜を横切って、最小限のドリフトを示してはならないようにトラックを設定します。このアルゴリズムは、その動きのために最も適切である。 図4Hを参照してください。
    1. 0.7μmのような小さい値に最大距離を設定します。 図4Hを参照してください。
      注：小さな距離を設定すると、隣接するスポットの接続を最小限に抑え、まだCCPスルーセルスポットや細胞運動の継続追跡を可能にします。
    2. これは、連続して不足している1つのフレームのみが存在する場合、トラックが継続することができます1に最大ギャップサイズを設定します。トラックを計算するために青い矢印をクリックします。 図4Hを参照してください。
      注：G3つ以上の原因が異なるトラックのpサイズが誤って一緒にリンクする。
    3. に表示して、スイッチ·トラック「ドラゴンテール。「スクロール検出品質を観察映画を通して。隣接するスポットが接続されている場合は、0.7ミクロン以下の最大距離を減少させる。スポットがあまりにも容易に分解されている場合、最大ギャップサイズを大きくします。トラックを作成するには青い矢印をクリックします。これは、フィルタトラック画面につながる。 図4Hを参照してください。
  7. トラックとデータのエクスポートをフィルタリングします。追加の明るいプラークを除去するために「インテンシティ」フィルタを使用します。 TIRFフィールドを入力エンドソームを削除するには「変位」フィルタを使用します。長いスポットが同様に長い変位を持っているように、十分に注意してください。プロトコルを完了するために、緑色の二重矢印をクリックします。 図4Iを参照してください。
    1. フィルタによって除去することができなかったトラックの誤認検出を削除するには、鉛筆のアイコンで、編集トラック]タブを使用します。 discontをチェックinuitiesまたはfalseの接続。二つのトラックを接続するには、[編集]トラック]ボックスに「接続」をクリックし、Ctrlキーを押しながら左クリック使用してそれらを選択します。個別のスポットにトラックを切断するには、トラックを選択し、「切断」を押してください。を持つ複数のスポットを選択してCtrlキー+左クリックして、新しいトラックを作成するために「接続」をクリックします。この方法は、4.5.7で説明した編集スポット、についても同様である。 図4Jを参照してください。
    2. データをエクスポートするには、統計]タブに移動します。選択した統計をエクスポートするために、単一のフロッピーディスクのアイコンをクリックします。すべての統計情報をエクスポートするフロッピーディスクの一連のようなアイコンをクリックします。 「トラック時間」統計は、エンドサイトーシスのトラックの長さが含まれます。 図4Kを参照してください。

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結果

生細胞TIRF顕微鏡を用いて、私たちは、Gタンパク質共役受容体（GPCR）とそのエンドサイトーシスアダプタータンパク質β-アレスチンをμ-オピオイド受容体（MOR）のエンドサイトーシスダイナミクスを記録している。 β-アレスチン構築物は一過性に、図1で概説したプロトコルを用いて安定に発現MOR細胞株にトランスフェクトし、96時間後に画像化した。安定した細胞株におけるMORはN末端pH感受性GFPでタグ付けされる。この蛍光タンパク質は、中立的な細胞外液に蛍光を発する。また、MORは一度だけ、アゴニストによって活性化endocytoses、それ以外均等に原形質膜に分散されたままである。薄暗い蛍光で満たされている細胞内の共焦点モード結果にカバーガラスの上に座っている接着性の細胞質膜に着目。これは、原形質膜のみをセルの周囲の蛍光のリングとして見られているセルの中心に焦点を当てて異なっている。左の比較図2（a）の右のパネル。誤った角度で、従来の落射蛍光またはTIRFに切り替えると、 図2（b）に示すように、同じ細胞で明らかになるように、焦点蛍光か...

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ディスカッション

ここでは、リアルタイムで生きた細胞内の個別のCCPのレベルでクラスリン依存性エンドサイトーシス（CME）を可視化するTIRFMの使用を記載している。 CMEは、多くの空間的および時間的に独立した個別のイベントの累積効果により媒介される迅速かつ高ダイナミックなイベントです。そのような結合は、フローサイトメトリーまたは固定細胞アッセイは、内在化タンパク質の量、またはタンパク質の電子顕微鏡局在化を測定する表面ビオチンまたはリガンドを用いて、内在化の生化学的測定値として現在使用されているほとんどのアッセイは、固定された時点でのタンパク質局在のアンサンブルの変化を監視。これらの既存の方法は、CMEのために必要であるが、CMEや他の動的な膜輸送プロセスの生理的尺度に一致する空間的および時間分解能を欠くタンパク質を特定するのに非常に有用であった。最近の証拠は、清算機関がそのタンパク質組成とダイナミクス9-1に不均一であることを示唆しているので、これは重要です2、およびCMEはそう急速に空間的に離散的に規制されているように。ライブセルTIRFMは、生細胞中で、リアルタイムで、空間的に分離された単一のCCPのレベルでCMEを分析する...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者は、Imarisの助けをいただいたC. Szalinski博士、H. Teng博士、M. Bruchez博士、技術的な助けとアドバイスを提供してくださったR. Vistein博士、D. Shiwarski博士、試薬と有益な議論をいただいたM von Zastrow博士、Dr. T Kirchhausen、Dr. D Drubin、Dr. W Almersに感謝したいと思います。T32 助成金による資金は SLB と NIH DA024698 にNS007433、MAP にDA036086されます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
L-グルタミンとピルビン酸ナトリウムを含むDMEM/高グルコースフィッシャーサイエンティフィック 
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no Calcium, no magnesiumGibco, by Life Technologies21600-010
EDTA Free AcidAmresco0322-500G
Fetal Bovine SerumGibco, by Life Technologies10437-028
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol redGibco, by Life Technologies21083-027
Opti-MEMGibco, by Life Technologies
HEPESCellPURE by Fisher ScientificBP2937-100
EffecteneQiagen301425Transfection reagent
25 mm coverglassFisher Scientific12-545-86
Corning cell culture treated flasks, 25 cm2Fisher Scientific10-126-28
細胞培養 6 ウェルプレートGreiner Bio-One、VWR82050-896
モノクローナル ANTI-FLAG M1Sigma AldrichF3040-5MG[
D-Ala2、N-Me-Phe4、Gly5-ol]-エンケファリン酢酸塩 (DAMGO)Sigma AldrichE7384-5MG
Alexa Fluor 647 タンパク質ラベリングキットLife TechnologiesA20173
ImageJNIHhttp://rsb.info.nih.gov/ij/
Imaris 画像解析ソフトウェアBitPLanehttp://www.bitplane.com/imaris/imaris、自動解析用
Nikon Eclipse Ti 倒立顕微鏡とフィルターキューブやフィルターなどの必要なアクセサリNikon
Nikon TIRF アームと必要なアダプターNikon Eclipse TiNikon入射角の調整用
iXon+ EMCCDカメラとアダプターAndor
SH3024301

参考文献

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