質量分析法による総合的なO-結合およびスルホグライコミクスのための改良されたゲル内還元β脱離

サマリー

O結合型糖鎖の多様性を包括的に探求するために、ペルメチル化および迅速な相分配法と組み合わせた新しいゲル内還元的β除去の手順を、SDS-PAGEによって分離され、その後の質量分析による糖鎖分析に適した糖タンパク質から直接放出されるO結合型糖鎖の分析に適用されます。

要約

SDS-PAGEによるタンパク質の分離とそれに続く分離されたタンパク質バンドのゲル内タンパク質分解により、生物学的サンプルの高分解能プロテオミクス分析が可能になりました。SDS-PAGEで分離された糖タンパク質によって運ばれる糖鎖の詳細な分析を可能にする同様のアプローチでは、検出法として質量分析(MS)を使用する際に、回収率と感度を最大化するために特別な考慮が必要です。高品質なデータを得るために乗り越えなければならない大きなハードルは、MS分析の妨げとなるゲル由来のコンタミネーションの除去です。ここで紹介するサンプルワークフローは堅牢で効率的で、MSの前にインラインHPLCクリーンアップを行う必要がありません。標的タンパク質を含むゲル片をアセトニトリル、水、酢酸エチルで洗浄し、ポリマーアクリルアミドフラグメントなどの汚染物質を除去します。O-結合型糖鎖は、ゲル内還元的β脱離によって標的タンパク質から遊離され、堅牢で簡便なクリーンアップ手順によって回収されます。このワークフローの利点は、硫酸化糖鎖の検出と特性評価の感度が向上することです。これらの手順により、MS分析に先立って迅速な相分配により、非硫酸化(シアル化および中性)のペルメチル化糖鎖から硫酸化過メチル化糖鎖を効率的に分離し、SDS-PAGEで分離した糖タンパク質の糖鎖およびスルホグリコマイクス分析を強化します。

概要

グリコシル化は、生物生理学、組織病 ​​理学、および細胞認識^1-3に貢献し、必須タンパク質の翻訳後修飾である。分析糖鎖の主要な進歩にもかかわらず、特定のタンパク質上のグリカンの完全な多様性を特徴づけることは、特に主要な生物学的供給源から単離されたタンパク質に、極めて困難な課題である。それにもかかわらず、糖タンパク質グリカンの微小不均一性は、頻繁に他のタンパク質との機能的相互作用に影響を与えます。したがって、グリカン多様性の特徴付けは、細胞および組織のグリコシル^4,5の生理的意義を理解するために不可欠である。組織の生理学および病態生理学、堅牢敏感な、包括的なglycomic分析技術の糖タンパク質のグリコシル化の寄与を理解するためにますます重要になってきた。プロテオーム解析では、タンパク質同定は、一般的LC-MSにより達成されるトリプシンペプチド⁶の/ MS分析。タンパク質消化は^{、7-9トリプシン}などのプロテアーゼによるゲル内消化後のSDS-PAGEによって分離精製されたタンパク質またはタンパク質を用いて行うことができる。 SDS-PAGEによるタンパク質混合物の予備濃縮は、タンパク質IDの深さと正確さを向上させます。糖タンパク質グリコシル化のglycomic分析のための類似の戦略の開発は、糖質科学の最前線に位置しています。

グリカンの2つの主要なクラスは、N-連結またはO-連結のいずれかを介してタンパク質主鎖に結合している。 N結合型グリカンは、アスパラギンに結合しているアスパラギン（Asn）のAsn-X-Ser / Thr / Cysをとして定義シークの一部として見出される残基は、（Xはプロリンを除く任意のアミノ酸である）、そしてペプチド- Nによる酵素消化により放出させることができる-glycanase（PNGアーゼFまたはA）、いずれの溶液中で、ゲル内、またはオンブロット^10-12。 O結合型グリカンは主にセリン（セリ​​ン）またはトレオニン（スレオニン）残基に結合している。ただし、1つの酵素は、IDENされている糖タンパク質のO-結合グリカンを放出することが可能であり、それは唯一の最も単純なO結合型グリカンを放出する、非常に限られたグリカン特異性を有するtified。化学物質放出戦略は、糖タンパク質のO-結合グリカンの包括的放出のための選択の方法のままである。還元的または非還元的β脱離、またはヒドラジンのよく特徴付けられた化学物質放出技術であり、現在糖タンパク質^13,14からのO結合グリカンを放出するための最も一般的に使用されるアプローチである。還元的β脱離は、SDS-PAGEによって分離された糖タンパク質のO-結合グリカンを放出するために使用されてきたが、従来のアプローチは、その後の分析のために^15〜17 HPLC分離を必要とした。

多次元MS（MS ^n）の分析では、現在、ほとんどの生物学的情報源から見込額で単離した糖タンパク質から放出されたグリカンを特徴付けるための構造データの最も豊富なソースを提供します。 MSの深さベースの構造的特徴が大幅に先立って彼らの分析にリリースグリカンをpermethylatingによって促進される。完全メチル化は、イオン化を強化し、グリカン構造^18,19の幅広い分子のシグナル応答を等化する傾向がある。また、過メチル化は、明確にすることにより構造の解明^20-23を高め、独特の大衆を持つ端末および置換単糖部分をタグ付けします。例えば、酸性グリカンはMSにより非過メチル化種として検出することが一般的に困難である。酸性グリカンMS負イオンモードで検出することができるが、同じイオンモードの両方で、酸性および中性グリカンを検出することは不可能である。グリカンの完全メチル化の主要な利点は、完全メチル化のように、グリカンの単糖置換基上の遊離ヒドロキシル基（OH）の全てがそれらのように検出可能にメチル基（OCH ₃またはOMeで）、このようにしてシアル化グリカンの電荷が中和されるでキャップされることであるニュートラル（アジアLO）グリカン。しかし、sulfoglycans上の硫酸残基のヒドロキシルイオン化を抑制し、感度を低下させるアニオン電荷の保持をもたらす、完全メチル化に耐性がある。この抑制は、現在、そのような硫酸化グリカン^24-26の高い存在を運ぶムチン、など非常に複雑な糖タンパク質の包括的なglycomic分析を防ぎます。

浄化硫酸化グリカン上の最近の報告では、逆相精製するクロマトグラフィーおよびMALDI分析の前に別々の過メチル化グリカン、充電に使用。この方法では、我々は、有機相分配よりもあまり厳密であることがわかってきた溶出のための異なる移動相を使用した硫酸化および非硫酸化グリカンの完全な分離に依存している。したがって、sulfoglycansの検出および濃縮のために適した新しい技術がここに提示されている。これらの技術は、水以下の水相中の硫酸化糖鎖の定量的回収を可能に：DCM（ジクロロメタン）日常グリカン過メチル化反応²⁷の最後に行われ、抽出、。また、MS ²フラグメンテーションパターンを簡素化しながら、重要なことは、完全メチル化非硫酸化グリカンの混合物からの完全メチルsulfoglycansのこの堅牢な分離は、付随的に帯電した種のために豊かにします。改善されたゲル内O-結合グリカン分析のための総合的なプロトコルも提示されている。改良されたプロトコルがグリカンの回復を高め、過メチル化グリカンのMS ⁿ分析を通じて得られる構造情報を増加させ、生物学的な供給源から単離さ不可欠糖タンパク質に適用sulfoglycomic分析の感度を向上させます。

このプロトコルは、全体の糖タンパク質抽出物のO結合型グリカン分析のために、またはSDS-PAGEにより分離し、目的の特定の糖タンパク質のことを意図しており、3つの実験の手順で構成されている。 A）は、ゲルクリーンアップ、B）は、ゲル内還元的β脱離、およびC）糖鎖permethy設置と。目標は、生物学的に関心のある主要な供給源から採取された糖タンパク質のための総合的なO結合型glycomicデータ（ 図1）を得ることである。 SDS-PAGEによって分離された糖タンパク質を染色することによって視覚化され、目的のバンドを切り出し、得られたゲルのバンドを小片にスライスされる。ゲル片を脱染色し、ゲルの汚染物質（ 図2A）を除去し、酢酸エチルでの洗浄に供される。グリカン放出は、ゲル内還元的β脱離（ 図2B）によって達成され、遊離されたグリカンを完全メチル化されている。水性有機抽出後に過メチル化を定量的に離れて非硫酸ニュートラルグリカン（ 図2C）からのアニオン性硫酸化グリカンを仕切る。水性 - 有機溶​​媒抽出に結合されたゲル内還元的β脱離は、SDS-PAGEで分離した糖タンパク質の少量から放出されたO結合型グリカンとsulfoglycansの特徴付けを可能にします。戦略的な概要はsummariです図1および詳細におけるZEDは、 図2に示されている。また、脱染色し、洗浄し、ゲル片の部分は、通常のLC-MS / MSプロテオミクス技術によるタンパク質のIDのために使用することができる。

プロトコル

注意：ラボにおける安全上の懸念事項

標準的なラボのベストプラクティスに従い、以下を遵守してください。すべての有機溶媒は適切な場所に保管してください。すべての廃棄物は、化学組成を明記したラベルを貼った化学廃棄物容器に保管してください。これらのプロトコルで使用されるいくつかの試薬は、潜在的な発がん性物質であるか、または揮発性の可燃性ガスを発生させるため、すべての試薬は換気機能のあるドラフトチャンバー内で取り扱ってください。有機溶媒を取り扱う際は、手袋、白衣、保護メガネなどの個人用保護具を着用してください。

図1. インゲルO-グライコミクスの手順。( A ) 目的タンパク質をSDS-PAGEで分離し、適切な染色法（Coomassieまたは銀染色）で検出して切り出す。切り出したゲル片を小さな立方体に細切し、脱色後、後続のMS分析を妨げる不純物を除去するために酢酸エチルで洗浄する。ゲル片の一部は、インゲル内トリプシン消化およびその後のLC-MS/MSによるプロテオミクス解析用に保存することができる。( B ) 分離された糖タンパク質から、インゲル還元的β-脱離法によりO-結合型糖鎖を遊離させる。重要なステップとして、脱塩およびメタノールを用いた共沸によるホウ酸の除去が含まれる。( C ) 還元的β-脱離により遊離したO-結合型糖鎖をパーメチル化し、次に水相と有機相に分画する。スルホ糖鎖は上層（水相）に定量的に回収され、中性糖鎖およびシアリル化糖鎖は下層（DCM層）に分画される。

図 2. インゲルグリコミクスの詳細フローチャート。図 1に示した各実験ステップを個別に図示したものである。(A)ゲルの脱色とEtOAc抽出、(B)O結合型糖鎖遊離のための直接インゲル還元β消去、および(C)パーメチル化と相分離。こちらをクリックして、図の拡大版を表示してください。

1. ゲルの切り出しおよびゲル由来不純物の除去

1. 手順を開始する前に、材料リストに記載されている化学物質および試薬を準備する。
2. 標準的なTris-Glycineバッファーシステムを用いて、SDS-PAGEゲルでタンパク質を分離する。分離したタンパク質をCoomassie Brilliant Blueまたはシルバー染色で染色する。一般的に、シルバー染色ゲルからのO結合型糖鎖の回収率は、Coomassie染色ゲルからの回収率の約80–90%である。
3. 電気泳動後、ゲルをガラスプレートの上に置き、清潔なメスまたはカミソリで目的の領域を切り出す。
4. O-糖鎖の収量を高めるため、目的のゲルバンドを別のガラスプレートに移し、切り出したゲル片を約2 mmの立方体に細断する。糖鎖の回収率が低下するため、ゲル片を1 mm以下の立方体にすることは避ける。ステンレス製マイクロスパチュラを用いて、小さなゲル片をスクリューキャップ付きガラスチューブ（13 x 100 mm）に移す。
5. サンプルチューブに25 mM 重炭酸アンモニウム（AMBIC, NH₄HCO₃）を1 ml加え、テフロンライナー付きスクリューキャップで密閉し、チューブを指で弾いて軽く混ぜた後、10分間静置する。ゲル片が破砕されるのを防ぐため、激しい撹拌は行わない。
6. パステールガラスピペットまたは極長プラスチックチップを装着したピペットを用いて、ガラスチューブからAMBICを慎重に除去する。AMBIC溶液を除去する際、小さなゲル片を押し潰したり、一緒に吸い出したりしないように注意する。
7. ガラスチューブにアセトニトリル（ACN）を1 ml加え、キャップをして、チューブを指で弾いて軽く混ぜた後、10分間静置する。ゲル片が溶媒に完全に浸っていることを確認する。必要に応じて、ピペットチップでゲル片をチューブ壁から溶媒中へ押し込む。
8. ガラスチューブからACNをピペットで除去し、鮮やかな青色が消失するまでステップ1.5–1.7を繰り返す。必要に応じて、AMBIC/ACNによる洗浄を少なくとも5回連続で繰り返す。シルバー染色ゲルの場合は、脱染色キットを使用する。ACN中でのゲル片が均一に白色になったら、次のステップに進む。
9. ガラスチューブから液体をピペットで除去し、再びキャップをして、AMBICを1 ml加え、5分間静置する。
10. AMBICを除去し、ガラスチューブに酢酸エチル（EtOAc）を2 ml加える。テフロンライナー付きキャップで密閉し、4 °Cで一晩、エンドオーバーエンド回転撹拌を行う。あるいは、室温で30分間のEtOAc洗浄を3回行う。EtOAcによる洗浄時間が長いほど、不純物の除去効率が高まる。
11. 最後のEtOAc洗浄液を除去し、2 mlのH₂Oで3回洗浄する。EtOAcを完全に除去することで、効率的な還元的にβ-脱離反応が保証される。
12. H₂Oをピペットで除去し、1 mlのACNで1回洗浄してゲルを脱水する。
    注：乾燥後、脱水されたゲルはゲル内β-脱離に使用できる。脱水したゲル片は、使用時まで-20 °Cで保存可能である。
13. どのバッファーまたは溶液（AMBIC, ACN, H₂O）がゲルに適用されているかに関わらず、任意のステップで洗浄工程を停止し、ゲル片を4 °Cで一晩保存できる。サンプル調製は、その後2日以内であればいつでも再開できる。
14. 脱色および脱水したゲル片の一部を、標準的なプロテオミクス手法によるタンパク質同定に使用する。

2. 還元的β-脱離によるゲル内O-糖鎖遊離

1. 50% NaOHまたは固体のNaOHを用いて1 M水酸化ナトリウム（NaOH）ストック溶液を調製し、使用まで4 °Cで保存する。
   1. 50% NaOHを5.2 ml（または固体のNaOHを4 g）取り、液量を100 mlに調整して1 M NaOH溶液を作成する。この1 M NaOHストック溶液を100 mM NaOHまで希釈する。この溶液は4 °Cで最大6ヶ月間保存しても、還元的にβ-除去反応の効率が低下することはない。
2. 100 mM NaOHを用いて2 M水素化ホウ素ナトリウム（NaBH₄）を調製する。38 mgのNaBH₄を0.5 mlの100 mM NaOHに溶解させる。通常、1サンプルあたり0.5–1.0 mlのホウ素化物溶液を使用する。反応溶液の量は、ステップ1で調製した乾燥ゲル片の量に応じて変更する。切り出したゲル片1–2個（ステップ1.3）に対し、0.5 mlのホウ素化物溶液を使用することを想定している。
3. 脱水させたゲル片に100 mM NaOHを500 µl加え、氷上で3–5分間静置して、グリカン回収率を高める塩基性条件にゲルを平衡化させる。
4. 100 mM NaOH中の2 M NaBH₄を500 µl加え、最終濃度を100 mM NaOH中の1 M NaBH₄とする。チューブを静かに混ぜ、45 °Cで18時間インキュベートする。
   1. インキュベーションの最初の1時間は、15分ごとにチューブを静かに混ぜる。激しく撹拌するとゲル片が断片化する可能性があるため、避けること。反応は、十分に温度が安定したインキュベーター/オーブンまたはヒーティングブロックで行う。ゲル片が反応溶液に完全に浸っていることを確認する。
5. サンプルチューブをインキュベーターまたはヒーティングブロックから取り出し、氷上に置いて反応を停止させる。
   注：β-除去反応を18時間進行させた後、脱塩処理は同日中に行わなければならない。

3. カチオン交換クロマトグラフィーによる脱塩

1. 過剰な熱の発生を防ぐため、サンプルチューブを氷上に保持しながら、10% 酢酸 (AcOH) をゆっくりと滴下して塩基を中和します。AcOHを添加する合間に、サンプルチューブを軽くボルテックスします。酸の添加により気泡が「火山」のように激しく発生するため、ゆっくりと滴下するように注意してください。必要に応じて、チューブを遠心分離し、気泡を除去して溢れ出しを防止します。
   1. 反応混合物中の多量のナトリウムを除去するため、反応混合物を小型のカチオン交換カラム（DowexまたはAG-50W-X8樹脂、H⁺型）に通します。
   2. 樹脂が分析グレードであっても、MS分析を妨害する汚染物質を除去するため、使用前にカチオン交換樹脂を 1 M NaOH および 1 M HCl で洗浄します。
   3. 樹脂を 1 M NaOH に浸し、デカンテーションで溶液を除去します。脱イオン水を加え、水を除去した後、1 M HCl を加えます。
2. 樹脂上の溶液が無色になるまでこれらの手順を繰り返します。洗浄した樹脂を脱イオン水で洗浄し、5% AcOH 中で 4 °C で保存します。
3. 小型のガラスカラムを作成するには、セラミックカッターを使用してパストールガラスピペットの先端をひっかいて折 own じ、ピペット先端のテーパー部分が約 1 cm になるようにします。グラスウールのプラグをほぐして先端に向かって押し込み、樹脂層の支持体を形成します。ピペットカラムをクランプまたは洗濯バサミで固定し、ガラス試験管の上に配置します。
4. 空のピペットを 1 ml のメタノール (MeOH) と 3 ml の 5% AcOH で洗浄します。5% AcOH 中に保存されている H⁺ Dowex または AG50 カチオン交換樹脂のスラリーを撹拌し、パストールピペットカラム内で 1 ml のベッド容量になる十分な量のスラリーを移します。
5. 5% AcOH の 5倍量を用いてカラムをリンスします。流出液に樹脂粒子が混入していないか確認し、樹脂が検出された場合はそのカラムを使用しないでください。
6. カラムを新しいねじ口ガラスチューブ (16 x 125 mm) の上に配置し、サンプルをロードします。流出液を回収し、少なくとも 5% AcOH の 3倍量を用いてグリカンを同じチューブに溶出させます。
7. チューブをParafilmで覆い、針で小さな穴を開けます。サンプルチューブを -80 °C またはドライアイス上に置きます。凍結後、凍結乾燥によってサンプルを乾燥させます。乾燥させた物質は、使用まで -20 °C で保存します。

4. ホウ酸塩の除去

1. MeOH中10% AcOHを調製します。氷酢酸10 mlを量り取り、メタノールで100 mlに定容します。この試薬はテフロンライナー付きキャップのガラス瓶に保存し、最大6ヶ月間使用可能です。
2. 乾燥させた凍結乾燥サンプルチューブにMeOH中10% AcOHを300 µl加え、ボルテックスミキサーで撹拌します。生成したトリメチルホウ酸をN₂気流下での蒸発により除去します。
   注：酸性条件下でホウ酸塩をメタノールと混合すると、揮発性化合物であるトリメチルホウ酸が生成します。
3. 37 °CのN₂気流下で乾燥させます。乾燥後、ステップ4.2に従い、再度AcOH in MeOHを分注します。37 °Cの窒素（N₂）気流下で液体を5分間乾燥させます。
   1. 再懸濁と乾燥を少なくとも3回繰り返します。乾燥試料は使用まで-20 °Cで保存してください。

5. C18クリーンアップ

1. C18カートリッジカラム（サイズ 1 ml、樹脂 100 mg）を、3倍量のACNおよび5倍量の5% AcOHを用いて平衡化する。緩やかな正圧の空気をかけることで、平衡化溶液の通過を促進させる。
2. 脱塩済みでホウ酸を含まないサンプルチューブに5% AcOHを500 µl加え、ボルテックスで溶解させる。
3. 再懸濁したサンプルを平衡化したC18カラムにロードし、流出液をガラス製スクリューキャップチューブ（13 x 100 mm）に回収する。3 mlの5% AcOHを用いてO-glycansを同じチューブに溶出させる。
4. チューブをパラフィルムで密封し、細い針で小さな穴を開けるか、またはPTFEライニングキャップを緩く締めてチューブを覆い、サンプルを-80 °Cまたはドライアイスで凍結させる。凍結乾燥により溶媒を除去する。乾燥させたサンプルは、使用時まで-20 °Cで保存する。

6. ペルメチル化用塩基の調製

注意：確実なペルメチル化を行うために、NaOHスラリーは調製直後のものを使用してください。ペルメチル化反応に使用するすべてのガラス器具は、十分に洗浄しておく必要があります。

1. パーメチル化用の塩基試薬を調製するため、清潔なガラス製ねじ口チューブ（13 x 100 mm）に50% NaOHを400 µl加える。無水MeOHを800 µl加え、ボルテックスする。
2. 無水ジメチルスルホキシド（DMSO）を4 ml加え、ボルテックスして白色沈殿を生成させる。
3. 600 x gで1分間遠心分離し、沈殿物をペレット化する。上清をピペットで吸い取り、廃棄する。ペレットに無水DMSOをさらに4 ml加える。ボルテックスする。
4. ステップ6.2および6.3を、白色沈殿が形成されなくなるまで、または最低3回以上繰り返す。
5. ペレット化した塩基を無水DMSO 3 mlに溶解し、清潔なパスツールピペットを用いてピペッティングで緩やかに混合する。
6. この塩基は保存できないため、直後のパーメチル化反応に使用すること。

7. 遊離糖鎖のパーメチル化

1. C18精製試料に無水DMSOを200 µl加え、ボルテックスまたは超音波処理して再懸濁させる。
2. 再懸濁させたベーススラリーを300 µl試料に加え、直ちにヨードメタン（MeI）を100 µl加える。テフロンライナー付きキャップでチューブを密閉し、ボルテックスで5分間激しく混合する。
3. ペルメチル化反応を停止させるため、氷上で5% AcOHを2 ml加え、ボルテックスにかける。溶液をピペットで5回吸い上げ、吐き出す操作を行い、揮発によって残存するMeIの量を減らす。
   注：AcOHは溶液を中和し、MeIを除去することで、相分離時における水相への硫酸糖鎖の抽出効率を高める。
4. ジクロロメタン（DCM）を2 ml加え、ボルテックスにかける。室温で600 x gにて1分間遠心分離し、水相と有機相を分離させる。
5. 上層（ペルメチル化硫酸糖鎖の大部分を含む水相）を新しいガラスチューブ（13 x 100 mm）に移す。
6. 有機相にH₂Oを2 ml加え、ボルテックスにかける。600 x gで1分間遠心分離して水相と有機相を分離し、この2回目の水相を最初の水相（ステップ7.5）と合わせる。
7. ステップ7.6および7.5をさらに3回繰り返すが、その後の分液で得られた水相を保存する必要はない。
8. 最上層（水相）を最下層（有機相）から可能な限り取り除き、清潔なパスツールピペットを用いて最下層（有機相）を別の新しいガラスチューブに移す。
9. 42 °CでN₂気流下にて有機相を乾燥させる。
10. チューブをパラフィルムで密閉し、使用時まで-20 °Cで保存する。

8. 水相からのペルメチル化硫酸O-糖鎖のC18クリーンアップ

1. C18カートリッジカラムを、3倍量のACNおよび5倍量の5% AcOHで平衡化する。
2. ステップ7.5および7.6で回収し混合した水相をカラムにロードする。
3. 脱塩のため、10 mlのH₂Oでカラムを洗浄する。
4. 2 mlの50% ACNを用いて、パーメチル化硫酸O-糖鎖を新しいガラスチューブに溶出させる。より大きなオリゴ糖におけるパーメチル化硫酸O-糖鎖の回収率を高めるため、さらに85% ACNで追加溶出を行う。
5. 溶出液を42 °Cで窒素気流下にて乾燥させる。
6. 乾燥させた試料を、MS分析まで-20 °Cで最大6ヶ月間保存する。

9. 永久メチル化O-グリカンの質量分析

1. ナノエレクトロスプレーソースを用い、シリンジ流量 0.40–0.60 µl/min、キャピラリー温度 210 °C の条件下で、適切な質量分析計にパーメチル化O-糖鎖を直接注入して分析する。イオントラップ装置による MS/MS および MSⁿ の CID フラグメンテーションでは、30–40% の衝突エネルギーを適用する。
2. 負イオンモードの場合、パーメチル化硫酸O-糖鎖を 50 μl のメタノール/2-プロパノール/1-プロパノール/13 mM 酢酸アンモニウム水溶液（体積比 16:3:3:2）で再構成する。正イオンモードの場合、パーメチル化中性/シアリル化O-糖鎖を 50 µl のメタノール/水（1:1）中の 1 mM 水酸化ナトリウムで再構成する。
3. 個々のO-糖鎖構造を特性解析するために、MSn 分析では Xcalibur ソフトウェアパッケージ version 2.0 のトータルイオンマッピング（TIM）およびニュートラルロススキャン（NL scan）機能を使用する ^13,19。

結果

ゲル内還元β脱離前の酢酸エチル処理の影響

インゲル還元β-脱離を用いてウシムチンから遊離させ、パーメチル化したO-結合型糖鎖サンプルの代表的なマススペクトルを図3に示します。ゲル断片をEtOAcで洗浄することで、その後のMS分析を妨げるSDSおよびポリアクリル汚染物質を効果的に除去できます²⁷。

図 3. ゲル内還元β-脱離前のポリアクリルアミドゲル片の酢酸エチル洗浄により、遊離した糖鎖の検出能が向上する。(A) 酢酸エチルによる洗浄を行わない場合、ウシ顎下腺ムチンからゲル内β-脱離により遊離したパーメチル化O-結合型糖鎖のマススペクトルは、多分散な...

ディスカッション

ゲル内還元的β除去と有機水抽出を組み合わせることで、SDS-PAGEによって他のタンパク質から分解された少量のムチン型糖タンパク質から採取された硫酸化および非硫酸化O結合型糖鎖を特徴付けるために取得できる構造データの感度と深さが向上します。この研究で提示された技術的アプローチの本質的な進歩は次のとおりです。(a)簡単な洗浄ステップによるゲル由来の汚染物質の容易な除去。(b)水-DCMの急速分配後の水相中のペルメチル化スルホグリカンの定量的回収。ここで説明するワークフローは、生体サンプル中の生理学的レベルで発現する糖タンパク質から放出される硫酸化糖鎖および非硫酸化糖鎖の検出感度を劇的に向上させます。

ここで説明する方法は、標準的な分析方法に細心の注意を払って適用すると堅牢で再現性が高いですが、汚染源の可能性に関するいくつかの考慮事項を簡単に言及する価値があります。すべてのガラス製品が非常に清潔で、ほこりや洗剤が付着していないことを確認することが重要です。MSスペクトルに汚染物質のピークがあることに気付いたら、すべてのガラス器具を徹底的に洗浄し、最終乾燥前にMeOHですすいでください...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
水、脱イオン水	Sigma-Aldrich	270733-4L	CHROMASOLV、HPLC
酢酸、Glacial	Fisher	A38-500	認定ACS≥99.7% w/w
メタノール	Sigma-Aldrich	34860-4L-R	CHROMASOLV、HPLC、≥99.9%
重炭酸アンモニウム	Fluka	09830-500G	BioUltra、≥99.5%(T)、ステップ1
トニトリル	Sigma-Aldrich	34998-4L	CHROMASOLV Plus、HPLC用、≥99.9%、ステップ1
酢酸エチル	Fluka	34972-1L-R	LC-MS CHROMASOLV、ステップ1
水素化ホウ素ナトリウム	Aldrich	213462-25G	ReagentPlus、99%、ステップ2
ヨードメタン	Sigma-Aldrich	289566-100G	ReagentPlus、99.5%、 ステップ6. 4°Cで保管します。使用までC. 室温で置いてからご使用ください。
水酸化ナトリウム溶液、50% w / wフィ		ッシャーSS254-1	認定、ステップ6
ジメチルスルホキシド、無水シ	グマ-アルドリッチ	276855-1L	無水、≥99.9%、ステップ6
ノール、無水	Sigma-Aldrich	322415-100ML	無水、99.8%、ステップ6
ジクロロメタン	Sigma-Aldrich	34856-4L	クロマゾール®、HPLC用、≥99.8%、安定剤としてアミレンを含有、Step 7
Dowex 50WX8水素形態水素100-200 メッシュ	Sigma-Aldrich	217506-500G	Step 3
AG 50W-X8 樹脂	Bio-Rad	142-1441	Step 3
BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg 固相抽出カラム、PP、オクタデシル (C18) 逆相	JT Baker	JT-7020-01	Step 5 and 8
7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	バイオ・ラッド		Step 1
Bio-Safe Coomassie Stain	バイオ・ラッド	161-0786	G-250、質量
分析用ステップ1シルバーステインキット	Pierce	24600	ステップ1
オリゴ糖キット(マルトトリオース、Dp3:R474140)	Supelco	47265
オリゴ糖キット(マルトテトラオース、DP4:R474135)	Supelco	47265
使い捨てパスツールピペット、ガラス、ショートチップ	VWR	14673-010	使用前に洗浄
PYREX 13 x 100 mm 使い捨て丸底ねじ込み培養チューブ	コーニング	99447-13	使用前に洗浄
PYREX 16 x 125 mm 使い捨て丸底ねじ込み培養チューブ	コーニング	99447-16	使用前に洗浄
フェノールキャップ/クロージャー、PTFE面ゴムライナー付き	Kimble	45066C-13	使用前に洗浄
フェノールキャップ/クロージャー PTFE面ゴムライナー付き	Kimble	45066C-15	使用前に洗浄
ハミルトンHPLCシリンジ	ハミルトン	81265	ボリューム500 μl、針サイズ22 G
ハミルトンHPLCシリンジ	ハミルトン	81165	ボリューム250 μl、針サイズ22 G
ハミルトンHPLCシリンジ	ハミルトン	81065	ボリューム100 μl、針サイズ22s G
Hamilton HPLCシリンジ	HAMILTON	80965	ボリューム50 μl、針サイズ22s G
Hamilton較正シリンジ	HAMILTON	80300	ボリューム10 μl、針サイズ26s G
ペトリ皿ガラス 100 mm x 15mm	GSC INTERNATIONAL INC	1500-4	使用前に洗浄、ステップ1
Bard-Parker Surgical Blades	Fisher	371310	ステップ1
Reacti-Therm加熱/攪拌モジュール	ピアス	18870	ステップ1、4、7
加熱ブロック	Fisher	125D	ステップ2
パイレックスファイバーグラスウールホウケイ酸ポアサイズ8 μm	Aldrich	CLS3950	Step 3
溶融シリカカッターチューブカッター	alltech	3194	Step 3
マルチチューブボルテクサー	VWR	444-7063	ステップ 6
凍結乾燥機 25EL 凍結移動式	Virtis	25EL
遠心分離機	VWR	Clinical 50
LTQ Orbitrap Discovery	サーモフィッシャーサイエンティフィック