フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

サマリー

カルシウムは、多くの生理学的および病態生理学的なシグナル伝達経路に関与している。生細胞イメージングは​​、特殊な設備を必要とし、時間がかかる可能性がある。懸濁液中に持ち込ま付着上皮細胞における細胞質カルシウムの相対的変化を決定するために、フローサイトメーターを使用して迅速に、簡単な方法を最適化した。

要約

エキソサイトーシス、ミトコンドリア機能、細胞死、細胞代謝、細胞移動など、生理学的および病態生理学的なさまざまな細胞プロセスがカルシウムを必要とするか、またはカルシウムによって支配されています。サイトゾルカルシウムは通常、低ナノモル濃度で維持されます。むしろ、小胞体、ミトコンドリアマトリックス、および細胞外コンパートメントにマイクロモルからミリモルの高濃度で見られます。刺激を受けると、細胞質カルシウムの一時的な増加が下流のイベントにシグナルを送るのに役立ちます。細胞質カルシウムの変化の検出は、通常、カルシウム結合時に蛍光強度の増加または発光波長のシフトを示すカルシウム結合色素でセットアップされたライブセルイメージングを使用して行われます。しかし、ライブセルイメージングのセットアップは、すべての研究者が自由にアクセスできるわけではありません。フローサイトメトリーを用いた免疫学的細胞や、蛍光マイクロプレートリーダーを用いた非免疫学的接着細胞に対しては、代替の検出方法が最適化されています。ここでは、単一波長カルシウム結合色素を用いたフローサイトメトリーで上皮細胞の変化を検出するための最適化された簡便な方法について説明します。通常は色素をロードするのが難しい接着性腎近位尿細管上皮細胞に、プロベネシドの存在下で蛍光細胞透過性カルシウム結合色素をロードし、懸濁液に持ち込み、タプシガルギン、ツニカマイシン、イオノマイシンの添加前後にカルシウムシグナルをモニターした。

概要

カルシウムは、細胞の生理学的および病態生理学的信号¹の送信を担当する重要なセカンドメッセンジャーである。細胞質カルシウム濃度は、カルシウムポンプとカルシウム交換体の活性を介して低く保たれている。筋小胞体/小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）のATP依存様式で両方の、原形質膜カルシウムATPアーゼ（PMCA）は、細胞外区画へのカルシウムを押し出す一方で「ポンプリーク」システムの一部として、小胞体（ER）カルシウムストアを補充^2。そのようなホルモンや神経伝達物質などの生理的メッセンジャーは、Gタンパク質共役受容体、ジアシルグリセロールおよびイノシトール三リン酸^{（IP3）3を}生成するために、原形質膜にホスファチジルイノシトール4,5-ビスリ ​​ン酸（PIP2）を加水分解するホスホリパーゼCの活性化を介してそれらの信号を送信する。ジアシルグリセロールは、原形質膜に残っている間、IP3は、細胞質ゾル中に拡散し、IP3受容体に結合するER膜とカルシウムで見られるリガンドカルシウムチャネルを活性化する複数（IP3Rs）は、細胞質カルシウム濃度の増加は⁴で最高潮に達するER腔ストアから放出される。細胞質ゾルに到達するカルシウムのための代替経路は、原形質膜に存在するカルシウムチャンネルと交換によるものである。これら二つの区画間のクロストークが記載されている：カルシウム誘導性カルシウム外カルシウムがER店⁵からのカルシウム放出を誘導放出（CICR）、およびストアはSTIMによって感知されるERストアを空にするカルシウム流入（SOCE）を操作して往来の開口を引き起こす原形質膜カルシウムチャネルは、ER店舗⁶の補充を促進する。

病態生理学的条件下では、細胞のカルシウム応答は、生理的刺激物質¹の非存在下での脱制御および細胞質のカルシウムが増加する。カルシウム応答は、多くの方法で影響を受ける可能性がある：カルシウム長期信号、細胞質ゾルからのカルシウム除去、カルシウム貯蔵またはカルシウムの局所的変化の枯渇を遅らせた。さらに、ミトコンドリアは、バッファリングで中心的な役割を引き受けるとカルシウム^7をリリース。延長および/または過最大細胞質カルシウムの増加は、細胞死に至る。実際に、カルシウムがより頻繁な細胞の病態生理学的応答に関与する主な細胞死と関連しているような神経変性疾患、心臓病、癌、骨疾患および腎疾患などの疾患の幅広い、における重要な事象ではないよりもおよび臓器または組織機能^8-10の損失または変更。また、カルシウムシグナルの摂動は、細胞の適応及び細胞機能および応答の変化に関連している。

伝統的には、カルシウムシグナルを細胞透過性アセトキシメチル（AM）エステルの形で細胞内にロードされた負に帯電した蛍光カルシウム指示薬を用いて測定される。かつて携帯esterasにより開裂ES、蛍光指示薬は、細胞内コンパートメント内に残るとカルシウムが結合した時に蛍光強度の増加。最もよく知られており、カルシウム指示薬を使用レシオメトリックのFura-2ロジャーツィンと同僚¹¹によって開発されています。カルシウムに対する異なる親和性カルシウム指示薬は異なるカルシウムプールを監視することを可能にする。検出方法は、生細胞イメージング、蛍光マイクロプレートリーダー、フローサイトメトリーが含まれる。 （通常、数分〜数秒以内）カルシウムシグナルの比較的速い反応速度は、カルシウムシグナルの特性に関する大部分の情報を得るための最善の方法を画像化する生細胞を作る。別に（ミリ秒以内）カルシウムシグナルの速い反応速度から、生細胞イメージングは、単一のセル¹²内のカルシウムシグナル伝達の細胞内区画化を研究するための優れた方法である。絶対的なカルシウム濃度は、カルシウムのindの最小および最大蛍光を測定することによって計算することができるGrynkiewicz ら ¹¹によって記載されているように、それぞれ、カルシウムキレート剤を添加して細胞を透過性にすることによってicator。

カルシウムシグナルを測定するフローサイトメトリーの使用は、最初の機会は、膜の完全性および分離細胞集団の、単一波長の開発と組み合わせ懸濁液中の細胞の必要性などの複数のパラメータを測定するための免疫学的細胞中で1980年代に開発されたカルシウム指標は理想とconvenientdetection方法^13-15たフローサイトメトリーを作った。付着細胞では、生細胞イメージングは​​、カルシウムシグナル伝達、最も重要な動力学に関するほとんどの情報を提供するが、取得するための温度等の蛍光顕微鏡、灌流システム、細胞環境の維持を含む複雑な設定、および特殊な顕微鏡ソフトウェアが必要データを分析する。そのような蛍光マイクロプレートリーダーまたはpharmacolなどの代替方法カルシウムキレート剤の使用によるogical手段は、得られた情報の点で比類のないです。フローサイトメトリーの研究の大部分においてのみ、エンドポイントの測定が行われ、より広くも付着細胞における細胞質カルシウムを監視するために使用されるようになっている。最初にはGergely らによって開発された方法を用いて製造した。免疫学的B細胞¹⁶に、サンプル集団の個々の細胞の蛍光強度をモニターするリアルタイム動態を用いたフローサイトメトリーによる細胞質ゾルの遊離カルシウム濃度の変化および正常癌上皮細胞で測定されているそして癌は細胞ハイブリッド^17幹 。この方法は、さらにカルシウム指示薬¹⁸とロードすることが困難であり、付着上皮細胞での使用に適合した。

ここでは、ラット腎臓近位尿細管（WKPT-0293 ^Cl.2）19のS1セグメントに由来する不死化接着性上皮細胞株を使用して、我々は、最適化を簡略化メートルを記述フローサイトメトリーによる細胞質カルシウム濃度の変化を測定するためのethod。多くの上皮細胞は、アニオン性化合物のための有機トランスポーターの数を有しているので、カルシウム指示薬を用いた細胞のローディングは挑戦であることを証明することができます。カルシウム指示薬、プロベネシド、ペニシリン²⁰の腎排泄を減少させるために開発された当初は原型的有機アニオントランスポーターの阻害剤との流出を防ぐために、インキュベーション培地に同時に印加される。細胞は、カルシウム指示薬をロードするための単層で維持化合物添加直後に検出することができるサスペンションカルシウム信号にされる。

プロトコル

試薬およびソリューションの調製

1. 修正されたハンクス平衡塩溶液（HBSS）の準備（単位：mm：136.9のNaCl、5.37のKCl、0.34のNa ₂ HPO _4、0.44 KH ₂ PO _4、4.17のNaHCO _3、pHは7.2、無フェノールレッド）。 4℃で保存。
2. 1.5 M CaCl ₂および2 M 4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）（pH7.2）中で蒸留水を用いてストック溶液を作る。
3. プロベネシドの250 mMストック溶液を調製する。遊離酸の形のために（多くの場合、水不溶性と呼ばれる）、1 N NaOH中プロベネシド粉末を溶解し、蒸留水で最終容量の3/4充填し、ゆっくりと1 N HClでpH7.4に滴定する。 4℃で保存。
4. 1mMのストック濃度を、無水ジメチルスルホキシド（DMSO）中の蛍光膜透過性カルシウム結合色素を溶解する。暗闇の中で-20℃で保存。
5. 各実験の前に、新鮮にプロベネシド含有Hを準備1.5のCaCl _2、10mMのHEPES、pH7.2で、5％ウシ胎児血清、2mMのプロベネシド、および5.55 mMグルコース（最終濃度）で修飾されたHBSSを組み合わせることにより、BSS束（PHF）バッファ。 37℃まで暖かい。

2.細胞培養

1. 標準培養培地中の6ウェルプレートまたは35ミリメートル皿のウェル当たりプレート2.5×10 ⁵腎臓近位尿細管細胞（WKPT-0293 Cl.2）とは、約70％のコンフルエンシーに達した2日間成長。

3.カルシウム色素負荷

1. 各ウェルまたはディッシュは、5％ウシ胎児血清、4μMの細胞透過性カルシウム結合色素および2mMのプロベネシドを含む1mlの培地を混合する。
2. 各ウェル内の1mLのローディング色素の混合物と培地を交換し、5％CO ₂の加湿インキュベーター中で30分間37℃でインキュベートする。蛍光指示薬の退色を防止するためにアルミホイルでプレートをカバーする。

のCe 4.準備フローサイトメトリー用LLS

1. 37℃の温かい0.05％トリプシン - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液を調製した。
2. 各ウェルから吸引し、カルシウムローディング色素溶液およびウェルの壁に沿って1ミリリットルのトリプシンを加える。
3. すべての細胞が剥離されるまで37℃でインキュベートする。
4. 1分間10,000gで微量遠心分離することにより、1.5mlチューブ、ペレットへの転送細胞。
5. 慎重にペレットを乱すことなく、上清を吸引除去する。
6. ピペッティングにより1ミリリットルのPHFバッファと再懸濁を追加することで細胞を洗浄。
7. 1分間、10,000gで遠心分離して細胞をペレット。
8. 繰り返して4.6を繰​​り返します。 4.7。さらに2回。
9. 500μlのPHFバッファーの最終体積で細胞を再懸濁し、1時間以内に実験用の細胞を使用しています。
10. オプション：細胞濃度を決定するために、細胞をカウントし、5×10 ⁴個の使用-測定あたり1×10 ⁵細胞。

5.フローのCytオメーターのセットアップ

1. フローサイトメーターを開始流体工学引き出しを開いて、シース流体タンクの空気圧を増加させるために、ベントバルブトグルスイッチを入れる。
2. 「プライム」インナーチューブとフローチャンバー内から潜在的に存在する気泡を除去するための器具。
3. フローサイトメトリーソフトウェアでは、オープン2ドットプロットウィンドウ。
   1. 最初のドットプロットは、前方それぞれそのサイズとその粒度、通る試料内の細胞の品質を制御するために、Yパラメータ用のXパラメータと側方散乱光（SSC）のための散乱光（FSC）が必要です。
   2. 第2のドットプロットは、カルシウム結合色素の蛍光強度を測定する。リニアスケール上のXパラメータに秒単位で対数スケールと時間を使って、Yパラメータに適切な蛍光検出チャンネルを選択します。
4. 「高」に流量を設定。

6.フローサイトメトリーMeasurement

1. RTで測定を行う。サンプルチューブ（11.5×75 mm）のフローサイトメトリーでは、480μlのPHFバッファーを追加します。
2. 混合する20μlの細胞懸濁液と簡単に渦を追加します。
3. 側にチューブ支持アームを移動し、緊密なシールが形成されるまで試料注入管を介してサンプルチューブを配置します。元の中心の位置に管支持アームを返します。
4. 試料の平均蛍光強度は、少なくとも約10 ^2、y軸上になるように蛍光チャネルを調整することにより、測定を最適化する。保存し、その後の実験のために使用します。
5. 実験を開始するには、繰り返し6.3に6.1を繰り返します。
6. 50秒間録音するベースライン蛍光。
7. 簡単に追加、関心、渦の化合物をサンプルチューブを取り外し、試料注入管に戻り、測定を一時停止します。このステップでは、15秒以上かかるべきではありません。
8. 測定を再開し、204.8秒の合計継続。
9. カルシウムのiを使用してくださいonophoreなどのイオノマイシン（10μM）、エチレングリコール四酢酸（EGTA）などのカルシウムキレート剤、のMnCl _2、のCoCl _2（2mM）を、それぞれ陽性および陰性対照のため。

7.データ解析

1. そのようなWinMDI（フローサイトメトリー用のWindowsマルチドキュメントインターフェイス）、スクリップス研究所、フローサイトメトリーコアファシリティでジョー·トロッターが開発した無料のソフトウェアパッケージとして、オフライン分析のための専用のフローサイトメトリーソフトウェアを使用してデータを分析します。
2. SSCおよびFSCパラメータを持つドットプロットを開きます。
3. データ分析から左下隅（ 図1）で見つかった死んだ細胞や細胞破片を排除するために「リージョン」ツール（画像上で右クリック）を使用して、分析のための細胞の地域を選択します。
4. 象限分析（ 図2）
   1. y軸上のx軸、蛍光強度の時刻との密度プロットを開く。すべてのイベントを使用してください。
   2. 私達7.3と同様にゲート領域を電子。
   3. 「クアドラント」ツールを使用してデータを定量化する。
   4. 垂直線は、化合物添加時に配置され、水平ライン対照におけるベースライン蛍光の中央に配置されるように、象限セパレータを調整する。象限セパレータの位置決めはすべてのサンプルで同じであることを確認してください。
   5. 各象限における細胞の割合は、各コーナー（ 図2）に表示される。サンプル間の右上の象限（UR）を比較。
5. ヒストグラム解析（ 図3）
   1. x軸とy軸上のイベントでの蛍光強度ヒストグラムウィンドウ内の制御データを開く。すべてのイベントを使用してください。
   2. 絵入り概要については、オーバーレイプロットとして対照区（[ファイル]→[オーバーレイ→[ファイルを開く]→[ファイル]）と比較されるようにテストデータを追加します。
   3. 定量分析のために、単一のヒストグラムは勝つdowsを使用する必要があります。ゲートステップ7.3から領域R1を使用して、細胞集団。
   4. 未処理対照では、制御ピークの最小および最大蛍光の中間点から開始して最大蛍光強度で終わる分析するための領域をマークするマーカー機能（「マーカー」）を使用。この領域の細胞の割合を算出する。
   5. 統計ウィンドウからデータを取得します。分析のための同じマークされた領域を使用して、データファイルを、残りの手順を繰り返します。
6. 蛍光強度分析（ 図4）
   1. y軸上のx軸、蛍光強度の時刻とのドットプロットを開く。すべてのイベントを使用してください。
   2. 「カイネモード」と「オーバーレイカイネライン」を有効にします。青い線は平均蛍光強度を表すドットプロットに表示されます。
   3. 複数の矩形領域を作成することで、相対的なカルシウム流入を定量化する。各領域は、AWが必要です「10秒」に相当する「50」、約のIDTH。 15矩形領域を定義。
   4. 統計ウィンドウから定量化を取得して、スプレッドシートにコピーします。
   5. 解析のためのyの平均データを使用しています。 20〜50秒に相当する、R6にR2の平均を計算します。これは、ベースライン値である。
   6. カルシウム流入分析（発症、持続時間と強度に依存する）のための適切な時間間隔を選択します。
   7. 100％に設定されている化合物の添加の前に、蛍光シグナルであり、平均ベースライン値からの相対間隔をこの時間内に、各領域からのカルシウムシグナルを計算する。地域の平均と標準偏差を決定する化合物の添加を投稿。これは、化合物によって誘発される平均カルシウムシグナルである。

結果

細胞質カルシウムを増加させるために、2薬理学的化合物は、細胞透過性カルシウム結合色素、フルオ-3-AMを負荷し、腎近位尿細管細胞（WKPT-0293 Cl.2）に適用した。未処理の対照試料は、プロベネシドの存在下でのカルシウム結合色素を負荷し、混合したが、任意の化合物を添加せずに行った。タプシガルギン（TG）は、ERからの漏れにつながると細胞質カルシウムの増加をもたらすSERCAポンプの古典的阻害剤である。ツニカマイシン（TUN）ブロック小胞体ストレス応答の活性化を導くタンパク質のN-グリコシル化だけでなく、細胞質ゾルのカルシウム^18,21-が増加^します。陽性対照として、イオノマイシン（IONO）、細胞外カルシウムに対する原形質膜透過性作るカルシウムイオノフォアを使用した。分析のために、細胞集団は、SSC / FSCドットプロット（ 図1のR1）内の領域を選択することによって、ゲートされた。時間に対する蛍光強度の濃度のプロットは、各データファイルのために作成された。象限関数を用いて、ドットプロットは、化合物添加前と後のFluo-3の蛍光強度を表す4つの領域に分...

ディスカッション

カルシウムは、セカンドメッセンジャーシグナル伝達分子として、また、ERおよびミトコンドリアの間で通信するための手段として、複数の細胞プロセスにおいて重要な事象である。自由な細胞質カルシウム濃度の変化を測定する能力は、細胞生物学のすべての領域に適用することができる有用な技術である。細胞質ゾルのカルシウムシグナルを検出するための様々な方法がある。古典的には、このようなフラ-2のようなレシオメトリックカルシウム指示薬からの信号は、最小および最大蛍光強度を決定するから誘導することができる蛍光イメージングセットアップ絶対カルシウム濃度を用いて、生細胞でモニターされる。しかし、この技術は、蛍光顕微鏡、設定生細胞イメージングおよび解析ソフトウェアとして、特殊な装置を必要とする。ここでは、ほとんどの研究室にアクセス可能なフローサイトメトリーを用いて、付着上皮細胞の細胞質ゾル、カルシウム検出のための単純な方法を記載する。

上皮がpoにあり代謝物、生体異物や薬物の輸送に関与トランスポーターの配列のssession。特に重要なのは、有機陽イオンと有機アニオントランスポーターが^22を...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Fluo-3, AM	Invitrogen	F-1241	細胞透過性
Probenecid	Sigma-Aldrich	P-8761	水不溶性、1 N NaOH
0.05% Trypsin-EDTA (1X)	Invitrogen	25300-062
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I9657
Thapsigargin	Tocris Bioscience	1138
Tunicamycin	Sigma-Aldrich	T7765
FACSCalibur Flow Cytometer +CELLQuest software	Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)	Joe Trotter, The Scripps Institute		これは、FCS 2.0 準拠のファイルを読み取る古い 16 ビット アプリケーションですが、FCS 3.0 デジタル データは認識しません。
WKPT-0293 Cl.2 ラット腎臓近位尿細管細胞株			Ulrich Hopfer博士(生理学部門 &生物物理学、Case Western Reserve University、オハイオ州クリーブランド)