携帯収縮機能を評価するために、マイクロスケールのシリコンカンチレバーの活用体外

サマリー

このプロトコルは、 インビトロで筋細胞の収縮性を測定するための柔軟な培養表面としてマイクロスケールのシリコンカンチレバーの使用を記載している。細胞収縮を測定記録し、 インビトロで収縮機能を測定するための非侵襲的かつスケーラブルなシステムを提供し、力の読み取り値に変換することができるカンチレバー屈曲を引き起こす。

要約

インビトロアッセイにおける複数の予測と生物学的に関連の開発は、播種した細胞の機能評価を容易にする多目的な細胞培養系の進歩に基づく。そのため、マイクロカンチレバー技術は、曲げ収縮誘発性基板の評価を通じて、骨格筋、心筋、および平滑筋細胞などの細胞型の範囲の収縮機能を測定するためにどのプラットフォームを提供する。多重化されたカンチレバーアレイのアプリケーションは、薬物の有効性および毒性、疾患表現型および進行、ならびに神経筋および他の細胞 - 細胞相互作用を評価するためのハイスループットプロトコルに適度な開発する手段を提供する。この原稿は、この目的のために信頼性の高いカンチレバーアレイを製造するための詳細、およびこれらの表面上に成功裏に培養細胞に必要なメソッドを提供する。さらなる説明は、機能的肛門を実行するのに必要なステップに設けられている新規なレーザーおよび光検出器システムを使用してそのようなアレイ上で維持収縮性細胞型のysis。ハイライトの精度と、このシステム、ならびにこのような技術を適用することができる研究の広い範囲を使用して可能な収縮機能の分析の再現可能な性質を提供した代表的なデータ。このシステムの成功広く採用は、組織のパフォーマンス、疾患の発症および新規治療的処置に対する応答のより正確な予測をもたらす、インビトロで迅速、低コストで機能的研究を実行するための手段を研究者に提供することができる。

概要

ヒトとげっ歯類の両方の供給源からの筋肉細胞のin vitro培養は、何十年も前から可能でした^1,2。しかし、標準的なカバースリップ製剤は生化学的評価には有用ですが、細胞の主要な機能出力(収縮性)の分析には役立たないため、細胞の成熟度や性能を評価する手段としての価値はやや限られています。このようなin vitro培養から得られるデータ量を最大化するためには、その機能性能をリアルタイムに評価できる構成で細胞を収容できるシステムの開発を進める必要があります。多数の3次元筋モデルの確立は、このニーズを満たすためにいくらかの進歩を遂げており、そのようなシステムは、in vitroで培養された筋肉細胞の収縮能力を評価する手段として多くの出版物で使用されています^3-5。このようなシステムは、組織モデリングや再構築の研究には非常に貴重ですが、シングルセル応答の研究への適用性は限られています。このような場合、単一繊維研究が必要な場合、複雑で労働集約的なex vivo方法論が唯一の選択肢として残っています^6-10。さらに、医薬品開発およびスクリーニングプロトコルのための複雑な多臓器プラットフォームの開発に向けた現在の動きは、非侵襲的で、容易に拡張可能で、支持細胞および組織モデルと容易に統合できるシステムの確立を必要としている¹¹。

マイクロスケールのカンチレバーは、単一細胞/細胞の小さな集団^12,13の機能的収縮能力を評価するための簡単な方法を提供します。この技術は、改良型原子間力顕微鏡(AFM)技術¹⁴に基づいており、レーザーと光検出器システムを使用して、培養筋管収縮活動に応答するマイクロスケールのカンチレバーのたわみを測定します。次に、修正ストーニーの方程式を使用して、筋管内の応力と、観察された基板のたわみ¹⁵を生成するために筋管によって加えられる力を計算します。多重化されたカンチレバーアレイの同時評価を可能にするスキャンプログラムが書かれており、薬物毒性/有効性研究^15,16のための中程度から高いスループットアプリケーションの可能性を提供しています。このような技術は、in vivoで薬効を予測するための機能的な前臨床アッセイの開発において非常に貴重であることが証明される可能性があります。さらに、シリコンでカンチレバーチップを作製しても、免疫染色、ウェスタンブロッティング、PCRなどの標準的な生体分子アッセイのための細胞の解析後処理が妨げられません。

この原稿は、マイクロスケールのシリコンカンチレバーの製造と調製、ハードウェアとソフトウェアのセットアップ、およびこれらのチップで培養された収縮性細胞の機能を評価するための操作ガイドラインに関する詳細な指示を提供します。標準的な細胞培養技術は、これらの表面上の細胞のプレーティングとメンテナンスに実装できるため、信頼性の高い培養パラメータが存在する収縮性細胞タイプであれば、このデバイスと簡単に統合できるはずです。このシステムで使用される比較的単純な2D培養パラメータは、他の細胞モデルの統合や、筋肉と相互作用できる細胞タイプ(神経支配ニューロンなど)の追加を容易にし、より複雑な機能的なin vitroアッセイや哺乳類システムの多臓器モデルの開発におけるこのモデルの適用性を大幅に向上させます。

プロトコル

1カンチレバーチップ製造

説明した製造工程を図示した細部は、 図1に示す。

1. オーブンでシリコン·オン·インシュレータ（SOI）ウェーハを配置し、それらを脱水し、20分間125℃で焼く。
2. プラズマを用いて脱水したSOIウェハのハンドル層上に酸化ケイ素の1.5μmの厚さの層を堆積させる化学気相成長法（PECVD）ツールを強化。
3. デバイス層を上に向けてスピンコーターチャック上のウエハを配置します。 、ウエハがセンタリングされていることを確認し1000回転/秒の加速度で60秒間、3000rpmでウェハの中心、そしてスピンでP20プライマーの2ミリリットルを分注する。 P20プライマーは、デバイス層にフォトレジストの接着を促進する。
4. ウェハをスピンコータチャック上にある間に、ウェーハの中心にS1818フォトレジストを2mlを分配、およびo ​​1,000回転/秒の加速度で60秒間3,000 rpmでスピンフォトレジストの厚さ1.5μmの層をbtain。
5. ホットプレート上でウェーハを置き、1分間115℃でソフトベークを行う。
6. デバイス層上のフォトレジストにカンチレバーマスクからパターンを転写するためにフォトリソグラフィーコンタクトマスクアライナを使用してハードコンタクトUV露光を行う。 125 MJ / S1818フォトレジスト用cm ²の露光エネルギー値に基づいて露光時間を算出する。
7. 優しく前後にウェハを振りながら、1分間726 MIFフォトレジスト現像液にウェハを浸漬することにより、フォトレジストを開発する。
8. 脱イオン（DI）水を用いてウェーハをリンスし、それを乾燥、好ましくは、スピンリンス乾燥（SRD）ツールを使用して。
9. アセトンに浸した綿棒を使用して（端から5mmまで）ウェーハのエッジからフォトレジストを除去します。
10. フォトレジスト側を上にして、ディープ反応性イオンエッチング（DRIE）ツールで、ウェーハをロードし、デビを通じてパターニングされたシリコン層をエッチングするレシピを実行CE層。エッチストップとしての埋め込み酸化物層の機能なので、完全なエッチングを確実にするために必要であると予想されるよりも50％〜100％以上のサイクルでエッチングを行う。
11. フォトレジストを除去するために20分間のホットフォトレジスト浴溶液にウェハを配置します。 DI水でウェーハを洗浄するためにクイックダンプリンサ（QDR）にウエハを転送します。フォトレジスト剥離後、ウェーハを洗浄し、乾燥さSRDツールでウェーハをロードします。期待どおりカンチレバーパターンが表示されていることを確認するために、顕微鏡下でウェハを検査します。
12. PECVDツールを使用して、ウエハのデバイス層の上に非ドープ酸化シリコンの厚さ1μmの層を堆積。さらなる処理ステップ中にカンチレバーの保護層としてこの酸化物層は機能する。
13. ウェハの裏面の処理を開始するために上に向け、ハンドル層をスピンコータチャックにウェハを配置します。 、ウエハがセンタリングされていることを確認し、ウェハの中央にP20プライマーの2ミリリットルを分配し、3000 rpmでスピン1,000回転/秒の加速度で60秒間。
14. ウェハはスピンコーターチャックに入れたまま、ウエハの中心にSPR220-4.5フォトレジストの2ミリリットルを分配し、1000回転/秒の加速度で45秒間、2000rpmでスピンの6.5ミクロンの厚さの層を得るためフォトレジスト。
15. 2分間115℃でソフトベークを実行するために近接ホットプレート上にウエハを配置します。
16. 前面/背面の位置合わせが可能なフォトリソグラフィコンタクトアライナーを使用して、前側カンチレバーパターンに裏面ウィンドウマスクを位置合わせし、ハンドル層上のフォトレジストに裏面ウィンドウマスクのパターンを転写するために、ハードコンタクトUV露光を行う。 SPR220-4.5フォトレジスト480 MJ / cm ²の露光エネルギー値に基づいて算出された露光時間を使用する。
17. UV露光の後、ウェハは、次の処理ステップの前に30分間、暗い領域に残るう。
18. ウエハを浸漬することによりフォトレジストを現像2分間726 MIFのフォトレジスト現像液を穏やかに前後にウェーハを振とうしながら。
19. 脱イオン（DI）水を用いてウェーハをリンスし、それを乾燥、好ましくは、スピンリンス乾燥（SRD）ツールを使用して。
20. 12時間90℃のオーブンでウェーハを配置します。
21. フッ素化ガスによるRIEシステムおよび酸化物をエッチングするためのレシピを用いてウエハの裏面に酸化シリコン層をエッチングする。ウェハの裏面上のパターン化された酸化物は、さらなる処理のためのエッチングマスクとして機能する。露出したウィンドウ内の酸化シリコンが完全にエッチングされることを保証するために、顕微鏡下でウェハを検査します。
22. アセトン中に浸し、クリーンルーム綿棒を使用して（端から5mmまで）ウェーハのエッジ上にフォトレジストを除去します。
23. とDRIEツールでウエハをロードし、エッチストップとしての埋め込み酸化膜の機能化を500μmの深さにパターン化されたハンドル層をエッチングするためにレシピを実行します。の過熱を防止するために、複数の実行中に、このエッチを分割シリコンの一貫性のないエッチングを引き起こすウェーハ。このエッチング工程は、完全にカンチレバー下のシリコンを除去します。
24. カンチレバー下記の埋め込み酸化物層とカンチレバーの上に保護酸化物層を除去するために、25％希釈HFエッチング液を用いたウェットエッチング工程を行う。
    注：この手順は、シリコンカンチレバーの底面を解放し、また、レーザーでカンチレバーをプローブするためのアクセスを提供するために下にあるウィンドウが開きます。
25. DI水浴場のシリーズと窒素で丁寧に乾燥を用いてウェハを洗浄します。カンチレバーは、その拠点でのみサポートされているので、直接カンチレバーにDI水または不活性ガスの強制スプレーを使用しないでください。
26. ハンドル層エッチング工程中に生成劈開ラインに沿ってウェハから各チップを切断する。

2細胞培養

1. 以前に公開されている方法¹⁷に従って13Fカバースリップを準備します。
   注：もし13F入り江rslipsが利用できない、95°以上の接触角を有する任意の疎水性表面を使用することができる。
2. カンチレバーチップ、70％エタノール溶液中の13Fカバースリップを滅菌し、フローフード中で空気乾燥させ。
3. 標準12ウェルプレートの内側13Fカバースリップの上に個別のカンチレバーのチップを置きます。
4. コー​​ト細胞型について最適化されたバイオポリマーまたは表面修飾を有するカンチレバーは、標準的な細胞培養プロトコルに従って使用されている。
5. 所望の濃度へのそれらの特異的な増殖培地中で細胞を再懸濁する。
   注：このプロトコルは、カンチレバー窓から落下し、所望のカンチレバー表面に付着していない細胞のかなりの数になります。細胞調製は、したがって、標準的なカバースリップの準備のためよりも濃縮3~4なされるべきである。例えば、ラット骨格筋衛星細胞の播種は、典型的には500〜セル/平方ミリメートル^15,16の播種密度を使用して行われる、および/平方mm 2000個の細胞でカンチレバー基板で使用されます。最適化実験は、適切な播種密度を確認するために、新しい細胞源を用いて実施されるべきである。
6. 媒体の気泡が完全にカンチレバー窓を覆う確保カンチレバーチップ表面上に細胞懸濁液200μlをピペット。媒体が窓から発散し、カンチレバーの上に静的な泡を形成しない場合は13Fのカバーガラスを交換し、メッキを再試行してください。
7. インキュベーターにチップを含むプレートを移し、細胞が少なくとも1時間（好ましくは2〜3時間）のために接着させる。
8. このメッキ期間の後、増殖培地1mlの文化を13Fカバースリップすることなく、きれいなだけでなく、チップを転送し、トップアップするために滅菌ピンセットを使用しています。
9. インキュベーターにプレートを返します。
10. カバーガラス上のインビトロ維持のための彼らの標準的なプロトコルに従って細胞を維持する。骨格筋細胞のために、細胞がコンフルエントになったら、筋管形成を誘導する培地組成のスイッチが必要になります。

カンチレバーのたわみ解析のためのハードウェアおよびソフトウェアのセットアップ3。

1. 直立電気生理学顕微鏡のステージに加熱された培養皿を置きます。
2. 加熱された顕微鏡ステージに細胞が現在（+ 10mMのHEPES）中に懸濁さ給餌培地3mlを加える。
3. 15mmの離間距離で加熱された培養皿の内側のステンレス鋼電極をマウントし、パルス発生器に接続し、変化する強度、周波数、及び波形の電界刺激パルスを生成することができる、システムは電場刺激を生成できるようにする細胞の適切なとき。
4. ボルトヘリウムネオンレーザーは、顕微鏡台の下面に、XY並進ステージ上に取り付けられ、レーザビームは30°の角度で加熱した培養皿の底を通って導かれるように調整relativカンチレバーの面に電子。
5. ボルト象限光検出器モジュール、顕微鏡ステージの下側に、XY並進ステージ上に取り付けられ、4象限の中央になるように反射されたレーザ光 ​​の土地の位置を調整してください。 図2は、設定されたハードウェアの概要を説明します記載されたプロトコルを実装するために必要な。
6. カンチレバーを横切って走査するリニアアクチュエータを制御するためのソフトウェアプログラムを記述します。 図3に設けフローチャートを参照して、ソフトウェアプログラムを書くこのシステムで使用するためにプログラムされたグラフィカルインターフェイスは、 図4に設けられている。

4。録音カンチレバーたわみデータ

1. カンチレバー分析ハードウェアと関連ソフトウェアをオンにします。
2. 媒体への加熱されたステージのサーミスタを挿入し、それが37℃を読むことを待つ。
3. cantileveと段階にカンチレバーチップを挿入ステージの右手側に向けrsは。
4. 顕微鏡の光源をオンにしてください。
5. 視野にカンチレバーのエッジをもたらし、カンチレバー1 NOTEの先端にレーザビームを位置決めするレーザー/光検出器制御ソフトウェアを使用するために顕微鏡の焦点を合わせる：カンチレバーがステージの右に向いていると仮定すると、カンチレバー1配列の左上に配置された1つであり、数字は左下に16にダウンを実行。カンチレバー17は、右上の位置にあり、右下の（ 図5A）で32に実行されます。
6. を押して、録音ソフトウェア上で「再生」。
7. 位置の光検出器信号は光検出器を制御するステッピングモータを調整することにより、xとyの両方のフレームに「0」を読み出すようになっている。
8. レーザー/光検出器制御ソフトウェアで設定カンチレバー1の位置（ 図4）。
9. ステップ4.7を繰り返して、カンチレバー16の先端にレーザーを移動させ、cantilevを設定えー、レーザー/光検出器制御ソフトウェアの16ポジション。
10. カンチレバー32は、手順4.7の先端にレーザーを移動させ、レーザー/光検出器制御ソフトウェアのカンチレバー32の位置を設定します。
11. カンチレバー17は、手順4.7の先端にレーザーを移動させ、レーザー/光検出器制御ソフトウェアのカンチレバー17の位置を設定します。
12. 顕微鏡光源と実験室でのオーバーヘッドライトをオフにします。
13. 録音ソフトウェアを押して「記録」。
14. 1Hzの周波数で40ミリ秒、5 Vのパルスに対するパルス発生器のハードウェアを設定し、マシンの電源を入れます。
    注：必要に応じて、この時点では、特定の細胞ソースの最適化された刺激プロトコルを採用して、述べ設定は、ヒトとげっ歯類の細胞源^{12,13,15,16を}使用して収集されたデータに基づくガイドラインである。
15. レーザー/光検出器制御ソフトウェアを使用して、32カンチレバーアレイを横切って走査するためのハードウェアを設定し、それぞれの上に5秒間停止メール。
16. 32カンチレバーのスキャンが完了すると、次に録音ソフトを停止し、データファイルを起動し、刺激装置をオフにしてください。
17. 収縮活動の証拠について、それぞれのカンチレバーから記録されたトレースを調べます。陽性反応をそれぞれのカンチレバーをメモしておきます。偏向は、ベースラインよりも少なくとも0.1 Vである場合に収縮がピークと定義される。
18. レーザー/光検出器制御ソフトウェア上のスキャンプロトコルから任意の非応答性のカンチレバーを取り外します。
19. アクティブカンチレバーは、細胞の自発収縮活動の測定値を得るために刺激することなく、再スキャンすることができる。
20. 培養された細胞の機能的出力への影響を観察するために、媒体への治療用化合物を添加した後、電気刺激または幅広い分野ずにスキャンを実行します。
21. 電気的に延長された期間とCONTRのスキャンレベルのために細胞を刺激することにより、疲労評価を実施 actilityは、それが特定のしきい値以下に低下するピーク力のためにかかる時間を測定した。
22. 運動ニューロンは筋肉との共培養で維持されている実験では、またはシナプス阻害剤（ 例えば 、D-ツボクラリン）と走査（グルタミン酸など）、神経刺激薬と運動ニューロン、筋管カンチレバー共培養の処理により、神経筋接合部の形成を測定自発的活動の増加と減少はそれぞれ^16。
23. 計画された実験の必要性によって指示されるように、特定のスキャンを実行します。

カンチレバーたわみデータの解析5。

1. 使用して、ストーニーの方程式は¹⁵細胞層または筋管（パスカル）、および（ナノニュートン）は、細胞の収縮力を直接測定における応力の読み出しに（ボルト）で生カンチレバー偏向データを変換する（詳細は下記）更新日：
   広告/ 51866 / 51866eq1.jpg "/>式（1）
   式2
2. ここで、δ=筋管によって生成カンチレバー先端のたわみや応力、筋管によって生成_σC =ストレス、写真上のレーザー位置に電圧を関連するカンチレバー、C型_検出器 =システム固有の係数の均一な厚膜と仮定すると全幅-detector、θ=カンチレバーの面に対するレーザおよび検出器の角度、E _Siはシリコンの弾性率=、tの_SiはSiの毒=ポアソン比V、T _fは筋の厚さ 、カンチレバーの厚さ=シリコンカンチレバー先端から検出器へのレーザのL =片持ち梁の長さ、P =経路長、およびw _{図6に提供される。}
3. ストレスとストーニーのの適用のために使用されたと仮定し、セルの断面積からの力の計算を等しくすることで、筋管が均一な膜である、筋管の力が式3につながる、フィルムの力に等しいと仮定すると方程式。
   式3
4. 機能的なデータ収集に続いて、免疫細胞化学分析のためにカンチレバーチップを修正するか、標準的な技術を使用してタンパク質またはDNA分析のために細胞を利用する。
5. 必要に応じて、代わりに、後の時点で機能的性能を再評価するために、分子解析のための準備のインキュベーターにセルを返します。

結果

カンチレバー上の収縮性細胞の成功した文化は、標準的な細胞培養技術（ 図5）を利用して、比較的簡単な手順です。収縮する細胞を支持するカンチレバーの割合は、細胞型を調べ、特定の培養技術が採用さに依存して変化する。ラット後肢由来の初代胚細胞を使用して、収縮活動を調べカンチレバーの12％で検出された（n = 4）であった。記載レーザーと光検出器システムを使用して収縮機能の分析は、播種された細胞の機能的成熟に関連する正確なリアルタイムデータを提供する。 図7に示すように、標準的な電気生理学的なソフトウェアの使用は、その後、そのようなピーク力、力のピークまでの時間、および半弛緩までの時間などの関連する機能的特性の計算を容易にする、生データを分析するために使用することができる。処理した培養物からのその後のデータ収集治療用化合物とを可能にしと、薬剤を添加しない機能特性の比較をすることにより、化合物の活性及びin vivoでの応答のその後の予測の評価を可能にする。また、拡張された刺激プロトコルは、このように、このシステム（ 図8）から得...

ディスカッション

細胞収縮の証拠マイクロカンチレバーを分析する重要なステップは、顕微鏡ステージ内のカンチレバーチップの配置、配列内のコーナーカンチレバーの先端がレーザーと光検出器のその後のアラインメントである。これが正確に行われない場合、ソフトウェアは、潜在的にデータ収集中に偽陰性の蓄積につながる、アレイ内の残りのカンチレバーの位置を推定することができません。オペレータは、カンチレバーチップは、レーザー位置を校正する前に、培養皿の底と面一に嘘をついていることを確認するために注意する必要があります。チップは皿に角度で座っている場合には、偏向されたレーザビームの経路を変更し、データ収集を混乱させるであろう。

機能的な空気の表は、データ収集の間、バックグラウンドの振動を相殺するために使用されなければならない。本研究で用いたカンチレバーの厚さが薄い（約4ミクロン）広報収縮活動に対して高い感度をovidesが、振動に対する感度の増加の副作用を有する。オペレータは、バックグラウンドの測定値を減らすために、データの記録中はできるだけハードウェアを中心に移動するように注意する必要があります。段階でのカンチレバーチッ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
初代ラット筋成長培地
ニューロベースル培地	Life Technologies	21103-049
B27 (50x)	Life Technologies	17504044	1x
グルタマックス (100x)	Life Technologies	35050061	1x
G5 supplement	Life Technologies	17503-012	1x
Glial-Derived神経栄養因子	細胞科学	CRG400B	20 ng/ml
脳由来神経栄養因子	細胞科学	CRB600B	20 ng/ml
毛様体神経栄養因子	細胞科学	CRC400A	40 ng/ml
ニューロトロフィン-3	細胞科学	CRN500B	20 ng/ml
ニューロトロフィン-4	細胞科学	CRN501B	20 ng/ml
酸性線維芽細胞成長因子	Life Technologies	13241-013	25 ng/ml
Cardiotrophin-1	Cell sciences	CRC700B	20 ng/ml
ヘパリン硫酸ヘパリン	Sigma	D9809	100 ng/ml
白血病抑制因子	Sigma	L5158	20 ng/ml
ビトロネクチン	Sigma	V0132	100 ng/ml
一次ラット 筋肉分化培地
NB Activ 4	Brain Bits LLC	NB4-500
機器
クラス 2 赤色ダイオード レーザー	ニューポート
光検出器	ノア インダストリー
ズ モデル 2100 パルス刺激装置	A-Mシステム
マルチクランプ 700B デジタイザ	アクソンインスツルメンツ
パッチクランプ顕微鏡とステージ	オリンパス
デルタ T4 培養皿コントローラ	バイオテックス
アクソスコープソフトウェア	分子デバイス
LabVIEWソフトウェア	ナショナルインスツルメンツ
37oC、5% CO2インキュベーター	NAPCO
Class 2 microbiological flow hood	Labconco
Pipettes and tips	Eppendorf