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方法論記事

脳神経細胞の初代培養の確立が続く動物の急速なジェノタイピング

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DOI:

10.3791/51879

⸱

2015年1月29日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

私たちは、新生児マウスの標識とジェノタイピング、およびそれらから一次ニューロン培養を生成する手順について説明します。ジェノタイピングは迅速、効率的、信頼性が高く、自動核酸抽出が可能です。これは、ジェノタイピングを事前に完了する必要がある新生児致死マウスとその培養物に特に有用です。

要約

哺乳類の神経細胞の形態および機能の高分解能分析は、多くの場合、ニューロンの初代培養物の分析を行った個々の動物の遺伝子型決定を必要とする。遺伝子型を決定する新生マウス、迅速な遺伝子型判定を標識し、そしてこれらのマウスからの脳のニューロンの低密度培養を確立する：我々はのための一連の手順について説明します。個々のマウスは、大人になって持続長期的な識別を可能に入れ墨の標識で標識されている。説明されたプロトコルによる遺伝子型決定は、高速かつ効率的で、かつ信頼性よく、核酸の自動抽出が可能になる。これは、従来の遺伝子型判定のための十分な時間が新生児致死苦しむマウスでは、例えば 、利用できない状況下で有用です。初代ニューロン培養物を、高い空間分解能で画像化実験を可能にし、低密度で生成される。この培養方法は、従来の神経めっきグリアフィーダー層の調製を必要とする。 Protocolは、運動障害DYT1ジストニア（ΔE-torsinAノックインマウス）のマウスモデルにその全体が印加され、神経細胞培養物を、これらのマウスの海馬、大脳皮質および線条体から調製される。このプロトコルは、他の遺伝子の突然変異を有するマウスに、ならびに他の種の動物に適用することができる。さらに、プロトコルの個々の成分は、単離されたサブプロジェクトのために使用することができる。したがって、このプロトコルは、神経科学ではなく、生物学的および医学科学の他の分野だけでなく、幅広い応用を持つことになります。

概要

遺伝病の

げっ歯類モデルは、正常なタンパク質と核酸の生理学的機能、およびこれらの欠陥の病態生理学的影響を確立するのに有用であることが証明されています。例としては、主要な細胞機能に関与するタンパク質が不足しているマウスや、アルツハイマー病などの疾患のマウスモデルなどがあります。しかし、特定の遺伝子操作により、新生児は生後間もなく、または数日後に致死率に達する可能性があります。これらの場合、生細胞は死前に胚または新生児の仔から採取でき、少なくとも数週間in vitroで維持でき、この間に初期のニューロン発生を生化学的、機能的、形態学的に追跡できるため、初代細胞培養は重要なツールとなります。初代培養では、ニューロンを低密度で播種することが有益です。これにより、個々の体細胞、樹状突起、軸索幹、神経終末を高い空間分解能で視覚化することが可能になります。しかし、低密度でのニューロンの生存と分化には、通常、ニューロンをグリアフィーダー層に播種するか、物理的に接触しない状態でグリア細胞と共培養するか、グリア1によってコンディショニングされた培地で培養する必要があります。

グリアフィーダー層上での低密度ニューロン培養の確立は、数日かかるのとは対照的に、数時間以内の迅速で信頼性の高いジェノタイピングに先立って行うことができます。速度は、ニューロンの遺伝子型を事前に準備したグリアフィーダー層の遺伝子型と一致させる必要がある場合に特に重要です。より実用的な例として、実験の効率を最適化するために、培養物の生成にどの遺伝子型のどの仔犬を使用するかを決定する必要があるかもしれません。

ここでは、以前の出版物2-6で、高速で簡素化された信頼性の高いマウスジェノタイピングに使用されてきた作業プロトコルを示しています。マウステールと市販のキットを使用。このプロトコールには、組織からの核酸のシングルステップ抽出が含まれており、核酸精製ステップも終了バッファー(「停止溶液」)の使用も必要ありません。このジェノタイピング法の信頼性は、検体の開始量、動物の年齢、PCRアンプリコンの長さに違いが生じた場合の一連の試験結果を示すことで示されています。このキットには、自動抽出と信頼性という利点があります。

包括的であるために、遺伝子型マウスの長期的な同定のための入れ墨の使用も示されています。入れ墨は、皮膚の真皮(表皮の下)7に入れ墨インクを適用することによって達成されます。新生児または生後1日齢のマウスの足パッドに入れ墨をするための手順が説明されていますが、入れ墨は尾やつま先などの体の他の部分や、すべての年齢の動物に適用できます。さらに、マウスニューロンを低密度でプレーティングおよび培養するための手順を、異なるタイプのグリアフィーダー層2,8の最適化された調製に基づいて実証する。

私たちは遺伝性神経障害DYT1ジストニアの遺伝的マウスモデルを使用します。これは、遺伝子TOR1A(c.904_906delGAG/c.907_909delGAG;p.Glu302del/p.Glu303del)の突然変異によって引き起こされる常染色体優性運動障害です9。コードされたタンパク質であるtorsinAは、「多様な細胞活動に関連するATPase」(AAA+)ファミリーのタンパク質に属し、そのメンバーは一般にシャペロンのような機能を果たし、タンパク質のアンフォールディング、タンパク質複合体の分解、膜輸送、および小胞融合を支援します10-13。この突然変異は、グルタミン酸のコドンのインフレーム欠失をもたらし、「早期発症の全身性孤立性ジストニア」の発現につながる可能性があります14,15。しかし、この障害の原因となる病態生理学的メカニズムは、まだ十分に理解されていません。ノックインマウスモデルでは、変異対立遺伝子はTor1atm2Wtdであり、以下Tor1aΔEと記載します。ヘテロ接合型ΔE-トルシンAノックインマウスは生存可能であり、遺伝的にはDYT1ジストニアのヒト患者を模倣しているが、ホモ接合型ノックインマウスは出生後に死亡し16,17、出生後死亡までの潜伏期間は遺伝的背景18に影響される。ホモ接合型ノックインマウスの早期死亡は、動物のジェノタイピングとニューロン培養の確立の両方を迅速に完了することを必要とします。ジェノタイピングの別の例として、Tfap2a(転写因子AP-2α、活性化エンハンサー結合タンパク質2α)が使用されます。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、増殖、分化、生存、アポトーシスなどの複数の細胞プロセスを調節する上で重要である19。

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プロトコル

注:この研究で行われたすべての動物手順は、アイオワ大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。

1. 肉球の刺青を用いたマウスの長期同定

  1. 足パッド(足底面)を実験者に向けて足を固定します。親指と人差し指で前足を持ちます。足を挟まないように注意してください.
    注:安定した固定化は、タトゥー色素が足パッドの真皮に配置され、したがって永続的であることを保証するために重要です7。
  2. ガーゼスポンジまたは綿棒で70%エタノールで足パッドを綿棒で拭きます。
  3. 綿の先端のアプリケーターにスキンオイルを塗り、先端を肉球の表面に数回そっと押し付けます。スキンオイルは少量だけ使用してください。大量に存在すると、タトゥーの色素が皮膚に到達するのを防ぎます。
  4. 入れ墨の直前に、入れ墨の針の先端を入れ墨インクに浸します。清潔で無菌的で鋭利な入れ墨針を使用して、痛みと感染の可能性を減らし、入れ墨の効率を高めます。
  5. 肉球の表面を皮脂で覆った状態で、タトゥーの針先を肉球の中央にある皮膚に垂直かつ軽く押し付け、インクを複数回注入します。電気タトゥーシステムについては、材料/機器の表を参照してください。
  6. ガーゼスポンジに70%エタノールをスプレーし、足にそっと押し付けて皮膚表面の余分なタトゥー色素を取り除き、タトゥーの品質を検査します。肉球の中央に、通常の皮膚の色素沈着とは異なる暗くて丸い斑点があることを確認してください。タトゥーが暗くないか、見やすいほど大きくない場合は、前のタトゥーの手順を繰り返します。

2. Fast PCRジェノタイピングキットを用いた新生仔マウスのジェノタイピング

  1. マウスの尾の遠位端を70%エタノールで消毒し、尾の先端を5mm以下に切断し、PCRに用いるタイプの8チューブストリップのチューブに移します。各子犬には未使用のカミソリの刃を使用して、標本間の相互汚染を避けてください。または、はさみを使用しますが、この場合、70%エタノールを使用してブレードに残っている組織を慎重かつ徹底的に取り除きます。出血がないか確認してください。出血が発生した場合は、出血が止まるまでガーゼスポンジで尾の切り口部分に圧力をかけます。
  2. 200 μlのDNA抽出溶液を、検体が入った各PCRチューブに加えます。キットの構成と情報については、材料/機器の表を参照してください。
  3. チューブストリップをPCRサーマルサイクラーに入れ、次のプログラムを使用してDNA抽出を開始します:55°Cで1サイクルで10分間、95°Cで1サイクルで10分間、4°Cで保持します
    注:これは、後でPCRに使用されるのと同じPCRサーマルサイクラーです。
  4. DNA抽出が終了したら、サーマルサイクラーからチューブストリップを取り外し、5回反転させます。
  5. 各検体の溶液 (DNA 抽出物) 4 μl を 8 チューブストリップの未使用チューブに移し、10 μl の 2X PCR Ready Mix II、2 μl の混合フォワードおよびリバースプライマー (0.5 μM を推奨、配列については材料/装置の表を参照)、およびヌクレアーゼフリーの H2O 4 μl と混合します。 各標本について。卓上型遠心分離機を使用して短時間(例:3秒)回転します。チューブは、取り扱い時以外は常に氷の上に置いてください。
  6. サーマルサイクリングを実行します。サーマルプログラムについては、材料/機器の表を参照してください。
  7. 増幅されたDNA産物を検出します。PCRの全反応溶液(20 μl)をアガロースゲルのウェルに直接ロードします。分子量マーカーを別のウェルにロードします。電界を印加します。
  8. 紫外線下でのバンドの蛍光画像を取得します。

3. グリアフィーダー層上のマウス脳ニューロンの初代培養

注:脳の解剖と細胞解離(3.1)の手順は、その後のすべての手順に共通です。マウスグリア培養(3.2)、ラットグリア培養(3.3)、およびマウス神経細胞培養(3.4)の手順は、後で別々に説明します。

  1. 脳解剖と細胞解剖
    1. 1匹のマウスまたはラットの子犬を斬首して犠牲にし、脳を迅速に取り出し、ハンクス溶液(組成については表1を参照)+ 20%ウシ胎児血清(FBS)を35mm皿(氷上に保管)
      2. に入れます。
    2. 脳を正中線を通って2つの半球に切り取ります。関心のある領域(大脳皮質、線条体、海馬など)を脳の各半球から取り除きます。髄膜と主要な血管を表面から取り除きます。外科用刃を使用して脳領域を4〜10個の薄切りにします。
    3. 脳スライスを15 mLの遠心分離チューブで、ハンクス溶液+ 20%FBSで1回すすぎ、次にハンクス溶液(つまり、血清なし)で3回(すべて4°Cで)すすぎます。.すすぐには、5〜10 mlの溶液を加え、脳のスライスをチューブの底に落ち着かせ、溶液を上から吸引し、新しい溶液を追加します。溶液を吸引してすすぎ手順を終了します。
    4. 3 mLのシリンジと0.2 μmのシリンジフィルターを使用して、2 mLのトリプシン含有消化溶液(組成については表1を参照)をろ過し、脳スライスを含むチューブに濾液を直接加えます。RTでトリプシン化を13分間進行させます。
    5. トリプシン溶液を最初に吸引し、次に7〜10mlのハンクス溶液+ 20%FBS(4°C)を追加して中和します。
    6. 脳スライスをハンクス溶液+ 20%FBSで2回、次にハンクス溶液(つまり、血清なし)で3回すすぎます(すべて4°C)。溶液を吸引してすすぎ手順を終了します。
    7. 3 mLのシリンジと0.2 μmのシリンジフィルターを使用して2 mLの解離溶液(組成については表1を参照)をろ過し、脳スライスとともに濾液を直接チューブに加えます。
    8. 目に見える組織片が消えるまで、10〜20回穏やかに粉砕することにより、細胞を機械的に解離します。綿栓をしてファイヤーポリッシュ仕上げのパスツールピペットを使用し、トリチュレーション中に泡を作らないようにしてください。
    9. 小さな破片が落ち着くまで3分待ちます。
    10. 溶液の大部分(~1.5 ml、底部に溶液を残します)を、3 mlのハンクス溶液+ 20%FBS溶液(4°C)が入った15 ml遠心分離チューブに移し、綿栓をしてファイヤーポリッシュしたパスツールピペットを使用します。底に沈殿物が含まれていると、通常、培養物が劣化するため、すべての溶液を移さないでください。
    11. 4°Cで~185 g(~1,100 rpm)で13分間遠心分離します。
    12. 上清を穏やかに吸引し、あらかじめ温めためっき用培地1ml(37°C)をペレットに加え、綿栓をして火で磨いたパスツールピペットを使用して数回静かにピペッティングして再懸濁します
      注:3種類のめっき培地が異なる培養目的に使用されます:マウスグリア細胞用のプレーティング培地-1、マウスニューロン用のプレーティング培地-2、およびラットニューロンおよびグリア細胞用のプレーティング培地-3(組成については表1を参照)。
    13. 細胞懸濁液10 μlを取り出し、0.4%トリパンブルー溶液10 μlと混合し、血球計算盤または自動セルカウンターを使用して生細胞の密度を測定します。
  2. マウスグリア培養
    1. カバースリップを洗浄して、マウス細胞の健康な培養を確立します。
      1. ガラス製のカバーガラス(丸型、直径12mm)を70%の硝酸に浸します。アルミホイルで光から保護し、オービタルシェーカーO/Nの上に置きます。
      2. ガラスカバースリップをペトリ皿で少なくとも3回蒸留水ですすいでください。それらを蒸留水に浸します。皿をオービタルシェーカーO / Nに置きます。
      3. 生物学的安全キャビネット内のWhatman 150 mm濾紙でカバースリップを乾かします。
      4. カバースリップをオートクレーブします。
      5. カバースリップを24ウェル培養皿に入れます。
    2. ステップ1および2に従って新生児マウスを標識および遺伝子型決定します。
    3. ステップ3.1.
      に従って、マウスの子犬から脳細胞を取得します 注:大脳皮質の使用は、マウスグリアフィーダー層を調製するために典型的です。ただし、海馬や線条体などの他の脳領域は、さまざまな領域からの細胞の数と収量が異なるため、細胞密度を適切に調整した後に機能します。
    4. 予め温めためっき培地-1を~4 mLを最終細胞懸濁液(~1 mL)に加えます。温温前の培地の場合は、溶液を培養インキュベーター(5%CO2-95%O2、37°C)O / Nに入れて、温度とpH値を安定させます。
    5. 細胞懸濁液をコーティングされていないT25培養フラスコに移し、綿栓をしてファイヤーポリッシュ仕上げのパスツールピペットで移します。フラスコを培養インキュベーターに入れます。
    6. 1 in vitro(DIV)で、T25フラスコで培養細胞をプレーティング培地-1(4°C)で2回すすぎます。フラスコをインキュベーターに戻します。パスツールピペットでフラスコ内の培地を完全に吸引し、~5 mlの新鮮な培地を加え、フラスコを数回ゆっくりと傾けるようにしてすすぎを行います。
    7. 6-9 DIVで(すなわち、トリプシン処理とカバースリップへのめっきの1日前、ステップ3.2.8-3.2.13)、細胞外マトリックスタンパク質を含むコーティング材料100 μlを培養皿のガラスカバーガラス上に置き (コーティング材料に関するコメントについては、材料/装置の表を参照)、培養皿を培養インキュベーターに入れます。
    8. 7-10 DIV で、細胞が 20-40% コンフルエント (空間的に連続的) の場合、細胞をトリプシン化します。
      1. フラスコ内のすべての溶液を吸引し、~13 mlのハンクス溶液(4°C)を加えてフラスコを一度すすぎ、フラスコを渦巻くように数回ゆっくりと傾け、溶液を完全に吸引します。
      2. 40 μl の DNase 溶液 (最終濃度、750 units/ml) を 4 mL の Trypsin-EDTA 溶液に添加し、溶液を 0.2 μm シリンジフィルターに通し、濾液をフラスコ内の細胞に直接加えます。
      3. インキュベーター内でトリプシン化を37°Cで13分間進行させます。
      4. フラスコに2mlの100%FBS(4°C)を加えてトリプシン溶液を中和します。
      5. トリプシン処理した細胞を5〜10 mLのピペットを使用して15 mLの遠心チューブに移し、~4 mLのハンクス溶液+ 20%FBS(4°C)を加え、~185 gおよび4°Cで13分間遠心分離し、上清を吸引します。
    9. ペレットを1 mLの予熱済みめっき培地-1に再懸濁します。
    10. ステップ3.1.13に従ってセルの密度を測定します。
    11. ガラスカバースリップからコーティング材料を完全に吸引し、カバースリップに再懸濁したグリア細胞を~50μlプレートします
      注:これらの細胞はグリアフィーダー層を確立します。
    12. カバースリップ付きの培養皿をインキュベーターに入れます。
    13. 20〜60分後、予め温めたメッキ培地-1 1 mlを各ウェルに加え、ディッシュをインキュベーターに戻します。注:めっき媒体を添加している間は、別のピペットを使用してカバーガラスの周囲(めっきセルがない場合)を押し下げると、カバーガラスが媒体に浮かばないようにするのに役立ちます。
    14. グリアフィーダー層の1 DIVで(つまり、ガラスカバースリップ上)、ウェル内のすべての溶液を吸引し、新しい培地で満たすことにより、培地を1 mlの予熱済みめっき培地-1と交換します。
    15. グリアフィーダー層の2-3 DIVで、細胞が80-100%コンフルエントになったときに、有糸分裂阻害剤(5-フルオロ-2'-デオキシウリジン+ウリジンの混合物10μl、最終濃度それぞれ81.2および204.8μM)を各ウェルに添加して、DNA複製を阻害し、したがってグリア細胞の増殖を抑制します。
    16. 7-9 DIVで、細胞が90-100%コンフルエントになったとき(グリアフィーダー層にニューロンをプレーティングする1-2時間前)、培地を予め温めたプレーティング培地-2(37°C)と交換します
      注:ニューロンは、ステップ3.4を使用して、同じ日に播種されます。
  3. ラットグリアル文化
    1. T25培養フラスコに同じコーティング材料をコーティングします.
      注:これは、後でステップ3.3.5で非接着細胞を除去するために必要です。
      1. フラスコにコーティング材2.0mlを加え、培養インキュベーターにフラスコを置きます。
      2. 2〜3時間後、フラスコの床が乾くように、コーティング材料を完全に吸引します。
    2. ステップ3.1.
      に従って、ラットの子犬から細胞を取得します 注:海馬のCA3-CA1領域は、ラットグリアフィーダー層の準備に使用されます。ただし、大脳皮質や線条体などの他の脳領域は、異なる領域からの細胞の数と収量が異なることによる細胞密度の違いを調整した後に機能します。
    3. 予熱しためっき培地-3を~4 mLを最終細胞懸濁液(~1 mL)に加えます。
    4. 細胞懸濁液を、綿栓をしてファイヤーポリッシュしたパスツールピペットを使用して、コーティングしたT25培養フラスコに移します。フラスコを培養インキュベーター(5%CO2-95%O2、37°C)に入れます。
    5. 2-3 DIVで、細胞が20-40%コンフルエントになったら、蓋をしっかりと閉め、フラスコを~10回激しく振って溶液を吸引し、4-5mlのめっき培地-3(4°C)を加えて、非接着性または接着性の弱い細胞を取り除きます。この手順を一度繰り返します。フラスコフロア全体で培養した細胞を(位相差顕微鏡などを使用して)調べて、ニューロンに見えるもの(つまり、細胞体の外縁が位相的に明るく見えるもの)が完全に除去されていることを確認します。これらの細胞を必要なだけ繰り返して除去し、フラスコをインキュベーターに戻します
      注:強度と必要な「シェイク」の総数は、個々の実験者によって異なる場合があります。大事なのは、シェイクの総数を決まった回数に抑えることではなく、ニューロン様細胞が排除されることを確認することです。
    6. 6-8 DIVで、細胞が90-100%コンフルエントになったら、ステップ3.2.8のようにグリア細胞をトリプシン化してグリア細胞を継代します。
    7. 遠心分離後、ペレットを1 mlのめっき培地-3(4 °C)に再懸濁し、10 mlのめっき培地-3(4 °C)を加え、トリプシン処理した細胞をコーティングされていないT75フラスコに移し、インキュベーターで培養します< br /> 注:ラットグリア細胞は2回継代されます。対照的に、マウスグリア細胞は、複数回の継代後に不健康になるため、1回だけ継代されます。ラットグリア細胞は、コーティング材料でコーティングされていないT75フラスコで継代されます。このコーティングにより、ラットグリア細胞は急速に増殖しすぎて、多くの繊毛細胞(推定上衣細胞)が生成され、後でニューロンの培養状態が悪化します。
    8. フラスコ内のグリア培養物の17-19 DIVで(すなわち、継代後11日後、ステップ3.3.9-3.3.14によるカバースリップへのトリプシン化およびメッキの1日前)、培養皿内の未洗浄ガラスカバーガラスガラス(丸型、直径12 mm)にコーティング材料100 μlを置き、培養皿を培養インキュベーターに入れます
      注:ラットグリア培養の場合、カバースリップを洗浄したかどうかの有無にかかわらず、培養結果に違いは認められませんでした。
    9. フラスコ内のグリア培養の18〜20 DIVで(すなわち、継代後12日)、ステップ3.2.8に従って、培養細胞をトリプシンすることによりグリアフィーダー層を調製します。
    10. 遠心分離中は、ガラスカバースリップからコーティング材料を完全に吸引します。
    11. 遠心分離後、ペレットを1 mLのめっき培地-3(4°C)に再懸濁し、ステップ3.1.13に従って細胞密度を測定します。
    12. グリア密度を104 live cells/mlに調整し、コーティングされたガラスカバースリップにグリア細胞懸濁液100 μlをプレートします
      注:これらの細胞はグリアフィーダー層を確立します。
    13. カバースリップ付きの培養皿をインキュベーターに20〜60分間入れます。
    14. 各ウェルに1 mLのめっき培地-3(4 °C)を加え、ディッシュをインキュベーターに戻します。
    15. グリアフィーダー層の3-4 DIVで、カバーガラス上の細胞が40-80%コンフルエントになったら、シトシンβ-D-アラビノフラノシド(AraC、最終濃度4μM)を含む予め温めた増殖培地(組成については表1を参照)を1 mL追加して、グリア細胞の増殖を停止します。ステップ3.4を使用して、細胞が60〜80%コンフルエントな場合、グリアフィーダー層の7〜9 DIVでニューロンをプレート化します。
  4. マウス神経細胞培養
    1. ステップ1および2に従って新生児マウスを標識および遺伝子型決定します。
    2. ステップ3.1のマウスの子犬を使用します。
    3. マウスグリア細胞へのプレーティングには予熱したプレーティング培地-2を、ラットグリア細胞へのプレーティングにはプレーティング培地-3を使用して、生細胞懸濁液の密度を~2.0 x 105細胞/mLに調整します。
    4. 各ウェルの培養培地に細胞懸濁液を穏やかに加えることにより、グリアフィーダー層に細胞を播種します。注:添加する細胞懸濁液の量は、培養ウェル内の細胞の目標数によって決まります。例えば、細胞懸濁液を~60 μlにプレートすると、12,000細胞/ウェルを達成できます。
    5. ニューロンをプレーティングした後は、溶液を変更する必要がないことに注意してください。培養の過程でウェルから溶液が蒸発しないように、培養インキュベーターの内部を加湿して注意してください。

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結果

このプロトコルの適用例として、タトゥーによるマウスの標識、さまざまな実験条件下での信頼性の高いジェノタイピング、およびグリアフィーダー層での初代ニューロン培養の確立に関する代表的な結果が示されています。

タトゥー

新生児の子犬は、タトゥーシステム(図1の「新生児」)を使用して肉球にラベル付けされました。ラベルは、3週齢(「3週齢」)と32週齢(「32週齢」)ではっきりと見えました。個々のマウスは、4つの前足の入れ墨の組み合わせ(番号1〜16)と動物ケージに関する情報、またはより複雑な番号付けスキーム(図示せず)によって一意に識別できます。

ジェノタイピング

ジェノタイピングの代表的な例を1つ示します（図2〉。野生型(Tor1a+/+)、ヘテロ...

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ディスカッション

ここで提示するプロトコルには、マウスにラベルを付け/識別するための入れ墨、尾先からマウスをジェノタイピングするための手順、およびマウスの脳ニューロンを低密度で培養するための手順が含まれています。6〜8匹の子犬を使用した1ラウンドの実験では、これらの手順は通常、それぞれ~0.5時間、~4時間、~2時間、合計6〜7時間かかります。これにより、1人の実験者が、子犬の誕生から神経細胞培養のプレーティングまで必要なすべての手順を1営業日未満で完了することができます(グリアフィーダー層の事前準備を除く)。

入れ墨

動物の長期的な同定は、組織学、細胞機能、動物の行動の分析などの繁殖や科学的研究の目的で必要です。生まれたばかりの動物にタトゥーを入れることは、迅速に行うことができ、動物の生涯の大部分が続くため、有利です7,22-25。足の裏にタトゥーを入れることは、テスト可能な行動、例えばサスペンションやグリップ22,26の維持に関して、つま先のクリッピング23...

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開示事項

著者(Zhengmin Huang)は、この記事で説明した試薬を製造するEZ BioResearch LLCの社長です。

謝辞

著者は、線条体培養に関する指示と有益なコメントをいただいたアイオワ大学の研究者、ルイス・テセドール博士、イネス・マーティンス博士、ビバリー・デビッドソン博士に感謝します。また、ジェノタイピングの支援と議論について、カラ・ゴードン博士、ニコール・ボーデ博士、ペドロ・ゴンザレス・アレグレ博士に感謝します。また、タトゥーに関するご意見をいただいたEric Weyand博士(Animal Identification and Marking Systems)や、マウス培養に関するご意見をいただいた葛林秀太郎博士(福岡大学)にも感謝いたします。この研究は、米国心臓協会、国防総省(ピアレビュー医学研究プログラム賞W81XWH-14-1-0301)、ジストニア医学研究財団、エドワード・マリンクロット・ジュニア財団、国立科学財団、およびホワイトホール財団(N.C.H.)からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬 - タトゥー
マシンクレンザーAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NMCR3これは、入れ墨の後に針とホルダーを洗浄するために使用されます。
機械乾燥剤動物識別およびマーキングシステム株式会社NDAR4これは、洗浄後に針とホルダーを乾燥させるために使用されます。
新生児タトゥーブラックピグメント動物識別およびマーキングシステム株式会社NBP01
スキンプレップアプリケーターAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSPA1Qチップ。
スキンプレップソリューションAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSP01この試薬は、入れ墨の効率を高め、入れ墨の退色を防ぐオイルの薄い層を提供します(ベンダーからの情報):1)入れ墨のない皮膚が一時的に汚れるのを防ぎ、それにより、子犬が自宅のケージに戻る前に足パッドの入れ墨の品質を簡単に評価できるようにします。汚れた皮膚の表面は、入れ墨された皮膚と混同される可能性があります、2)入れ墨中の皮膚の損傷を軽減します。皮膚を柔らかくし、針を滑らかにすることで、針が皮膚に損傷を与えることなく皮膚に浸透するのを助け、3)分子状酸素が皮膚に入るのを防ぎ、それによって生成される可能性のある活性酸素種に対する炎症反応を減らします。
試薬 - ジェノタイピング
EZ Fast Tissue/Tail PCR ジェノタイピングキット (ストリップチューブフォーマット)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-1002X PCR Ready Mix溶液には、電気泳動用の赤色のローディング色素が含まれています。
組織溶解液 AEZ BioResearch LLCG2001-10020 & micro を混合して DNA 抽出液を調製します。組織溶解液Aおよび180のl&マイクロ;検体あたりの組織溶解液Bのl。
組織溶解液BEZ BioResearch LLCG2001-10020 & microを混合してDNA抽出液を調製します。組織溶解液Aおよび180のl&マイクロ;検体あたりの組織溶解液Bのl。
酢酸、氷河VWRBDH 3092
ガロース最適化グレード、分子生物学グレードrpiA20090-500 SYBR Safe DNAゲル染色剤(10,000倍希釈)または臭化エチジウム(0.5 & micro;g / mlゲル量)。
エチジウムブロマイドSigma-AldrichE7637-1G
エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩二水和物 (EDTA)FisherBP120-500
フィルター付きピペットチップ、エアロゾルフリー、0.1-10 µlドットサイエンティフィックUG104-96RS 無菌でDNA、RNase、DNaseを含まないピペットチップを使用してください。DNAが関与するすべてのステップでは、クロスコンタミネーションを避けるために、フィルター付きピペットチップを使用してください。
フィルター付きピペットチップ、プレミアムフィットフィルターチップ、0.5-20 & マイクロ;lDot Scientific IncUG2020-RS菌でDNA、RNase、DNaseを含まないピペットチップを使用してください。DNAが関与するすべてのステップでは、クロスコンタミネーションを避けるために、フィルター付きピペットチップを使用してください。
フィルター付きピペットチップ、プレミアムフィットフィルターチップ、1-200 & マイクロ;lDot Scientific IncUG2812-RS菌でDNA、RNase、DNaseを含まないピペットチップを使用してください。DNAが関与するすべてのステップでは、クロスコンタミネーションを避けるために、フィルター付きピペットチップを使用してください。
分子量マーカー、EZ DNA 偶数梯子 100 bpEZ BioResearch LLCL1001これら3つの分子量マーカーのいずれかを使用しています。
分子量マーカー、EZ DNA 偶数ラダー 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
分子量マーカー、TrackIt、100 bp DNA ラダーGIBCO-Invitrogen10488-058
PCR チューブ、8 チューブ ストリップ、個別に取り付けられたドーム トップ キャップ付き、ナチュラル、0.2 ml USA Scientific1402-2900無菌でDNA、RNase、DNaseを含まないチューブを使用してください。8チューブストリップは、個々のチューブよりも取り扱いが簡単で、試料をグループ化するのが簡単です。
PCRチューブ、ウルトラフラックスインディビジュアル rpi145660無菌でDNA、RNase、DNaseを含まないチューブを使用してください。
Seal-Rite 0.5 ml 微量遠心チューブ、天然USA Scientific1605-0000DNA、RNase、DNaseを含まない無菌のチューブを使用してください。
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinAノックインマウス5'-AGT、CTG、TGG、CTG、GCT、CTC、CC-3'(フォワード)、5'-CCT、CAG、GCT、GCT、CAC、AAC、CAC-3'(リバース)(参考文献18)。これらのプライマーは、最終濃度1.0 ng/µで使用しました。l (~0.16 µM)(参考文献2)。
野生型マウス5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3'(前方)、5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GGT GAG GTA-3'(リバース)、5'-CAC CCT ATC AGG GGA CAA CTT TCG-3'(フォワード)、5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3'(リバース)、983-BPアンプリコン用、 1990-BPアンプリコン用の5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3'(フォワード)、5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3'(リバース)。これらのプライマーは0.5μmで使用されます。
試薬 - 細胞培養
5-フルオロ-2&プライム;-デオキシウリジンSigma-AldrichF0503-100MG詳細については、ウリジンのコメントセクションを参照してください。
B-27 supplementGIBCO-Invitrogen17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treatedBD falcon353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 mlBD falcon353082
細胞培養フラスコ、T75、組織培養処理済み、カンテッドネック、ベンテートキャップ、75 cm2 Growth Area、250 mlBD falcon353136
Conical Tube、ポリプロピレン、15 mlBD falcon352095
Countess (cell number counter) chamber slidesGIBCO-InvitrogenC10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-グルコース(デキストロース)無水、SigmaUltra、99.5%(GC)Sigma-AldrichG7528-250G
皿、ペトリガラス100 x 15 mmPyrex3160-101
水GIBCO-Invitrogen15230-147
DNase Type IISigma-AldrichD4527-200KU原液は1,500ユニット/20μ;l = 蒸留水で75,000ユニット/ ml。
ダルベッコ修正イーグルミディアム(DMEM)、高グルコース、GlutaMAX、ピルビン酸GIBCO-Invitrogen10569-010、500 ml
高速PESフィルターユニット、250 ml、直径50 mmのメンブレン、0.2 & マイクロ;m 細孔サイズNalgene568-0020
Fast PES フィルターユニット、500 ml、直径 90 mm メンブレン、0.2 µm 細孔径Nalgene569-0020
ウシ胎児血清 (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
ガラスカバースリップ、12 mm 丸型、厚さ 0.09–0.12 mm、No. 0Carolina633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
Hanks' Balanced SaltsSigma-AldrichH2387-10X
HEPES、≥99.5% (滴定)Sigma-AldrichH3375-250G
塩酸、37%、A.C.S 試薬Sigma-Aldrich258148-100 ML
インスリンSigma-AldrichI5500-250 mg
硫酸マグネシウム七水和物、MgSO4•(7H2O)、BioUltra、≥99.5% (Fluka)Sigma-Aldrich63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-FreeBD Biosciences356237これは、カバースリップとフラスコのコーティング材料です。 1) それを準備するには、マトリゲル基底膜マトリックス溶液を氷上で解凍します。これには通常 ~1 日かかります。予冷したピペットを使用して、解凍した溶液を氷上の予冷したT25フラスコに分注し、フラスコを-20°Cで保存します。作動するマトリゲル溶液を調製するには、分注したマトリゲルを氷上のフラスコで解凍し、予冷したMEM溶液を加えて50倍に希釈し、希釈した溶液を4°Cに保ちます。カバーガラスのコーティング中およびコーティング後を除き、Matrigelと接触するすべての培養器および培地を予冷して、ゲルが早期に形成されるのを防ぐことが重要です。2) ガラスカバースリップまたは培養フラスコをマトリゲルでコーティングするには、マトリゲル溶液を表面に塗布します。セルをめっきする前に、表面を完全に乾かすことが重要です。この目的のためには、細胞をプレーティングする直前の細胞遠心分離中にマトリゲルを吸引し、乾燥に十分な時間を確保することが役立つ場合があります。
最小必須培地 (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 mlBD Biosciences355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plateBD falcon353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treatment 6-well plateBD falcon353046
Neurobasal-A Medium (1X), 液体GIBCO-Invitrogen10888-022
硝酸VWRbdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21 ラボ出典:参考文献69
Pasteur pipets, 5 ¾” フィッシャー13-678-6Aこの綿栓5¾を使用してください。”細胞トリチュレーション用のパスツールピペット。事前に先端をファイヤーポリッシュして切断面を滑らかにし、内径を元の50〜80%に小さくします。チップが小さすぎると細胞が破壊され、細胞生存率が低下しますが、チップが大きすぎるとトリチュレーションの効率が低下します。
パスツールピペット、9インチ フィッシャー13-678-6B
塩化カリウム(KCl)、SigmaUltra、≥99.0%Sigma-AldrichP9333-500G
セロジカルピペット、2 mlBDファルコン357507
セロロジカルピペット、5 ml BDファルコン357543
セロロジカルピペット、10 mlBDファルコン357551
セロロジカルピペット、25 mlBDファルコン357525
セロロジカルピペット、50 ml BDファルコン357550
重炭酸ナトリウム(NaHCO3、炭酸水素ナトリウム)、SigmaUltra、≥99.5%Sigma-AldrichS6297-250G
塩化ナトリウム(NaCl)、SigmaUltra、≥99.5%Sigma-AldrichS7653-250G
水酸化ナトリウム(NaOH)、ペレット、99.998% 微量金属ベースSigma-Aldrich480878-250G
リン酸ナトリウム二塩基性七水和物 (Na2HPO4•(7H<サブ>2O))、≥99.99%、アルドリッチシグマ-アルドリッチ431478-250G
ショ糖、シグマウルトラ、≥99.5% (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
シリンジフィルター、滅菌済み、0.2 µmCorning431219
Syringe, 3 mlBD falcon309585
Transferrin, Holo, ウシ血漿Calbiochem616420
Trypan Blue stain, 0.4%GIBCO-InvitrogenT10282生細胞/死細胞のカウントに使用されます。古いトリパンブルー溶液を何度も再利用する場合(例:週に数回、数週間)、沈殿物を形成し、細胞密度の誤った読み出しを引き起こすため、更新してください。
トリプシン、タイプ XISigma-AldrichT1005-5G
トリプシン-EDTA 溶液、0.25% GIBCO-Invitrogen25200-056
UridineSigma-AldrichU3003-5Gストック溶液は、25 mL DMEM (それぞれ 8.12 mM、20.48 mM) 中の 5-フルオロ-2'-デオキシウリジンと 125 mg のウリジンで調製されます。
試薬 - 免疫細胞化学
抗体, ウサギポリクローナル抗MAP2メルクミリポアAB5622
抗体, マウスモノクローナル抗GFAPカクテルメルクミリポアNE1015
機器 - タトゥー
AIMSAnimal Identification and Marking Systems, Inc.ネオ–9新生児げっ歯類の入れ墨システムは、皮膚に垂直に1点または3点の入れ墨の針を急速に移動することによって動作する電気システムです。タトゥーの針先が皮膚表面に対して垂直に保たれている間に、タトゥーマシンを約0.5秒間1回アクティブにします。入れ墨の領域を最大化するために3本針の入れ墨を好みますが、1本針の入れ墨は、つま先または細かい機械的制御が必要な場合は、数字が入れ墨されている場合たとえば。最も遅い速度で2ラウンドの入れ墨(3つのステップのうち「1」を設定)は、通常、肉球の目に見える長持ちする入れ墨を作成するのに十分です。
機器 - ジェノタイピング
電気泳動システム、横型、ワイドミニ–サブセルGTBIO–RAD170–4405典型的な電気泳動パラメータは、6 V / cmでの電界強度と10 cmゲルの25分間の持続時間です。
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal CyclerBIO-RADPTC-1148EDUΔE-torsinAノックインマウスは以下の通りである:94 °での1サイクルの変性;C を 3 分間、94 ° で 35 サイクルの変性。C を 30 秒間、58 ° でアニーリングします。C 30 秒間、72 ° で延長。Cで2分間これに続いて、72 ° で最終的な延長が行われます。C で 10 分間、4 °C で保持します。
電源、PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
機器 - 細胞培養
自動セルカウンター、CountessGIBCO-InvitrogenC10310この自動セルカウンターは、生細胞と死細胞の密度を別々に測定します(それぞれ非染色細胞とトリパンブルーで染色)。密度測定の最適な範囲を知ることは重要です:私たちが使用するカウンターは、1 x 105から4 x 106/sup/mlの範囲で最高精度を持っています。測定された細胞密度値が推奨範囲外にある場合は、再懸濁量を適切に調整してください。
生物学的安全キャビネット、クラスII、タイプA2NUAIRENU-425-400このフードは、脳の解剖を除くすべての細胞培養手順に使用されます。
CO2インキュベーター、オートフロー、湿度制御ウォータージャケットNUAIRENU-4850
横型クリーンベンチNUAIRENU-201-330脳の解剖(「脳の解剖と細胞解離」のステップ3.1.1および3.1.2)に使用されるクリーンベンチです。
Orbit LS 低速シェーカーLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus 超高速遠心分離機Fisher46910 (遠心分離機)/46922 (ローター)
ア 無 無:におけるTfap2a遺伝子増幅用プライマー 蒸留で調製 この

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