血行動態の測定、輸液の提供、採血のための血管アクセスは、小動物モデル研究にとって重要です。麻酔をかけたラットの頸動脈と総頸静脈にカテーテルを埋め込み、システムに接続してモニタリング、注入、サンプリングを行う技術を紹介します。
この記事について
サマリー
要約
重症疾患を研究するための小動物モデルの成功は、部分的には、人間の状態をシミュレートするモデルの能力に依存する。細菌の既知量の気管内接種に成功し、その後の敗血症に発展肺炎の病因を再現するために使用されている。血圧を維持するために、血行動態パラメータを監視し、抗生物質の点滴を含む標準的な臨床治療を提供し、流体および医薬品は、このモデルではルーチン支持療法をシミュレートすることが重要であるが、そうすることは、動脈と静脈の血管アクセスの両方が必要です。ビデオは、麻酔したラットでは頸動脈と共通の頚静脈カテーテルを移植するための外科的手法を詳述。 72時間の回復期間の後、動物は再び麻酔され、血行動態モニタリングシステムに注入されたカテーテルを接続するげっ歯類ハウジングに取り付けられたテザーとスイベル設定に接続されている。この設定は、の自由な移動を可能に継続的に流体および薬物（抗生物質、昇圧剤）を注入し、採血を行い、圧力を監視しながら、研究中のラット。
概要
ラットの動脈及び静脈カテーテルは、長い実験室の研究で使用されてきた。1、2カテーテルは、収縮期、拡張期および平均動脈圧（MAP）、心拍数（HR）および中心静脈圧などの血行動態パラメータを監視するために使用することができる（CVP） 3,4はまた、これらのカテーテルは、標準的治療または潜在的な治療の注入ならびに血液採取は、さらに疾病または治療の基礎となるメカニズムを分析することを可能にする。そのため、小型の動物モデルにおいて血管アクセスを持つことは、臨床パフォーマンス対策と治療効果を研究するために重要である。
重大な病気の根本的な原因を研究するためには、まず人間の条件をシミュレートするモデルを開発することが重要である。細菌の既知量の気管内接種に成功肺炎の病因は、敗血症に発展重度の肺感染症を再現するために使用されている。3、5血行動態の措置を監視し、標準的な臨床治療を提供するには、日常的支持療法をシミュレートすることが重要です。標準的な臨床治療は、基礎となる感染および流体及び昇圧剤の投与をクリアするのに役立つ抗生物質の注入を含む二つの治療は、血圧を維持するために、敗血症患者において用い5-7血管アクセスを、我々が研究したときに特に特許カテーテルの注入が特に重要である敗血症のための治験治療法。
長年にわたって、げっ歯類に、標準的な臨床治療を投与する能力は、移植可能なカテーテルおよび正確経時的に小容量を送達するための注入技術の能力を構築するために必要な特性を有する材料の入手可能性によって制限されていた。また、特定の血行動態測定値の連続モニタリングに応答して輸液を誘発する能力は、一貫して再現性のあるスタンドを可能にする同時に血行動態パラメータを監視しながら、動脈と静脈の血管アクセスの両方が利用可能でなければならないルーチンの治療法を提供するために、ARDの治療より大きなサンプルを使用すると、げっ歯類の研究の代表的なサイズモデル。8、9材料、精密ハードウェアでこれらの技術的な限界が克服されているが。
ビデオは、麻酔したラットでは頸動脈と共通の頚静脈カテーテルを移植するための外科的手法を詳述。 72時間の回復期間の後、動物は再び麻酔され、血行動態モニタリングシステムに注入されたカテーテルを接続するためのげっ歯類ハウジングに取り付けられたテザーとスイベル設定に接続されている。研究の間、システムは、流体注入を可能にする一定の注入速度で所定の容積を送達または所与の圧力範囲を維持するために、検出された平均動脈圧に応じて注入速度を提供し、自動化システムのいずれかに基づく。流体注入システムプログラム可能なシリンジは、データ取得システムのデジタル出力を持つそのインターフェイスポンプとMAPを監視するソフトウェアによって制御されている使用しています。 、圧力を監視し、流体および昇圧剤を注入し、動物を操作することなく、血液採取を行いながら、テザーとスイベルセットアップ試験中のラットの自由な移動を可能にする。 24インストルメントの動物の監視に拡張可能なハードウェアを備えた（私達の設定で）2カテーテルそれぞれに最大12個のインストルメント動物の同時モニタリングは、各実験で複数の成層のグループを研究するための大きな柔軟性を可能にします。
このカテーテル処置は、最大11日間モニタリング、サンプリング、および治療のための血管アクセスを必要とする類似のげっ歯類モデルを使用する研究施設に有益であり得る。研究施設は、この手順を考慮した場合は、げっ歯類の経験した後、これらの動物を維持するための適切なサポート構造を有しているdevelopinGこれらのスキルは、ナイーブラットは、会社の配送スケジュール対容易に入手可能である（（ナイーブラット、カテーテルの構成要素と技術的費用を含む）50ドル未満に超える180ドルからカテーテルを挿入し、ラット当たりの総コストを削減し、スケジューリングの柔軟性を高め、大幅なコスト削減を提供することができます移植されたラットの）。この手順の成功は、カテーテル法を実施する個人のスキルに依存している。この手順の習熟するために必要な訓練動物は> 90％の結果としてカテーテル開存率で20〜40匹のラットの範囲であったしている。
プロトコル
以下の手順は、国立衛生研究所の臨床センターの動物実験委員会によって承認されたプロトコルの一部として行われた。
外科1.準備
- ガスがカテーテルや楽器を殺菌。
2.カテーテルを準備
- 開通性を確保し、漏出を防ぐために、ヘパリン化グリセロール（250 IUヘパリン/ 1ミリリットルグリセロール）でカテーテルをフラッシュします。ヘパリン処理グリセロールを保持するために金属ストッパー（20 GA、15ミリメートル）でカテーテルの端を差し込みます。
3.無菌ワークステーションを準備する
- ワークステーションと楽器トレイを噴霧する70％アルコールを使用してください。手術台と楽器トレイをカバーし、トレイに楽器を配置するために、滅菌ドレープを使用してください。
4.手術のためにラットを準備
- 置きラット個別にルーサイトチャンバー内および麻酔に公開。イソフルラン（3-5％）のミックス無意識になるまで酸素とエド。チャンバーからラットを外し、首の前方および後方地域から毛皮を剃る。目に潤滑剤軟膏を適用します。
5.カテーテル注入
- 腹の位置に加熱された手術台の上に麻酔したラット（つま先のピンチによって確認）を配置。自発呼吸（; 3.5％イソフルラン）で麻酔を維持するために、ノーズコーンにその鼻を置く。穏やかに手術領域をベタジンおよび70％のアルコールの使用を交互に3回スクラブ。外科はさみを使って、肩甲骨の間に0.5cmの正中皮膚切開を行います。
- 背側の位置にラットを再配置する。穏やかにゴムバンドを使用して、テーブルの両側に足を拘束する。麻酔を維持。わずかに良い露光のために過伸展する首の下に2つのロールの無菌の4x4ガーゼを置きます。メスを用いて鎖骨のレベルで首の正中線の2センチメートル腹側頸部皮膚切開を右にしてください。
6.右頸静脈カテーテル法
- 止血剤を使用して、ぶっきらぼうに、右頸静脈を解剖視覚化し、容器の5ミリメートルのセクションを分離するために唾液やリンパ組織を分離。 4-0絹縫合糸を用いて、容器の露出を最大化するために、血管の両方の頭側と尾側端部に緩いネクタイを配置します。マイクロ外科はさみを使用すると、2合字間の血管に沿って、カテーテルを通過させ、容器の周りに頭蓋合字を結ぶのに十分な切開を大きくする。
- マイクロ解剖フックと鉗子の助けを借りて心に向かって血管内に静脈カテーテルを挿入し、PU 3Fセグメントのすべての容器になるまでカテーテルを前進させる。容器にカテーテルを固定するために頭蓋と尾側端に合字を使用してください。
7.左頸動脈カテーテル法
- 止血剤を使用して、露骨に左頸動脈を露出させるために長手方向に肩甲舌骨筋を解剖し、私容器の5ミリメートルのセクションをsolate。迷走神経（色は白）が完全に動脈から分離されていることを確認してください。神経を細断か割らないように注意してください。
- 4-0絹縫合糸を用いて、血管の頭蓋端を結ぶと切開後の血流を停止するように尾側に縫合糸の上ブルドッグクランプを配置し、容器の尾の端に緩いネクタイを配置します。 2合字間の血管に沿ったもので、マイクロ外科はさみを使用して、切開する、カテーテルを通過させるのに十分な大きさ。マイクロ解剖フックと鉗子の助けを借りて心の方に動脈カテーテルを挿入します。
- タイトなブルドッグクランプを取り外す前に、容器内のカテーテルの一部を保持するためにロックすることなく、スムーズな針ホルダを使用してください。カテーテルの全体PU 2Fセグメントが容器内になるまで、ゆっくりと針ホルダを緩めながら、ピンセットでカテーテルを進める。確保するカテーテルと血管の周りに緩い尾合字を結ぶが、そうではないのTighとしてtは、カテーテルを閉塞する。
8.バック皮下耳の後ろにと肩甲骨の間に切開を通してストレート止血剤、トンネル5cmの管を使用。チューブを介してカテーテルを体外にとチューブを外します。
9.場所で露出さカテーテルを保護するための4-0シルク縫合糸を有する3つのステンレス鋼創傷クリップで腹切開、および背側切開を閉じます。
10.術後モニターとケア
- カテーテル法の後、麻酔を終了し、セルロース寝具ケージに側臥位でラットを回復。少なくとも4時間、または一日一回、その後痛みの兆候を示さないとまで2時間間隔でラットを観察します。ラットが痛みや苦痛の徴候を示している場合は、ケトプロフェン[5 mg / kgを、皮下注射（SQ）]を与えるすぐに手続きと12時間ごとに投稿してください。我々の経験では、全くラットはイニシア以下の痛みのための追加の鎮痛を必要としていないL注入。鎮痛の追加投与のための配慮を引き出すだろうと見られ特性には、これらに限定されない。異常な姿勢。呼吸数、切開部位のunthrifty /整えられ、感染/炎症、眼脂、立毛（「スパイクhaircoat」）、可聴または触覚刺激に応答して活性の低下の増加/減少。
注：ラットは、研究に登録され、事前カテーテル法の重量から> 10グラムを得る72時間回復した。
血行動態システムへの11の接続
- 回復後、研究に健康なラット（体重増加> 10グラム）を登録する。ルーサイトチャンバー内にラットを置き、前述のように麻酔。
- 無菌の止血剤、マイクロ鉗子、添付の鈍い針を1ミリリットル注射器を備えた外科用テーブルの上に無菌ドレープを配置します。
注：止血の先端がカテーテルの損傷を回避するために、ゴムで覆われるべきである。外科的に麻酔したラットを置きます腹の位置にテーブルと自発呼吸を麻酔（3-5％）を維持するために、ノーズコーンに鼻を置きます。 - ただ金属プラグ·ピンの下にゴムキャップした止血剤のペアを使用して動脈および静脈カテーテルをクランプ。カテーテルの最後に金属ピンを取り外し、付属の鈍針でヘパリン生理食塩水で満たされた1ミリリットルの注射器を接続する一対の鉗子を使用してください。ターンでは、止血剤を除去し、カテーテルが特許であることを確認するために0.1ミリリットルを撤回。
- 、カテーテルを再クランプ針を削除し、靴箱ケージの上にスイベルとつながに接続した長いカテーテル（ヘパリン生理食塩水とのプレフラッシュ）に、この目的を取り付けます。データ収集と記録、サンプリング、または注入のためのトランスデューサにこれらのカテーテルを接続します。
注：すべてのカテーテルは、それらのケージ内の動きの動物の完全な範囲を可能にするのに十分に長いコイルばね導管で保護されています。 - カテーテル接続の後、麻酔を終了しセルロース寝具ケージで胸骨の位置で動物を回復。動脈カテーテルの開存性を維持する、手動で0.05ミリリットルのヘパリン生理食塩水（50 IU / ml）を、動物の定期的な評価と一致して24時間ごとに1時間でラインをフラッシュする。
12.採血、空気圧モニタリングおよび薬剤投与
- カテーテルを動脈および0.6ミリリットルのインラインフラッシュを撤回する接続活栓する空のシリンジを取り付けます。 、サンプル注射器を取り付けたサンプルを取り、0.7ミリリットルのヘパリン化生理食塩水洗浄に続いて0.6ミリリットルインラインフラッシュを返す。
- 使用データ収集ハードウェアおよびソフトウェアが記録MAPおよび心拍数を連続的に測定する。
- 静脈カテーテルに自動化された薬物送達システム（ADDS）を接続します。
注：ADDSは正常な生理学的範囲内に維持圧力に検出されたマップに基づいて（高、低、または0用量）昇圧剤の注入速度を調整します。
結果
血管の圧力の変化は、流体充填されたカテーテル（ 図1）を透過し、血行動態の波形（ 図2、図3）で表される電気信号に変換される。血管アクセスがなければ、これらの対策を行うことができませんでした。波形のリアルタイムストリーミングは、基礎をビートにビート上の変化（ 図2）の検出および分析が可能になります。波形の時間スケールを圧縮すると、より長い期間（数日分）を介して起こる変化昇圧剤の注入速度の変化と相関させることができる（ 図3、上位4波形）（ 図3、下位4波形）を定量化することができます。
図1.カテーテルデザイン：動脈および静脈カテーテル PU、ポリウレタンの構成要素の詳細; PE、ポリエチレン（セグメント長） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7秒以上の4典型的なげっ歯類7日後にカテーテル法の2。リアルタイムMAP波形。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
1時間かけて、図4の典型的なげっ歯類（上位4波形）の3時間圧縮MAP波形7日後にカテーテル法を。MAPが平均化されている（下位4波形）、その値がトリガするために使用される高ADDS（<90 mmHgの） 、低い（<100 mmHgの）または（停止> 110）輸液ポンプからの流れ応答。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ディスカッション
病気の臨床モデルへの治療的アプローチを調査すると、このようにして血管アクセスを必要とする正確な血行動態モニタリングを実行する能力を必要とする。敗血症の我々のモデルでは、動脈カテーテル法は、全身圧力モニタリングを提供し、静脈カテーテル法は、標準的な臨床治療の適用が可能になります。敗血症のための標準的な治療は、所望の範囲内に、動脈圧を維持するために、細菌感染および流体及び昇圧剤の注入を治療するための抗生物質の注入を含む。両方のカテーテルは、血液採取のために使用される。この設計では、実時間に基づいて、昇圧剤の注入速度を自動的にトリガプログラム可能な注入ポンプのアプリケーション動脈圧の平均は、医療スタッフが手動滴定を必要とし、前臨床設定において行う臨床状況にわたって進歩である多数の動物を研究するための可能なこの治療法の使用。
e_contentは ">いくつかの合併症を早期モデルの開発で経験した。これらは、締め付けの上から動脈と静脈カテーテルの両方の部分的な閉塞を含め、PU2とPU3コンポーネント、（1-2％）につながり;に頸静脈カテーテルの誤配置小枝、（<1％）回収した後、原因不明の突然死（無肺血栓または他の器官の損傷が明らか）、（1-2％）は、2 L / minのO 2流量でイソフルラン濃度を2から3.5パーセントを保持することによって解決さ。出血、局所感染や自傷行為の損傷の他の一般的な外科的な合併症は認められなかった。外科的な習熟度が達成されると、それぞれの手順ではこれ以上15分未満で完了することができるはずです。健康回復として測定成功率と特許カテーテルは、一度完全に訓練された90％を超えることが予想される。追加の動物に」であってもよい失敗カテーテルのためのデータの損失および必要な動物の総数とアカウントを最小限に抑えるために、各試験に含まれる唯一の融合」や合併症による死亡率。この手順の中で最も重要なステップは、カテーテルの設計と配置です。材料があまりにも簡単に圧着することなく、血管壁を貫通しないように、先端に軟質である必要がある。カテーテルの本体は、十分に血管内に進めることができるように、所定の位置に固定する（先端より）堅くなければならない。 図1は、動脈カテーテルと接続され、2つの異なる直径の管のために接続されたチューブの3直径を示している静脈カテーテルのために。これらのコンポーネントは、先端に、カテーテルの直径を減少させるために互いに内部にスライドされ、維持される血管又は心臓内のカテーテルの配置を確実にするために追加されたアンカーと一緒に接着される。
いったん回復し、スイベルとテザーに接続、マップやCVP波形を図2に示されているデータのようになります。動脈カテーテルpatencを維持するにはモニタリング中、yは、時間ごとのヘパリン生理食塩水洗浄（0.05 ml）を実行する必要があります。連続注入は、静脈カテーテルの開存性を維持します。回線接続とフラッシュの間に、細心の注意は、ライン内に気泡が存在しない保証するために支払わなければならない。 ≥0.1mlの気泡は、肺、脳または他の器官における塞栓症をもたらすことができる。血行動態波形は研究の過程にわたって記録され、分析される。 x軸に時間を圧縮すると、 図3は、1時間かけてMAPおよびCVPの変化だけでなく、速度及び昇圧剤注入の効果の変化を示す。
手順は、いくつかの潜在的な制限を有する。我々の研究では、カテーテルは、最大11日間の特許残る。これは、カテーテルは、この期間を超えて特許のままでどのくらい不明である。説明したように、カテーテルに適合するように、ほぼげっ歯類重量と相関する最小の血管の大きさが、より大きいことが、この研究に登録した動物を必要がある200グラム。より小さいカテーテルの直径の使用が開存性を減少させる流入する抵抗の増加をもたらすであろう。中心静脈圧対策を達成する試験期間中のサイズおよび成長を考慮するのに十分な心房に正確なカテーテル留置を必要とする課題であることができる。
一度習得し、動脈および血管カテーテルは、計測中に痛みや苦痛を最小限にするか、一度回収処理中に流体又は治療の血行動態モニタリング、血液採取、および注入を必要とするげっ歯類モデルの多種多様のための基礎を提供することができる。実際には、大腿静脈のカテーテル法を記述した前のJOVE出版10と連動して、我々が正常にこのモデルが3に移植カテーテルを用いて行っている。
開示事項
著者には潜在的な利益相反はありません。
謝辞
このモデルの開発を支援したのは、学内NIHプログラムです。出版支援は、Harvard Apparatus Inc.とADInstruments Inc.によって提供されました。著者らの研究は、米国政府が資金提供する研究の一部として行われました。ただし、表明された意見は必ずしも国立衛生研究所の意見ではありません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ストレートマイクロ解剖鉗子 | Roboz | RS-8102 | 手術器具 |
| デリケートストレート止血鉗子 | Roboz | RS-7114 | 手術器具 |
| デリケートカーブ止血鉗子 | ミルテック | ス 7-4 | 手術器具 |
| Serrefine 湾曲した非常に繊細なマイクロクランプ | Roboz | RS-5471 | 手術器具 |
| マイクロ解剖フック | Miltex | 19-220 | 手術器具 |
| エッジに角度をつけたマイクロ解剖スプリングハサミ | Roboz | RS-5618 | 手術器具 |
| 軽量手術ハサミ | Roboz | RS-6750 | 手術器具 |
| メスのハンドルと刃(#10) | シンシナティ外科 | RS-9843 | 手術器具 |
| 曲針付き4-0シルク縫合糸のパック | エチコン | FS-2 | 手術器具 |
| ストレートマイクロ縫合針ホルダー | ロボズ | RS-6410 | 器具 |
| 創傷クリップ | ストールティング | 59027 | 手術器具 |
| 滅菌ガーゼ2"x2" | ダイナレックス | 3362 | 消耗品 |
| ガーゼ4 "x4" | Covidien | 2556 | 消耗品 |
| 麻酔気化器 | サージベット | V703001 | 機器 |
| ルーサイトボックス | カスタム | 機器 | |
| イソフルラン | バクスター | 機器 | |
| ダウンドラフトテーブル | エアサイエンス | 機器 | |
| テーブルトップ 手術プラットフォーム | カスタム | 機器 | |
| 動脈カテーテル | カスタム - Scientific Commodities Inc. | 消耗品 | |
| 静脈カテーテル | カスタム - Scientific Commodities Inc. | 消耗品 | |
| データ収集システム | ADInstruments | Powerlab 16/30 | 機器 |
| データ解析ソフトウェア | ADInstruments | LabChart v7.3 | 機器 |
| プログラム可能な輸液ポンプ | ハーバード・イスラーム | PHD ウルトラ | 機器 |
参考文献
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