Method Article

タンパク質分析のための継続的な認識パターンを生成する電子舌

DOI:

10.3791/51901

⸱

September 16th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Structure et Propriétés d'Architectures Moléculaires, Institut Nanosciences et Cryogénie, CEA-Grenoble, 2Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d'Orsay, Université Paris-Sud, 3Institut de Biologie Structurale

In This Article

Summary

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電子舌(eT)の構築に関する新しいアプローチが説明されており、これによりセンシング材料の設計と製造が大幅に簡素化され、eTが液体中のサンプルの連続的な進化プロファイルとランドスケープを生成することができます。得られたeTは、識別などの一般的なタンパク質分析に効率的です。

Abstract

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現在のプロトコルでは、タンパク質分析のための電子舌(eT)の構築のためのセンシング材料の設計と製造を簡素化するために、組み合わせアプローチが開発されました。ビルディングブロック(BB)として使用される、物理化学的特性の異なる、単純で容易に入手できる少数の分子を、さまざまな制御された比率で混合し、プリズムの金表面上で混合物が自己組織化できるようにすることで、タンパク質センシングに適した特性を特徴とする組み合わせ表面の配列が作成されました。このようにして、多数の交差反応性受容体を迅速かつ効率的に取得することができます。このような組み合わせ交差反応性受容体(CoCRR)のアレイと、表面プラズモン共鳴イメージング(SPRi)などの光学検出システムを組み合わせることで、得られたeTは、結合イベントをリアルタイムで監視し、液体中のサンプルの2D連続進化プロファイル(CEP)や3次元連続進化ランドスケープ(CEL)などの連続認識パターンを生成できます。このようなeTシステムは、一般的な精製タンパク質の識別に効率的です。

Introduction

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正確かつ迅速なタンパク質検出法は、医療診断およびプロテオミクスにおいて非常に重要である。そのようなバイオチップのような古典的なタンパク質検出アレイは、「ロックアンドキー」の認識の原理に基づいており、そのようなアプタマー、抗体、または模倣体などの特定の受容体を必要とする。

近年、人間の嗅覚と味覚に触発差動検出は、代替1として浮上している。この電子鼻/舌（EN / ET）のアプローチは、標的分子に対する高度に特異的または選択的である必要はありません交差反応性受容体（CRRs）の配列に分析物の結合差に基づいているので、面倒を克服することができます高度に選択的な受容体を開発するプロセス。これは、その同定を可能にする、指紋のように、各サンプルの異なるパターンを作成し、すべての受容体の結合応答である。

エレックの開発のための2つの主要な課題効果的なタンパク質検出のためのTRONIC鼻/舌は構造的に類似の検体と結合事象のための適切な伝達系を区別する能力を持っているセンシング素子の製造である。これまでの研究では、アレイの開発2にさまざまなアプローチを報告している。例えば、ある研究では、タンパク質のアレイベースの識別は、タンパク質とのための明確な荷電周囲との親和性のための疎水性コアを有する差動受容体を提供するために、各種アミノ酸やジペプチドにカルボキシル基を結合させることにより、テトラcarbo....

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Protocol

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さまざまなソリューションおよびタンパク質サンプルの調製

  1. の50mMのNaH 2 PO 4、50mMのNaCl、およびpH6.8で10％グリセロールを含むリン酸緩衝溶液（PBS-G）を100mlを調製する。
  2. pH7.4の10mMのHEPES、150mMのNaCl、0.005％Tween20を含むHEPES緩衝溶液250mlを調製する。
  3. PBS-G中の0.2mmにラクトース（ 図1）硫酸化ビルディングブロック1（BB1）乳糖およびビルディングブロック2（BB2）のストック溶液を調製します。
  4. 500 nMの、1μMでミオグロビン、および500nmでのリゾチームで梗のhypogaeaレクチン （AHL）：HEPES中タンパク質溶液の1ミリリットルを準備します。
  5. 超純水に1％SDSの20ミリリットルを用意してください。

CoCRRアレイの作製

  1. これらの条件下で3分間プラズマクリーナーを使用する前に、プリズム48時間の金表面を清掃してください：75％酸素、25％アルゴン、0.6ミリバール、電力40 W。
  2. 11純粋および混合solutioを準備PBS-G 0.1mmの総BB濃度で10％刻みを0〜100％の間[BB1] /（[BB1] + [BB2]）....

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Results

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一般的なタンパク質分析のための電子舌の能力を調べるために、3つのタンパク質を用いた：AHL、ミオグロビンおよびリゾチーム。 図6に示すように、各タンパク質について、異なる2D連続進化プロファイル、CEPは、他で生成された。

また、リアルタイムの吸着と脱着速度を監視することができるのSPRi、おかげで、各タンパク質についての3D連続進化ランドスケープ（CEL）と呼ばれる時間依存の連続的な認識パターンは、生成された。 図7に、これらの三つのタンパク質の特性資料集が示されている。

figure-results-1
CoCRRアレイを調製するために、このプロトコルで使用される2つのビルディングブロックの1.......

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Discussion

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このeTとの建設のための最も重要なステップは、システムの良好な再現性を確保するために専念しています。例えば、BB1およびBB2の11の純粋および混合溶液中に10％グリセロールを添加すること、使用前に標準化された手順により、プリズムの金表面を洗浄するのBBは、プリズムの金表面上の自己組織化の際に溶媒の蒸発を排除するために、それぞれについて、複数の反復[BB1] /（[BB1] + [BB2]）比などを堆積させる。のSPRiによるタンパク質の検知については、作動角の選択が非常に重要です。通常、それは、反射率曲線の最も高い勾配に固定されている。また、このようなどの作業温度、流量などの各タンパク質の検出のための標準化された実験条件を使用することは非常に重要である。各タンパク質注入後、CoCRRアレイは、受容体へのダメージを与えることなく、システムの完全な再生を可能にする適切な溶液を用いて再利用のために再生成する必要があります。

開発されたETはだけでなく、以前に9に報告するだけでなく、一般的なタンパク質について、2つの非糖結合タンパク質ミオグロビンとリゾチームと1レク.......

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Disclosures

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著者には宣言すべき利益相反はありません。

Acknowledgements

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著者は、Laurie-Amandine Garçonの支援に対するグルノーブルのLANEFの博士号取得に感謝したいと思います。この研究は、フランス国立研究機関(ANR-grant 06-NANO-045)によって財政的に支援されました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
SPRi装置 堀場製作所のScientific-GenOpticsSPRi装置は、25°Cの温度調節されたインキュベーターに入れられます。
インキュベーターメモリ
シリンジポンプ Cavro 科学機器Cavro XLP 6000
Micro Elite Degasser AlltechAT590507
6ポート中圧注入バルブアップチャーチサイエンティフィック使用される注入ループの容量は500μlです。
フェムトプラズマクリーナー(バージョン7)Diener 2チャンネルの電子オンライン脱気システム。
スポッターSiliflow非接触圧電スポッターです。
SPRi-BiochipHoriba Scientific-GenOptics36000067プリズムは、薄い金膜(45nm)でコーティングされた高屈折率ガラスプリズムでできており、イメージング用に特別に開発されました。
エリスリーナ・クリスタガリ・レクチン Sigma-AldrichL5390
Arachis hypogaea レクチン シグマ・アルドリッチL0881
ミオグロビンシグマ・アルドリッチM1882
リゾチームシグマ・アルドリッチL6876
CXCL12αDr. Hugues Lortat-Jacob 提供; 調製の詳細については、参考文献 9
CXCL12&gamma の補足情報を参照してください。 Dr. Hugues Lortat-Jacob 提供、調製の詳細については、参考文献 9
LactoseProvided by Prof. David Bonnaffé 調製の詳細については、参考文献 9
Sulfated lactoseProvided by Prof. David Bonnaffé 調製の詳細については、参考文献 9
Glycerol の補足情報を参照。Sigma-AldrichG5150
SDSSigma-AldrichL4509
Tween 20Sigma-Aldrich274348
HEPESSigma-AldrichH3375
リン酸ナトリウム 一塩基性Sigma-AldrichS0751
塩化ナトリウムSigma-AldrichS3014

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
  2. Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general app....

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