このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

タンパク質分析のための継続的な認識パターンを生成する電子舌

7.5K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/51901

⸱

2014年9月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Structure et Propriétés d'Architectures Moléculaires, Institut Nanosciences et Cryogénie, CEA-Grenoble, 2Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d'Orsay, Université Paris-Sud, 3Institut de Biologie Structurale

この記事について

サマリー

電子舌(eT)の構築に関する新しいアプローチが説明されており、これによりセンシング材料の設計と製造が大幅に簡素化され、eTが液体中のサンプルの連続的な進化プロファイルとランドスケープを生成することができます。得られたeTは、識別などの一般的なタンパク質分析に効率的です。

要約

現在のプロトコルでは、タンパク質分析のための電子舌(eT)の構築のためのセンシング材料の設計と製造を簡素化するために、組み合わせアプローチが開発されました。ビルディングブロック(BB)として使用される、物理化学的特性の異なる、単純で容易に入手できる少数の分子を、さまざまな制御された比率で混合し、プリズムの金表面上で混合物が自己組織化できるようにすることで、タンパク質センシングに適した特性を特徴とする組み合わせ表面の配列が作成されました。このようにして、多数の交差反応性受容体を迅速かつ効率的に取得することができます。このような組み合わせ交差反応性受容体(CoCRR)のアレイと、表面プラズモン共鳴イメージング(SPRi)などの光学検出システムを組み合わせることで、得られたeTは、結合イベントをリアルタイムで監視し、液体中のサンプルの2D連続進化プロファイル(CEP)や3次元連続進化ランドスケープ(CEL)などの連続認識パターンを生成できます。このようなeTシステムは、一般的な精製タンパク質の識別に効率的です。

概要

正確かつ迅速なタンパク質検出法は、医療診断およびプロテオミクスにおいて非常に重要である。そのようなバイオチップのような古典的なタンパク質検出アレイは、「ロックアンドキー」の認識の原理に基づいており、そのようなアプタマー、抗体、または模倣体などの特定の受容体を必要とする。

近年、人間の嗅覚と味覚に触発差動検出は、代替1として浮上している。この電子鼻/舌（EN / ET）のアプローチは、標的分子に対する高度に特異的または選択的である必要はありません交差反応性受容体（CRRs）の配列に分析物の結合差に基づいているので、面倒を克服することができます高度に選択的な受容体を開発するプロセス。これは、その同定を可能にする、指紋のように、各サンプルの異なるパターンを作成し、すべての受容体の結合応答である。

エレックの開発のための2つの主要な課題効果的なタンパク質検出のためのTRONIC鼻/舌は構造的に類似の検体と結合事象のための適切な伝達系を区別する能力を持っているセンシング素子の製造である。これまでの研究では、アレイの開発2にさまざまなアプローチを報告している。例えば、ある研究では、タンパク質のアレイベースの識別は、タンパク質とのための明確な荷電周囲との親和性のための疎水性コアを有する差動受容体を提供するために、各種アミノ酸やジペプチドにカルボキシル基を結合させることにより、テトラcarboxyphenylporphyrin誘導体から準備CRRsを使用して開発された異なる結合を付与する。このシステムを使用して、異なるタンパク質及びタンパク質混合物の分析物3,4との相互作用の際に受容体の蛍光消光を測定することによって同定した。別の研究では、hexasubstiにコンビナトリアルな方法で合成されたペプチドボロン酸部分を含有する29 CRRsのライブラリーtutedベンゼン骨格は、インジケータ取り込み比色検出5,6を有するタンパク質を検出するために開発された。そのような設計では、各受容体は、糖タンパク質からのタンパク質の分化に補助ペプチドの腕の中で分散に基づいて、タンパク質、およびボロン酸との差動結合能を示した。より最近では、アニオン性蛍光ポリマーであるポリ（p-フェニレンエチニレン）（PPE）とコンジュゲートし、異なるカチオン性官能化された金ナノ粒子で構成された配列は、タンパク質7を検出し、識別するために作成されている。競争力のあるタンパク質のための別個の認識パターンを生成する、タンパク質分析物との結合を、蛍光を再生しPPE /金ナノ粒子複合体をクエンチした。本研究では、官能化ナノ粒子 - タンパク質相互作用は、ナノ粒子の末端基の物理化学的性質を変えることによって調整した。更に、このアプローチは、複雑で、タンパク質に富む培地中でタンパク質分析のために有効であることが示された生理学的に関連の濃度でヒト血清として、このように疾患状態8を診断するための実際のサンプルをプロファイリングにおけるETの可能性を示した。

非常に有望なものの、これらのシステムは、いくつかの固有の限界を有する。彼らは設計と非常に複雑な構造を有する5〜29 CRRsから合成することを必要とする。また、各測定以下リセットされる嗅覚系とは異なり、タンパク質の検出は、サンプルあたりのアレイを準備する必要である。最後に、リアルタイムの結合事象を監視することは極めて困難である。

この文脈において、コンビナトリアルアプローチは、異なる物理化学的特性を持つ単純かつ容易にアクセス可能な少数の分子用いて、提案された（中性、負に帯電した、正に荷電、親水性、疎水性、 等 。）ビルディングブロック（BBS）9として。変化させ、制御された割合でのBBを混合し、混合物はオングストロームの金表面上に自己集合させることによりプリズムは、タンパク質を結合するための適切なプロパティをフィーチャーしたコンビナトリアル表面の配列が作成されました。注目すべきことに、このシステムの自己組織化単分子膜を迅速かつ効率的に製造することが、多様な組み合わせの交差反応性受容体（CoCRRs）を有効に、高度に分岐した方法で表面特性の範囲を簡単にチューニングを可能にする。タンパク質検出は、光学検出システムは、表面プラズモン共鳴画像（のSPRi）を用いて行った。簡単に説明すると、LEDからのブロードビーム単色偏光がプリズムの表面の全体CoCRRアレイ領域を照明する。高解像度のCCDビデオカメラがCoCRRアレイの全てのスポットにわたってリアルタイムの差分画像を提供する。それは、結合事象と運動過程10に関する詳細な情報を提供するCoCRR·アレイの表面に局所的な変化のすべてをキャプチャします。一方、イメージングソフトウェアの助けを借りて、スポットに対応するSPR画像は、自動的に反射率versuの変化に変換されますセンサーグラムと呼ばれる運動結合曲線のシリーズを生成し、時間だ。したがって、のSPRiはラベルフリー、同期、並列を可能にし、結合事象のリアルタイム観察。さらに、得られたCoCRRアレイは、タンパク質分析のための再生可能及び再利用可能である。

このプロトコルは、ビルディングブロックとしてつだけ小分子を用いて電子舌の構築を記載しのSPRiで得られた連続的な認識パターンに基づいて、一般的なタンパク質の分析への応用を示している。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

さまざまなソリューションおよびタンパク質サンプルの調製

  1. の50mMのNaH 2 PO 4、50mMのNaCl、およびpH6.8で10％グリセロールを含むリン酸緩衝溶液（PBS-G）を100mlを調製する。
  2. pH7.4の10mMのHEPES、150mMのNaCl、0.005％Tween20を含むHEPES緩衝溶液250mlを調製する。
  3. PBS-G中の0.2mmにラクトース（ 図1）硫酸化ビルディングブロック1（BB1）乳糖およびビルディングブロック2（BB2）のストック溶液を調製します。
  4. 500 nMの、1μMでミオグロビン、および500nmでのリゾチームで梗のhypogaeaレクチン （AHL）：HEPES中タンパク質溶液の1ミリリットルを準備します。
  5. 超純水に1％SDSの20ミリリットルを用意してください。

CoCRRアレイの作製

  1. これらの条件下で3分間プラズマクリーナーを使用する前に、プリズム48時間の金表面を清掃してください：75％酸素、25％アルゴン、0.6ミリバール、電力40 W。
  2. 11純粋および混合solutioを準備PBS-G 0.1mmの総BB濃度で10％刻みを0〜100％の間[BB1] /（[BB1] + [BB2]）比でBB1とBB2のナノ秒。
  3. 預金合計で44のスポット（ 図2）を用いて、各比率のために四連での非接触スポッターを用いて、プリズム面上でこれらの純粋および混合液の8 nlの液滴。
    NOTE：PBS-Gで追加の10％グリセロールを溶媒蒸発と堆積後BB濃度の変化を低減するために非常に重要である。
  4. 超純水1mlを含むペトリ皿の内側にプリズムを配置し、金表面上のBB1とBB2の自己集合を室温でO / Nのままにします。ここでは、混合SAMの平均表面組成は、堆積混合溶液（ 図3）11の組成を反映しているものとする。
  5. 超純水で十分にプリズムを洗浄した後、アルゴン流の下でそれを乾燥させてください。

3タンパク質センシングのSPRiによる

  1. incubatoを設定rは、その中のSPRi装置は、タンパク質検出時の温度変化により誘導される屈折率の変化を避けるために25°Cに配置されている。
  2. 10μlのポリエーテルエーテルケトン（PEEK）における非官能すすぎプリズムは、コンピュータ制御されたシリンジポンプ、脱気装置及び6ポート中圧噴射弁（ 図4）に接続されたセルを流れる挿入する。たて濾過し、バッファー、HEPESを実行して脱気をフローシステムに入力します。
  3. すすぎプリズムを外し、フローセル中CoCRR配列を含むプリズムを挿入します。 100μL/分の流量で運転HEPES。 CCDカメラの助けを借りてすぐにランニングバッファーを通過させることによって、プリズム表面上に存在する任意の気泡を除去。
  4. 配列のよく対比画像上とのSPRiシステム内の統合されたソフトウェアの助けを借りて、ベースの関心領域に対して同じ径の円を描くことによって各スポットについての研究領域を定義します。
  5. 反映表すプラズモン曲線をトレース全てのスポットのための入射角の関数でivity曲線。
  6. 反射率曲線の最も高い傾斜で作動角（運動曲線が記録される位置）を選択します。反応速度測定のために選択された作業角度を固定するために走査ミラーを回転させます。
  7. 全てのスポットのための反射率信号が安定して一定になるまでフローシステムを通してHEPESを実行し続けます。
  8. 位置「負荷」での噴射弁とサンプルループ（500μl）の中に注射器で1ミリリットルAHL液を注入。次に、 "注射"を配置するために注入バルブを置く。全てのタンパク質の注射のために使用流量を100μl/分であった。
  9. 全てのスポットで同時に時間に対して反射率の変化を監視することにより、反応速度測定を開始します。
  10. タンパク質注射の終了時に、8分間のランニング緩衝液でアレイをすすぐ。最後に、それを再生するために1ミリリットル1％SDSを注入。
  11. 他のpに対して同じ手順を繰り返しますroteins。

4。データ処理と解析

  1. フローセルへの蛋白質溶液のエントリに続いて、分子結合が発生し、プラズモン曲線のシフト及び反射率の変化を誘導する。画像取得ソフトウェアは、センサーグラム（ 図5B）を得、SPR画像は、 図5Aを与え、スケールレベルを灰色に測定された光強度値を変換して、時間に対する反射率の変化を生成する。
  2. 各サンプルについて2D連続進化プロファイル（CEP）を生成する[BB1] /（[BB1] + [BB2]）比に対する各タンパク質の注入の終了時に反射率（R％）をプロットする数学計算ソフトウェアを使用した（ 図5C）。
  3. [BB1] /（[BB1] + [BB2]）センサーグラムにおける比率を追加します（ 図5B）は、各タンパク質（ 図5D）のための3D連続進化ランドスケープ（CEL）を生成する。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

一般的なタンパク質分析のための電子舌の能力を調べるために、3つのタンパク質を用いた：AHL、ミオグロビンおよびリゾチーム。 図6に示すように、各タンパク質について、異なる2D連続進化プロファイル、CEPは、他で生成された。

また、リアルタイムの吸着と脱着速度を監視することができるのSPRi、おかげで、各タンパク質についての3D連続進化ランドスケープ（CEL）と呼ばれる時間依存の連続的な認識パターンは、生成された。 図7に、これらの三つのタンパク質の特性資料集が示されている。

figure-results-1
CoCRRアレイを調製するために、このプロトコルで使用される2つのビルディングブロックの1...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

このeTとの建設のための最も重要なステップは、システムの良好な再現性を確保するために専念しています。例えば、BB1およびBB2の11の純粋および混合溶液中に10％グリセロールを添加すること、使用前に標準化された手順により、プリズムの金表面を洗浄するのBBは、プリズムの金表面上の自己組織化の際に溶媒の蒸発を排除するために、それぞれについて、複数の反復[BB1] /（[BB1] + [BB2]）比などを堆積させる。のSPRiによるタンパク質の検知については、作動角の選択が非常に重要です。通常、それは、反射率曲線の最も高い勾配に固定されている。また、このようなどの作業温度、流量などの各タンパク質の検出のための標準化された実験条件を使用することは非常に重要である。各タンパク質注入後、CoCRRアレイは、受容体へのダメージを与えることなく、システムの完全な再生を可能にする適切な溶液を用いて再利用のために再生成する必要があります。

開発されたETはだけでなく、以前に9に報告するだけでなく、一般的なタンパク質について、2つの非糖結合タンパク質ミオグロビンとリゾチームと1レク...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

著者は、Laurie-Amandine Garçonの支援に対するグルノーブルのLANEFの博士号取得に感謝したいと思います。この研究は、フランス国立研究機関(ANR-grant 06-NANO-045)によって財政的に支援されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
SPRi装置 堀場製作所のScientific-GenOpticsSPRi装置は、25°Cの温度調節されたインキュベーターに入れられます。
インキュベーターメモリ
シリンジポンプ Cavro 科学機器Cavro XLP 6000
Micro Elite Degasser AlltechAT590507
6ポート中圧注入バルブアップチャーチサイエンティフィック使用される注入ループの容量は500μlです。
フェムトプラズマクリーナー(バージョン7)Diener 2チャンネルの電子オンライン脱気システム。
スポッターSiliflow非接触圧電スポッターです。
SPRi-BiochipHoriba Scientific-GenOptics36000067プリズムは、薄い金膜(45nm)でコーティングされた高屈折率ガラスプリズムでできており、イメージング用に特別に開発されました。
エリスリーナ・クリスタガリ・レクチン Sigma-AldrichL5390
Arachis hypogaea レクチン シグマ・アルドリッチL0881
ミオグロビンシグマ・アルドリッチM1882
リゾチームシグマ・アルドリッチL6876
CXCL12αDr. Hugues Lortat-Jacob 提供; 調製の詳細については、参考文献 9
CXCL12&gamma の補足情報を参照してください。 Dr. Hugues Lortat-Jacob 提供、調製の詳細については、参考文献 9
LactoseProvided by Prof. David Bonnaffé 調製の詳細については、参考文献 9
Sulfated lactoseProvided by Prof. David Bonnaffé 調製の詳細については、参考文献 9
Glycerol の補足情報を参照。Sigma-AldrichG5150
SDSSigma-AldrichL4509
Tween 20Sigma-Aldrich274348
HEPESSigma-AldrichH3375
リン酸ナトリウム 一塩基性Sigma-AldrichS0751
塩化ナトリウムSigma-AldrichS3014

参考文献

  1. Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
  2. Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general approach to differential sensing using synthetic molecular receptors. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 685-692 (2010).
  3. Baldini, L., Wilson, A. J., Hong, J., Hamilton, A. D. Pattern-based detection of different proteins using an array of fluorescent protein surface receptors. J. Am. Chem. Soc. 126, 5656-5657 (2004).
  4. Zhou, H. C., Baldini, L., Hong, J., Wilson, A. J., Hamilton, A. D. Pattern recognition of proteins based on an array of functionalized porphyrins. J. Am. Chem. Soc. 128, 2421-2425 (2006).
  5. Wright, A. T., Griffin, M. J., Zhong, Z., McCleskey, S. C., Anslyn, E. V., McDevitt, J. T. Differential receptors create patterns that distinguish various proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 44, 6375-6378 (2005).
  6. Wright, A. T., Anslyn, E. V. Differential receptor arrays and assays for solution-based molecular recognition. Chem. Soc. Rev. 35, 14-28 (2006).
  7. You, C. C., et al. Detection and identification of proteins using nanoparticle–fluorescent polymer ‘chemical nose’ sensors. Nature Nanotechnology. 2, 318-323 (2007).
  8. De, M., et al. Sensing of proteins in human serum using conjugates of nanoparticles and green fluorescent protein. Nature Chemistry. 1, 461-465 (2009).
  9. Hou, Y., et al. Continuous evolution profiles for electronic-tongue-based analysis. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 10394-10398 (2012).
  10. Campbell, C. T., Kim, G. SPR microscopy and its applications to high-throughput analyses of biomolecular binding events and their kinetics. Biomaterials. 28, 2380-2392 (2007).
  11. Stranick, S. J., et al. Nanometer-scale phase separation in mixed composition self-assembled monolayers. Nanotechnology. 7, 438-442 (1996).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

コンビナトリアルアプローチ表面プラズモン共鳴イメージング連続進化プロファイル連続進化ランドスケープ交差反応性受容体自己組織化単分子層ビルディングブロック混合物速度論的結合曲線
タンパク質分析のための継続的な認識パターンを生成する電子舌
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。