gDNA濃縮は、体質的突然変異の研究のための簡単で強力なツールです。この記事では、DNA損傷修復に関与する11個の遺伝子の完全な配列を簡単に解析する手順を紹介します。
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方法論記事
の全配列のNGS解析のためのトランスポゼースベースの技術によるgDNAのエンリッチメント BRCA1 BRCA2、およびDNA損傷修復に関与する遺伝子9
この記事について
サマリー
NGSシーケンシングのための
要約
次世代シーケンシングの普及は、癌研究および診断のための新たな道を切り拓いてきた。 NGSは巨大な癌に対する新たなデータの量、特にがんの遺伝学をもたらすでしょう。現在の知識と未来の発見は、それが必要な癌の遺伝的素因に関与することができる遺伝子の膨大な数を研究するようになります。この点では、DNA損傷の修復に関与する11の完全な遺伝子を研究するためにエラ·デザインを開発した。このプロトコルは、安全に、同時に24人の患者に11個の遺伝子（ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、PALB2、RAD50、RAD51C、RAD80、およびTP53）プロモーターからの3'-UTRに研究するために開発されました。トランスポザーゼ技術とgDNAの濃縮に基づくこのプロトコルは、多重化をサンプリングする遺伝子診断のおかげで時間の面で大きな利点を提供します。このプロトコルは、安全に、血液のgDNAと共に使用することができる。
概要
2010年にはほぼ150万人（基本的に女性は）世界的に乳癌を開発しました。なお、これらの症例の5〜10％が遺伝性であったと推定される。ほぼ20年前、BRCA1およびBRCA2は 、遺伝性乳癌および卵巣癌1に関わると同定された。約15年前から、BRCA1およびBRCA2コード領域は、乳癌および卵巣癌の遺伝的素因を決定するために配列決定されている。 BRCA1およびBRCA2の変化は、これらの領域の分析は、効果的なスクリーニングのために十分ではないことを示唆して選択された家族2 10〜20％で検出される。最近では、BRCA1およびBRCA2の非コード配列（プロモーター、イントロン、3 - 'UTR）の分析は、新たな変異/バリエーションが乳癌3-6のリスクが高いにリンクすることができることを強調した。
BRCA1およびBRCA2タンパク質は、相同組換え修復に関与している（多数のパートナー企業7によって完成さHHR）。 BRCA1またはBRCA2の変化は、DNA修復における欠陥を誘発するが、他のパートナーはまた、乳癌のリスクに影響を及ぼし得る。この仮説はBRIP1 8以来確認されているように見えると
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プロトコル
1 gDNAの評価（ゲノムDNA）収率
- ライブラリー作製の前に新鮮に抽出されたgDNAを定量化する。 （gDNAの収率を評価するための分光光度計を使用しないでください）は、無傷のgDNAを定量化するために、蛍光歩留まり評価方法を使用します。 （260/280 nm）の比を測定し、それが1.8の間と2注であることを確認：gDNAの50 ngの実験のために必要とされる。
2 gDNAのエンリッチメント：1日目、朝
- 始める前に
- DNA濃縮キット（材料/機器の表を参照）を、解凍のDNAバッファ（TD）と氷上でのDNA酵素（TDE1）ソリューションから。少なくとも30分間、使用前に精製磁気ビーズをもたらし、標的（ST）を停止し、室温（RT）にバッファリングする。よくサンプルあたり1、2〜2.5 ngの直接96ウェルプレートに/ウェルでのgDNAサンプルの20μl添加する。重要：プロトコル（既知の配列変異を有するサンプル）を検証するためにポジティブコントロールを使用します。
- Tagmentation
- MIX徹底的にすべての試薬5回反転させて、簡単にスピンダウン。 RTで、TDE1バッファの各ウェルのgDNA 50ngの（20μl）を含む、その後、5μlにTDバッファー25μlを加える。優しく上下に10倍のボリューム全体をピペットで、50μlにピペットを設定しま....
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結果
サンプルQC結果
標的遺伝子の配列を決定するためのこの方法の能力は、gDNAの品質（ 図2A）とtagmentation工程の品質に基づいている。 tagmentationが（ 図2B、上部パネル）が十分でない場合には、シークエンシングは満足できなくなります。上述したように、tagmentation精製後に、gDNAを、300塩基対の周りの断片の大部分（ 図2B、下のパネル）で1000 bpの150 bpのからのフラグメントにtagmentedする必要があります。
ライブラリー調製の最後に、ライブラリ品質がバイオアナライザーを用いてチェックされる。得られたプロファイルはtagmentation後でフラグメントの高い数字（ 図2C）とほぼ同じであるべきである。図書館品質は図1Cと同一でない場合、配列決定を実行するべきではありません。
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ディスカッション
NGS機器や技術の普及は、がんや遺伝性疾患の研究に新たな機会を提供してきました。全ゲノムシーケンシングまたはRNA配列決定に加えて、多数の患者では、選択したgDNAシーケンスを多量の分析は、同時に診断に大きな展望を提供しています。ここでは、ミディアムスループットシークエンシングデバイス（材料/機器の表）と同時に24人の患者の11の完全な遺伝子を研究するためにネクストエラ·テクノロジーを使用して（オンデマンドで利用可能な）特定の設計を開発しました。このプロトコルは、エラーのリスクが低い患者の懸念に迅速な対応を可能にするデータの迅速な生成を可能にする。 図6に示すように、サンガー配列決定で検出されたすべての遺伝的変異はまた、トランスポザーゼベースの調製キットを用いて検出した。この方法は、特に直接分析されている複雑なインデルの変化のために、信頼性が高く、解釈が容易である。それにもかかわらず、それは重要であるマイナス鎖に位置する遺伝子のためにそれを注意することは、それが（反転なしで）ヌクレオチドを補完することが必要である。本研究は、11の完全な遺伝子の分析のためのデザインを用いて行ったが、プロトコルがデザ.......
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開示事項
著者には宣言すべき利益相反はありません。
謝辞
私たちは、コートドールのリーグとジョルジュ・フランソワ・ルクレールセンターの財政的支援に感謝します。原稿の編集にご協力いただいたPhilip Bastable氏に感謝いたします。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | シーケンシング/中スループットデバイス |
| Nextera エンリッチメントキット | Illumina | FC-123-1208 | トランスポザーゼベースの技術 |
| 300サイクルカートリッジ | Illumina | 15033624 | |
| AMPureビーズ | ベックマンコール | ターA63881 | 磁気精製ビーズ |
| 磁気スタンド | アルパクア | A32782 | |
| 96ウェルプレート | ライフテクノロジー | 4306737 | |
| MIDI 96ウェルプレート | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | PCR増幅にのみ必要なシールです。他の標準的なシールは実験を通して使用することができます |
| MiSeq | Illumina | シーケンシング装置に付属しています Experiment Managerソフトウェア インターネットアドレス:http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new メーカーウェブサイトツール |
参考文献
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
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再版と許可
