Method Article

人間頸管サンプルの採取、単離、およびフローサイトメトリー分析

DOI:

10.3791/51906

⸱

July 6th, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology, University of Manitoba, 2Department of Community Health Sciences, University of Manitoba

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

子宮頸部からリンパ球と単球を採取するためのサイトブラシサンプリングの使用は、女性の生殖管免疫の分析のためのサンプルを提供する低侵襲技術です。このプロトコルでは、フローサイトメトリーアッセイのためのサイトブラシサンプルの収集と免疫細胞の単離について説明します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

粘膜病原体(HIVを含む)の公衆衛生上の重要性にもかかわらず、粘膜免疫、特に女性生殖管(FGT)については比較的ほとんど知られていません。異性間感染は現在、HIV感染の主要なメカニズムであり、性感染症(STI)の継続的な拡大を考えると、性器粘膜における宿主と病原体の相互作用を理解することが重要である。FGT免疫に関する知識の大きなギャップは、粘膜サンプルの収集と処理が困難であることが一因です。十分なサンプルサイズで研究を促進するためには、採取技術が低侵襲で効率的でなければなりません。この目的のために、子宮頸部サイトブラシサンプルの収集とその後の子宮頸部単核細胞(CMC)の単離のためのプロトコルが最適化されています。ex vivo フローサイトメトリーベースのイムノフェノタイピング法を使用すると、CMC リンパ球/単球集団の頻度と表現型を正確かつ確実に定量することができます。この技術は、サイトカイン、ケモカイン、抗プロテアーゼなどの可溶性免疫メディエーターを含む子宮頸部膣洗浄(CVL)の収集と組み合わせることができ、これらはすべて膣内の抗炎症性または炎症誘発性環境を決定するために使用できます。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

世界中の新たなHIV感染の大半は（UNAIDS 1）2011年に新たな感染の47％に相当女性と、異性間感染によって起こる。女性の生殖器（FGT）、HIVやその他の性感染性病原体のメインエントリポータルの1を理解すること、感染症を予防するための効率的な戦略を見つけることへのパスに非常に重要である。性器粘膜での免疫応答は、明らかに固有のものであり、末梢血2で測定されたものとは異なる。しかし、FGTの免疫動態の現在の知識は、最高の状態で制限されています。現在までに、粘膜免疫環境の研究は、主としてそれが感染後に粘膜組織における初期事象は、その後の疾患の進行3,4に強い影響を有することが明らかとなった腸管関連リンパ組織（GALT）に焦点を当ててきた。性器粘膜からサンプルを収集することは大きな課題であるとLACのために少なくとも部分的に責任があるFGTの免疫学の理解のK。 FGTはこのロケールからサンプルを収集し、分析するための効率的な方法が必要とされている特定の環境のコンテキストでのホストと病原体との間に免疫のダイナミックのパズルを解く。

FGTは2つのセクションに分かれています卵管、子宮内膜および子宮頚内膜が含まれ、上部生殖管および子宮膣部が含まれている下気道と膣（Kaushicによって審査ら 5）。これは、これらの異なる部位の相対的寄与はHIV感染症であるものはまだ不明である....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

倫理声明：マニトバ大学、ナイロビのケニヤッタ国立病院/大学の両方の研究倫理ボードは、この研究を承認し、書面によるインフォームドコンセントは、すべての研究参加者から得た。

1。メディアの作成およびCMCコレクションチューブ

  1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（137.93のNaCl、2.67 mMの塩化カリウム、8.1ミリモルのNa 2 HPO 4、1.47 mMのKH 2 PO 4）を調製する。無菌性のためのオートクレーブ。これは、数ヶ月間、4℃で保存することができる。
  2. 事前に分量5ミリリットルのPBS 4ºCで50ミリリットルファルコンチューブ（サンプルあたり1を収集するため）、ストアにサンプル採取時まで。
  3. ストレージ用洗浄液を収集するために、サンプルあたり2-4凍結バイアルまたは1.5 mlマイクロチューブにラベルを付けます。
  4. 細胞培養培地を調製する：RPMI 1640 + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシンB（終濃度100単位/ ml、100μg/ mlの250 ng / mlで、respectivイーリー、無FCSを/ FBSを追加しました。

細胞採取用ブラシのサンプルの2。コレクション

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マルチパラメータフローサイトメトリーは、以前に特徴づけられていない組織において、細胞サブセットの表現型や機能を分析するための強力なツールです。 CMC試料の分析は、適切なゲーティング戦略を、リンパ球および単球の両方の集団についての情報を得ることができる。

代表的なCMCゲーティング戦略は、一致したPBMCプロファイルと比較して、 図2に示されている。FSC-Hプロット対FSC-Aであっても、濾過後、PBMCと比較して、CMC試料において高度に蔓延している細胞ダブレットの排除を可能にする（ 図2A）。精度管理試料は、凝集塊の流量やアーチファクトの変化が容易に（ 図2B）を同定することができる時間にゲーティングによって流の問題の除去を含む。リンパ球/単球集団の同定は、PBMCとCMC試料（ 図2B）の両方で比較的似ています。生存性色素による死細胞の排除が包含を防ぐ非特異的蛍光抗体複合体を取り込んだのアポトーシス細胞。生存率は、PBMCと比較して、CMC.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

女性の生殖器（FGT）の免疫に関する知識に大きなギャップを考えると、CMCで表現型分析は、子宮頸部の複数のリンパ球集団への洞察の広い配列を提供することができます。プロテオーム解析と子宮頸洗浄液中のウイルス量の測定と相まって、性感染症（STI）Sおよび他の病原体に対する免疫は、様々な集団で解剖することができます。

技術的な考慮-のCMC：CMC試料の分離と成功染色が困難な場合があります。 CMC収集プロトコルの最適化は、子宮頸スクレーパー、その後最終的に細胞採取用ブラシが続く最初のCVLを集めるの有効性を、強調してきた。なお、以下に述べる種々の理由のために、サンプルの除外の可能性の増大に起因する末梢血研究のために計算されたものと比較して、計画されたサンプルサイズを大きくすることが重要である。

欲望のテストCMCの試料に対するdフローパネルは前開始を検討することが重要です。これは、特に、単球ゲート内には、CMC試料中の細胞の自家蛍光を監視することが重要である。いくつかのチャネルにおけるCMCの自.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、ナイロビ大学の研究プログラムの臨床ディレクターであるJoshua Kimani氏に対し、このプロトコルに関連する粘膜免疫学研究への支援に感謝したいと思います。著者は、CHVI助成金MOP86721からの資金提供に感謝したいと思います。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 μ50mlファルコンチューブBD352360CMC処理
RPMI 1640HycloneSH30027.01CMC処理
シ胎児血清生命技術16000044CMC処理
ファンギゾン生命技術15290-018CMC処理
ペニシリン/ストレプトマイシンシグマP4333-20mlCMC処理
50 ml ファルコンチューブフィッシャー14-959-49ACMC 処理
血液銀行 使い捨てトランスファーピペットフィッシャー13-711-6MCMC 処理
サイトブラシとクーパー外科C0121CMC サンプリング
使い捨て頸部スクレーパークイックメディカル2183CMC サンプリング
15 ml ファルコンチューブフィッシャー14-959-70cCVL プロセッシング
1.5 ml チューブ EppendorfFisher05-402-18CVL storage
LIVE/DEAD Fixable Cell Stain KitInvitrogen各種フローサイトメトリー試薬
固定バッファー (4% PFA)BD554655フローサイトメトリー試薬
IgG マウスSigmaI8765フローサイトメトリー試薬
用mセルストレーナー ウ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. UNAIDS. Global Report 2013. http://www.unaids.org/en/media/unaids/contentassets/documents/epidemiology/2013/gr2013/UNAIDS_Global_Report_2013_en.pdf. , (2013).
  2. Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V., Wira, C. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cervical Mononuclear CellsFlow Cytometry AnalysisCytobrush Sample CollectionCervical Vaginal LavageCell Isolation ProtocolImmunophenotyping TechniqueLymphocyte Monocyte PopulationsHIV Susceptibility ResearchFemale Genital TractPeripheral Blood Controls

Related Articles