途上胚性マウス心臓弁地域からのタンパク質の単離

Summary

若い胚性マウス弁におけるタンパク質発現の解析は、利用可能な組織が限られているために妨げられてきました。この原稿は、ウェスタンブロット解析のために、発生中の胚性マウス弁領域からタンパク質を調製するためのプロトコルを提供します。

Abstract

ウェスタンブロット分析は、タンパク質レベルを検出し定量するために一般的に使用される技術です。ただし、小さな組織サンプルの場合、この分析法では目的のタンパク質を検出するのに十分な感度が得られない可能性があります。これらの困難を克服するために、私たちは成体ヒトの心臓弁からタンパク質を得るためのプロトコルを検討し、これらのプロトコルを開発中の初期胚マウスの対応物に修正しました。簡単に言うと、マウス胚性大動脈弁領域(大動脈弁および周囲の大動脈壁を含む)は、プロテアーゼ阻害剤を含むトリスベースの溶解緩衝液の可能な限り最小限の体積で収集されます。育種戦略に基づいて必要な場合、胚は、均質化のために4つの胚性大動脈弁領域をプールする前に遺伝子型決定されます。ホモジナイズ後、SDSベースのサンプルバッファーを使用してサンプルを変性させ、SDS-PAGEゲル上でのランとその後のウェスタンブロット分析を行います。タンパク質濃度は、分光光度法タンパク質定量アッセイを使用して定量するには低すぎるままであり、その後の分析のためにサンプルが残っていますが、この手法を使用して、4つの胚性13.5マウス大動脈弁領域のプールサンプルからウェスタンブロットを介してリン酸化タンパク質を成功裏に検出し、半定量することができます。この手法は、初期胚性マウス弁発生中の細胞シグナル伝達経路の活性化とタンパク質発現レベルを研究するのに役立ちます。

Introduction

タンパク質発現レベルを同定および定量化することができることは、動物 - 、および細胞ベースの実験のための標準的な技術である。しかし、開発中にこの特定の組織におけるタンパク質発現を評価し、初期胚心臓弁の開発における長年の関心にもかかわらず、現在、ヒヨコとマウス^1,2の両方で免疫組織に限定されている。ほとんどのモデル生物（ 例えば 、ニワトリおよびマウス）の現像バルブにおけるタンパク質発現を定量化することの難しさの一部を得ることができるタンパク質の量を制限するバルブのサイズが小さいことである。このように、定量分析のために、研究者は、一般的に、その後の定量的PCRやマイクロアレイ解析^2-5 RNA抽出と増幅に依存しています。しかし、RNAおよびタンパク質発現レベルが⁶完全相関ではないため、RNA発現に焦点を当てたことは、任意のシグナル伝達に発生する多数の変更を厳密にアカウントを提供することはできません開発中のさまざまな時間での経路。現在利用可能な方法でこの制限に基づいて、この手順の目的は、確実に重要であるさまざまなシグナル伝達経路に発生する変化の定量分析のための現像マウス胎児心臓弁領域からのタンパク質の十分な量を得るためのプロトコルを開発することであったこの組織の成熟。

胚弁はすでに一般的にRNAの単離およびその後の遺伝子発現解析^2-5マウスから解剖されています。しかし、これら....

Protocol

注：全ての実験は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校で施設内動物管理使用委員会によって承認された。

1消費税大動脈弁

1. 興味のある胚の段階のために承認された安楽死の技術を使用して、開発の目的の胚日（E）で子犬を妊娠マウスを安楽死させる。
2. 妊娠中の女性の腹部を滅菌する70％エタノールを使用してください。下腹部の皮膚と筋肉を持ち上げ、離れて内臓から、および子宮角へのアクセスを許可するように、女性の下腹部キャビティを開い解剖。
3. 子宮角を取得するには、鉗子の鉗子で子宮頸部、慎重にカット尾を開催しています。所定の位置にホーンを保持し、任意の結合組織を切断、子宮角を持ち上げ、卵管と子宮角の接合部を切断して削除を完了。
4. コルを含むペトリ皿に解剖子宮角を置きdは、0.1Mトリス緩衝液（pH7.6）で、必要に応じてすすぎます。その後、胚嚢を露出するために子宮角開放長さ方向をカット。
5. 胚を公開するには、胎盤や胚の接合部での胚嚢を開いてカットし、胚を解放するために臍帯血管を切った。冷たい0.1Mトリス緩衝液で二ペトリ皿に解剖した胚を置きます。次の胚の準備ができるまで氷に残りundissected胚を持つ最初のペトリ皿を返します。
6. 胚内の胸壁へのアクセスを改善するために、胚を首を切る。遺伝子型決定が必要な場合は、削除し、氷上に置いエッペンドルフチュー​​ブに余分な組織片を保存する。
....

Results

この調製技術を用いて、E13.5胚からの単一の大動脈弁の領域にリン酸化されたSmad ^{1,5,8（pSmad）}を検出することができた。 図1Aに示すように、単一の弁領域から単離されたタンパク質は、かすかなpSmadバンドを検出するのに十分である。信号強度は、プールされ、弁領域の数に比例して増加する。重要なことは、pSmad /βアクチン比率が異なるサンプルサイズ（ 図1C）間でほぼ一定のままである。 、利用可能なタンパク質の低レベルに、同じブロットを剥離することができず、合計のSmadのために再プローブ。しかし、独立した合計のSmad 1を示すブロットおよびβ-アクチンが同じ発現パターン（ 図1B）を示す。

これらの弁領域は、心室心筋の汚染ほぼ完全に欠いている。右心室のサンプルと組み合わせてこの調製技術を用いて、ventricを検出することができなかったウラル大動脈弁領域における心筋マーカーANP、このマーカーは容易に心室（ 図2）

Discussion

初期胚のマウスとニワトリの心臓弁領域中のタンパク質レベルを定量化する能力は、バルブの開発のための重要な細胞シグナル伝達事象を理解するための追加のツールを提供しています。明細書に記載の当社のプロトコルは、標準的なタンパク質単離手順から大きく異なるものではない。しかし、いくつかの重要な手順を変更することによって、私たちは非常に小さなサンプルサイズからリン酸化タンパク質を得ることに成功しました。この結果を達成するために、以下の手順が特に重要である。その品質のタンパク質が得られることを確認するためには、氷の上またはプロテアーゼの存在と、必要に応じて、ホスファターゼ阻害剤で、氷のように冷たいバッファを使っているかどうか、チルドサンプルを維持することが重要です。さらに、少量の試料を処理するように設計されたデバイスとの均質化が十分に細胞膜を破壊するために不可欠である。でも、これらの注意事項、タンパク質の得られた収率は、分光光度計で、ブラッドフォードアッセイによって検出できないほど低いことがあるまたは静止タンパク質定量キットとは、その後の分析のために利用可能なサンプルを持っている。私たちは、それぞれの大動脈弁領域は7大動脈弁領域をプールし、定量化のため.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
時限妊娠マウス			目的の胚期で解剖する
立体顕微鏡	ニコン	SMZ645
0.1 M トリス、pH 7.6
マイクロハサミ	ファインサイエンスツール	15003-08
ファイン フォーセプス、#5	ファイン サイエンス ツール	11251-30
解剖針ホルダー	:テッド・ペラ社	13560
解剖針	テッド・ペラ社	13561-10
マイクロピペット、20 μl、チップ
溶解バッファー			50 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1% Triton
PhosSTOP	Roche	4906845001	10 mL 溶解バッファーに1錠を追加
TissueLyser LT	Qiagen	85600
ステンレス鋼ビーズ	Qiagen	69989
微量遠心分離機