のマイクロインジェクション法 Patiria minata接合体

サマリー

モルファント胚を生産する方法は、発生メカニズムや遺伝子制御ネットワークを研究するために不可欠である。海の星Patiria miniataはこれらの研究のための新たなモデル系である。ここでは、胚の培養液を生産、配偶子を取得するためのプロトコルを提示しており、この種から接合体の急速なマイクロインジェクション。

要約

棘皮動物は、長い生殖と発達の研究のための好みのモデルシステムであって、より最近では発生過程の遺伝子調節と進化の研究のためにしている。海の星、Patiria miniataは 、以前にウニ、StrongylocentrotusのpurpuratusとLytechinus variegatusでほぼ独占的に実施された研究は、これらのタイプのためのモデル系としての有病率を集めています。これらのモデル系の利点は、特定の遺伝子がアップまたはダウンレギュレートされている修飾された胚、細胞群を標識する、またはレポーター遺伝子を導入することを生産する容易さである。単一のマイクロインジェクション法は、そのような改変された胚の多種多様を作成することが可能である。ここでは、Pから配偶子を得るための方法を提示miniata、接合体の生産、およびマイクロインジェクションを介して、摂動の試薬 ​​を導入する。健康なモルファント胚はその後、GEの定量的および定性的研究のために隔離されているNEの機能。この生物のためのゲノム及びトランスクリプトームデータの利用が行われた研究し、それらを実行の容易さの種類が増加している。

概要

（一般的にバットのスターとして知られている）、海の星、Patiria miniataは ^、6〜8の進化の^4,5発達セルラー^1-3さまざまな、、、と生態研究の^9〜11のために興味深く、汎用性の高いモデル系として浮上している。大人P. miniataバハカリフォルニア州から¹²のシトカ、アラスカから太平洋岸に沿って分布していると容易に海洋水槽で維持される。卵母細胞を得一年中であり、それぞれの女性は、数万の卵万のを流すことができます。卵母細胞は、容易に成熟し、外部から¹³受精されている。生じた胚は容易な観察を可能にする透明であり;彼らは同期的に開発し、開発のための唯一の海水を必要とします。全ゲノムアセンブリおよび複数のトランスクリプトームはまた、P.ご利用いただけますminiata（ Echinobase.org ）。このような利点は、研究の範囲に最適ですおよび教育目的。

近年では、P。 miniataが発生遺伝子制御ネットワークのモデル系が^14〜16を分析するとなっています。このような研究の目的は、調節遺伝子の全体の賛辞を特定し、それら....

プロトコル

同じくらい実用的であるように、15℃ですべての海水や人工海水（SW）、大人の動物、および文化に保管してください。卵と接合体は、SWに浸漬保持されることを確認してください。

蒸留水または逆浸透水で再構成し、商業的に調製された海の塩は、SWの供給源として十分に機能する。比重計を使用して塩分濃度を確認し、最適なレベルを達成するために、塩や水を調整します。 1.020から1.025の比重レベルを保持します。化学物質による汚染を避けるために、他のすべての実験器具から離れたすべてのガラス製品やプラスチック製品を保管してください。脱イオン水または水で数回すすぎ、続いて希次亜塩素酸ナトリウム中で時折浸漬ですすぐことによって、クリーン胚グレードの実験器具。

1 Patiria miniata大人から配偶子の入手方法および成熟

1. 生殖腺を切除する動物を選択します。 P.ので卵巣や精巣の存在を探すことによって、切除後のセックスを決定miniataはそれ自体ではありませんxually二形。
2. 手術用メスの刃（ 図1A）と海のスターのアームの側面に沿って1センチメートルより大きくない小さな開口部を、カットします。小平滑末端鉗子を使用すると、生殖腺組織にアクセスし、切開を通して生殖腺組織を引き出すために戻っ切開の端を引っ張る。 ....

結果

このプロトコルの目的は、胚に試薬を導入することである。私たちは、緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を駆動するDNAレポーター構築物を注入することにより、プロトコルの有効性を示す。 DNAは初期の切断中に組み込んだとして注入した胚は、クローン性のパッチ（ 図4A-B）に、GFPを発現する。胚に導入することが望ましいです多くの試薬が大量にかつ胚の次善のバッチに有毒である。毒性は早期の切断や受精卵の段階で、または（ 図5A-C）異常 ​​な開発を課すことによって進行を止めること、開発を遅らせることによって現れる。

Pから図1の取得配偶子miniata大人。 A）生殖腺を切.......

ディスカッション

この技術の初心者ユーザーにとっては難しいですが、成功したモルファント胚を作成するために不可欠であるつの重要なステップがあります。最初は成熟し、適切に受精されます健康的な卵母細胞を選択している。培養中の正常な発達の割合は季節によって異なり、動物の健康、および卵母細胞は、単一の個体から採取された回数。卵母細胞は、10月まで4月から、より良い品質のものになる傾向があります。それは、大部分が、図2Aのではなく、 図2Bのように見えることを保証するために進む前に、卵母細胞を注意深く見ることが重要である。それは、卵母細胞が処理されるようにフィルタリングするのに十分に小さい場合は特に、成熟していないであろう卵母細胞の数が少ないために許容される。時折、未開発である卵母細胞の成熟の準備ができている、完全に発達した卵母細胞とほぼ同じ大きさである。彼らは、粒子の粗い、茶色colorinによって区別されグラム（ 図2E）。ろ過は未開発の卵母細胞から十分に発達した卵母細胞を分離せず、彼らはしばしば、図5に見られる欠陥を発揮する可.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-メチルアデニン	アクロスオーガニックス(フィッシャーサイエンティフィック)	AC20131-1000
190ミクロンニテックスナイロンフィルター	スモールパーツ(元セファール)	CMN-0185-C / 5PK-05
100ミクロンニテックスナイロンフィルター	スモールパーツ(元セファール)	CMN-0105-C / 5PK-05
ポリスチレンシャーレ、60 mm x 15 mm	フィッシャーサイエンティフィック	FB0875713A
毛細管	FHC, Inc	30-30-0	マイクロインジェクション針を引っ張るため
モデル P-97 ニードルプーラー	サッターインスツルメンツ	P-97
デキストラン、ローダミン グリーンライフ	テクノロジー	ズ D7163	GFP発現レポーターを注入する場合は、注射トレーサーとしてテキサスレッドデキストランを代用すると便利です
インスタントオーシャンシーソル	ドクターズ フォスターとスミス	CD-116528	多くのペットショップでも入手可能
マイクロローダーのヒント	Eppendorf	5242 956.003

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