ヒト全血でのリアルタイム細胞毒性アッセイ

サマリー

全血細胞毒性アッセイ（WCA）は、蛍光顕微鏡および自動化された画像処理をハイスループット細胞測位技術を組み込むことによって開発された細胞毒性アッセイである。ここでは、抗CD20抗体で処置したリンパ腫細胞の定量的な細胞傷害性分析を提供するために、ヒト全血中でリアルタイムに分析することができる方法について説明します。

要約

全体的な細胞毒性の時間情報へのアクセスを可能にする生細胞ベースの全血の細胞毒性アッセイ（WCA）は、ハイスループット細胞測位技術で開発されている。標的腫瘍細胞集団は、最初の配列形式に固定化予めプログラム、および緑色蛍光の細胞質ゾル色素で標識されている。セルアレイを形成した後、抗体医薬品は、ヒト全血との組合せで添加される。ヨウ化プロピジウム（PI）は、細胞死を評価するために添加される。セル配列は、自動画像化システムを用いて分析される。細胞質ゾルの色素が標的腫瘍細胞集団にラベルを付けながら、PIは死んだ腫瘍細胞集団にラベルを付けます。従って、標的癌細胞の殺傷の割合は死んだ標的細胞の数の標的細胞の生存数を計算することによって定量することができる。この方法では、研究者は、時間依存性および用量依存性の細胞毒性の情報にアクセスすることができる。驚くべきことに、有害ラジオません化学物質が使用されている。 WCAは、ここで提示リンパ腫、白血病、および固形腫瘍細胞株を用いて試験された。したがって、WCAは研究者が、関連性の高いex vivoの状態で薬効を評価することができます。

概要

製薬業界における最近の進歩は、腫瘍細胞抗体パーソナライズ癌治療の特定の識別を実現する上で関心が高まってきた。しかし、いくつかの障害は、プロセスで遭遇している。前臨床開発中の抗がん活性を有する薬剤のわずか5％がフェーズII-III試験の^1,2で十分な有効性を示した後にライセンスされています。多くの例では抗腫瘍薬^3-5主としてそれらの異なる血液成分にヒトおよび実験動物では異なる挙動を示すことが示されているように（in vitroおよびin vivoの両方で ）前臨床戦略は最適以下である。

抗腫瘍薬物スクリーニングプラットフォームの必要性に対処するために費用のかかる動物実験および臨床試験前のチェックポイントを提供するために、ヒト全血の細胞毒性アッセイ（WCA）は、より関連性の生物学的環境において抗腫瘍薬の有効性を評価するために提案されている。ザ·全血の細胞毒性アッセイは、抗体およびヒト全血の他の薬物候補への個々の細胞の応答を評価するために用いることができる。

WCAは、ハイスループットおよびハイコンテントイメージング⁶でハイスループット細胞測位技術を組み込むことによって現像される。自動化されたイメージングシステムを利用することにより、生きている細胞および死細胞の両方の数を高精度に判定することができる。による....

プロトコル

1.ターゲット細胞の調製

1. ^37°Cの時に（10％の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）、4nmのL-グルタミン、500 IU / mlペニシリン/ストレプトマイシンを、RPMI 1640培地）増殖培地中の標的細胞（ 例えば 、Raji細胞リンパ腫細胞）を維持5％CO ₂インキュベーター中。
2. 遠心分離機15ミリリットルチューブに標的細胞をペレット化するためのサンプル。遠心分離時間は、異なる細胞型によって変化する。 Raji細胞のための468×gで3分間遠心する。
3. 最初の上清の表面に形成された気泡を吸引し、全上清を除去。
4. チューブに10mlのPBSを追加します。再懸濁細胞塊を分割するには、上下に数回ソリューションをピペッティングすることにより細胞を。
5. 遠心分離機468×gで3分間のサンプル。
6. 上清の表面に形成された気泡を吸引し、全上清を除去。

細胞マイクロアレイの作製

1. Obtain細胞付着の96ウェルプレートキットまたは単一セルアレイ8ウェルチャンバースライド（材料/試薬の表を参照）。
2. キットからのDNA試薬にアクティベーターの1.2μlのを適用します。バイアルにキャップを、それを反転し、優しく溶液を混合する振る。
3. ソリューションは、RTで20分....

結果

抗CD20抗体およびリンパ腫細胞（Raji細胞およびMC / CAR）は、全血の細胞毒性アッセイ^{（WCA）7,8を}実証するためのモデル系として選択した。 MC / CAR細胞がその膜上のCD20の低コピー数を有していたRaji細胞では、細胞表面上のCD20の高いコピー数を有していた。標的細胞は、最初に緑色蛍光細胞質色素で緑色に染色し、96ウェルプレート上に配列した。万 - 5万標的リンパ腫細胞を、各ウェル中に固定化した。新たに採取したヒト全血180μlを各ウェルに添加した。抗CD20抗体は、その後、濃度勾配を有する96ウェルプレートの各ウェルに添加した。 37℃でのインキュベーションの16時間後、細胞数を、緑色蛍光細胞および赤色蛍光細胞の数を分析することによって、自動撮像素子を介して定量的に評価した。標的リンパ腫細胞がすべて同じ焦点面に配列しているため、各細胞の蛍光もレモずに直接検出されたウェル内の血液細胞をヴィング。

図1に示すように、（生きている、死んだの両方）の標的のRajiリンパ腫細胞の検出を行った。

ディスカッション

WCAは、理想的にはそのようなCDCおよびADCCアッセイ^9-11、などと前臨床動物試験の前に、伝統的なターゲットの上映の後に利用され、単一細胞の解像度^12-16、を用いたin vitro抗がんスクリーニングツールにおいて重要である。現在、CDCまたはADCCアッセイの一次標的スクリーニングアッセイは、すべての単純化されたメディアまたは緩衝液系中で実施される。しかしながら、これらの簡略化緩衝系において有効性を示す薬剤候補は、常に、より複雑な全血系には有効でない。したがって、WCAは、従来のターゲットスクリーニングおよび高価な動物実験の間のギャップを埋める偽陽性を減らすため、動物実験やヒト臨床試験における予防可能な障害を防ぐことができる。 WCAは、ヒト全血の内容に薬効を試験するために、前臨床試験に取り組む研究者にとって有益であろう。フローサイトメトリーを使用して死んだと生細胞をカウントすると、赤血球CEの完全な溶解を必要とする標的細胞を検出するために、LLS。フローサイトメトリー上WCA技術の利点は、赤血球の溶解なしに標的細胞を同定するこ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Cell Attachment 96ウェルプレートキット	Adheren	AP9601
サスペンション シングルセルアレイ 8ウェルチャンバースライド	Adheren	SS0801
Adherent シングルセルアレイ 8ウェルチャンバースライド	Adheren	SS0802
リンパ腫細胞株 CD20+	ATCC	CCL-86	Raji細胞
リンパ腫細胞株 CD20-ATCC		CRL-8083	MC/CAR
RPMI 1640 L-グルタミン	Life Technologies	11875-119
ウシ胎児血清	サーモ	SH30070.01HI
Peni/Strep	Life Technologies	15070063
Cytosolic dye	Life Technologies	C7025	Cell Tracker Green
Rituxan (Biosimilar)	ユーレカセラピューティクス
ヒト全血	Allcells	WB001
ヨウ化プロピジウム	シグマ	P4170-10MG
自動イメージングシステム	分子デバイス	ベンダーに連絡する	セルレポーター
細胞計数プログラム	分子デバイス	ベンダーに連絡する	セルレポーター