注意のセットシフトタスク：マウスにおける認知の柔軟性の測定

サマリー

このプロトコルの目的は、マウスにおける前頭前野媒介認知の柔軟性を評価するためにタスク（AST）をシフト注目セットとして行動アッセイを実施することである。

要約

認知障害、特に前頭前野(PFC)内の回路の機能障害は、うつ病、心的外傷後ストレス障害、統合失調症、自閉症スペクトラム障害など、多くの神経精神障害および神経発達障害の中核的な特徴を表しています。認知機能の障害は、セロトニン再取り込み阻害薬や三環系抗うつ薬の効果がわずかであるため、治療を成功させるのが最も難しい症状領域でもあります。機能的神経画像研究とヒト脳組織の死後分析は、PFCがこれらの障害を持つ患者における調節不全の主要な領域であることが示唆されています。しかし、マウスモデルにおけるこれらの欠損を評価するために使用される前臨床行動アッセイは、遺伝的に容易に操作でき、新しい治療法の研究の基礎を提供する可能性があり、十分に活用されていませんでした。ここでは、前頭前野を介した認知障害を評価するためにマウスで実行される行動アッセイである注意セットシフトタスク(AST)の適応について説明します。AST中の行動の根底にある神経回路は、ヒト、非ヒト霊長類、およびげっ歯類全体で高度に保存されており、優れた顔、構成物、および予測妥当性を提供します。

概要

タスク（AST）をシフトする注意のセットは前に^1,2十年間ラットでの注意と認知の柔軟性の尺度として開発されました。 ASTは、ヒトおよび非ヒト霊長類^3,4における認知機能障害を識別するために使用されているケンブリッジ神経心理テスト自動バッテリー（CANTAB）のextradimensional / intradimensionalコンポーネントをモデルにしています。簡単なルールを学習する能力はそのまま残りますが、ルールが変更されたときの応答を変更するために学習の欠損は神経精神障害の多様な（ すなわち、統合失調症、強迫性障害、うつ病）を患っている患者で発見され、神経変性疾患（ すなわち、パーキンソン病）および前前頭皮質⁵に病変を有する患者である。より一般的には、これらの患者は、認知の柔軟性に欠損を有すると記載されている。類似の赤字は、ヒト以外の霊長類とげっ歯類病変tの両方で示されている前頭前皮質oを^1,6-8を誘導した。これらの赤字は、認知硬直または注意セットをシフトする能力の障害の状態を示している。

被験者がルールのセットが無関係手がかりから関連区別するために、複雑な刺激を適用することができることを知ったとき、注目セットが形成されている。たとえば、ASTで、動物は媒体と食品の報酬をペアで、無関係のキュー（ すなわち、臭いを）注意を払うし、関連するキュー（ すなわち、掘り媒体）に対応し、無視することを学びます。メディアや臭いの変化を掘るのタイプが、メディアと報酬の間に対に関連がままであるこの関連は、その後、後続のタスクで補強されている。この強化されたルールは、認知セットを形成している。 認知柔軟性のASTプロトコル対策の面内の二つの段階：反転し、余分な次元シフト。 1 dimensio内の反転段階では、以前に否定的な刺激n個（この例では、媒体）は、前のステージからの正の刺激を無視するために動物に挑戦れ、現在は正である。感じた掘り媒体は前段の正の刺激だった場合、たとえば、紙は今は逆が真である、ネガティブな刺激だった。これは、ルールがディメンション内の刺激と報酬ペアに学ん変化させながら、それが注意セット（ すなわち、培地は、関連する次元である）維持しなければならないという点で、動物の柔軟性に挑戦。注意セットの形成は無関係の次元（この例では、臭気）は、関連する寸法になったときに、余分な次元の変速段でチャレンジされる。固執応答は、以前に学習したルールを使用して、継続的な選択肢で示したように、いずれかの段階で認知柔軟性の赤字を反映している。

非ヒト霊長類および齧歯類の両方における病変の研究がPERFする能力に起因する可能性が前頭前皮質の特定の領域を示しているAST ^1,9の特定の段階をORM。眼窩前頭皮質（OFC）の病変は、前頭前皮質（PFC）の部分領域は、AST ⁸に学習逆転の欠損を誘導することが示されている。さらに、内側前頭前野（MPFC）に病変が余分な次元シフトを行う際の具体的な難しさにつながる。

ASTを使用した多くの研究が、ラットおよび非ヒト霊長類において行われているが、比較的少数のマウスにおける認知機能の尺度としてASTを利用している。マウスでの遺伝子操作の容易さ、および様々な障害を研究中前頭前野の機能を測定するための重要なニーズを考えると、マウスではこの行動措置を適応し、検証することPFC機能不全に関連する疾患の研究するための重要な追加です。ここで詳細なプロトコルは、マウスではアプリケーション用に最適化されてビレルとブラウン¹による手順の変形例であるおよびマウス-納入仕様の多くを反映している以前に^2,6,10-13を報告されているC言語の適応。

プロトコル

注：この研究で使用した動物を、最適な結果のために生後4ヶ月および6ヶ月の間の雄のC57Bl / 6Jマウスである。マウスは、便利に活動（暗）期中にそれらをテストするために、逆の光サイクルで維持されている。動作は、ハウジングとは別の部屋で行われた場合、マウスを試験室への輸送を以下順応するために、少なくとも1時間に許可される。行動試験は、まだ視覚的に試験セッションを監視する実験十分な照明を可能にしながら、できるだけ少ないマウスの通常の活動の中断を最小限に赤色光条件下で行われる。

注：すべての明細書​​に記載の実験手順の態様は実験動物の管理と使用に関する指針と一致して行われた、第8版（NRC）とテキサス大学健康科学における施設内動物管理使用委員会によって承認されたサンアントニオでのセンター。

1。実験の設定

1. 「（下から約1）培地を掘って、インナーリムに、（深さ×2.5 "直径セラミックramekins 1.5非多孔性）」​​を記入。ろ紙ラウンドを半分に切断し、ラメキンの背面の内側にテープで（ 図1A）
2. 順化、トレーニングとテストの段階のために約20mgの断片に、ハニーナッツや砂糖コーティングされた品種 - 軽く加糖ドライ朝食用シリアル（食品報酬）をブレーク。
3. 注意セットタスクをシフト（AST）室（ 図1B）を作る：列車順応し、個々のチャンバ内の各マウスをテストする。少なくとも8室の生産をお勧めします。
   1. "×8"×7 "AST室12を構築する。 70％エタノールできれいに簡単である乳白色アクリル製の壁やスタートゲート。ギロチンスタイルは、取り外し可能な出発ゲートは待機エリア（5 "×8"）とテストエリア（7 "×8"）にチャンバーを分離する。
   2. クリア5を含める221;均等に検査領域の両側を分離×7 "リムーバブルパーティション。パーティション（ 図1C）の正面から「離れて」1間隔をあけ、アクセスをスニッフィングできるように、仕切りの底部分に直径の穴」と1 3 1/4カット。

2.手順の概要（図2）

1. 個別AST、ハツカネズミの前に、それらを少なくとも1週間逆光サイクルに調整することができます。
2. 順化、電車、個々の検査室で各動物をテストします。テストの最終日を終えた後1マウスと70％エタノールできれいに各チャンバを割り当てます。これは「ホーム·ケージ」または「自己」のような室内の臭いを行うことで、テスト中にストレスを最小限に抑えることができます。
3. 香りが放散することができるように2日、試験前に試験のポットを香り。マウスは、非常に強い臭気を持っているポットで掘ることはありません。 25 G針を注射器を用いて、約0.1mlをを追加ろ紙のトップにエッセンシャルオイル。

3.取り扱い（日1-8）

1. 食物制限の最初の日に先立って8日を開始するマウスを処理します。これは、テスト中の取り扱いに関連したストレスを減らすことができます。
2. 計量し、処理の記録体重を毎日。一日あたりの各マウス2〜3分を処理します。
3. 複数の実験者はマウスのセットをテストに関与していることがある場合は、各実験者は実験者に親しみを高め、ストレスや不安はトレーニングやテストの日に経験した削減する処理プロセスに参加することを確認してください。
4. テストの期間を通じて取り扱いと記録の重みを続けます。

4.食物制限（日9-12）

1. 制限食での場所のマウスは彼らの自由摂食体重の80から85パーセントでマウスを維持するために、事前の順化の先頭に4日から開始。一日あたりマウスあたりの食品の1グラムを与える。体重を下回る場合彼らが適切な範囲に戻るまで、指定された範囲は、1日あたり2グラムを与える。
2. マウスは、試験ポットに順応できるようにするために、各ホームケージの前面にある2 ramekinsを置きます。これらは、食品の報酬のために掘るためにマウスを訓練するために使用されるのと同じスポットである。
3. 4日間毎日ramekinsで食品の2グラムと食品の報酬（各穀物の半分一片）の1枚を追加します。
4. 動作は、トランスポート·マウスができるように、収容室に戻る前の日に少なくとも1時間試験室に、食物制限の1日目に開始し、マウスが収容された1以上の別々の部屋で行う場合それらは、試験室に順応。
5. 食物制限の最終日には、順化の開始前に、ホームケージの寝具を変更。ケージの寝具は、テストは（絶対に必要な場合を除き）トレーニングおよびテスト中に経験したストレスや不安を軽減するために完了するまで、再び変更​​されることはありません。
6. 維持する検査が終了するまで食事制限でマウス。日13-17日、消費された食品の報酬（食品ペレットの一般<1グラム）の量の推定値に基づいて、順化、トレーニング、またはテスト後のマウスの食べ物を与える。

5.順化（日13-14）

1. 2日前に訓練を開始し始めて、赤色光下での暗サイクルの間、順化を行う。
2. （同一チャンバがされる、これは検査室におなじみの「ホーム·ケージ」または「自己」匂いを導入することによって、新しい環境であることのストレスを軽減し、チャンバー内のホームケージから汚れた寝具少量のスプレッドトレーニングとテスト）の間、単一のマウスに使用する。
3. 室の待合室で水ときれいなラメキンを配置。マウスは、それらが水へのアクセスを持っていない場合食べない傾向がある。
4. 食品の報酬（〜20で検査領域に食物制限のために使用されている2 ramekinsを配置各MG穀物ピース）。
5. 待機エリアにマウスを置きます。スタートゲートを除去し、マウスは1時間のチャンバを探索することを可能にする。
6. 継続的に頻繁にテストエリアとポットを探索するマウスを奨励するために、空のramekinsに食糧報酬（〜20 mgの穀物ピース）を追加します。
7. 実験者の存在が試験中に追加されたストレス要因にならないように、マウスが順応期間を通して実験者を見ることができることを確認してください。

6.トレーニング（15日目）

1. 待機エリアにマウスを置きます。
2. 各テスト領域に、食品の報酬（〜20 mgの穀物ピース）を含む、空のramekinsを置き、スタートゲートを持ち上げる。マウス3分の両方の食物報酬を取得することができます。この手順を数回繰り返します。
3. 徐々に後続の試験におけるポットにおがくず/マウスケージの寝具を追加します。マウス3分がトライを終了する前に、各ポットからの食品の報酬を取得することを許可するアル。マウスは各ポットからの食品の報酬を取得した後は、次の試行に進みます。マウスは、食物報酬が部分的に覆われると、ヒントはすなわち、食品の報酬の領域の上に穀物ほこりを振りかける（提供することができる、食品の報酬の領域にわたっておがくずにインデントを作る掘りでの試みをしていない場合は、その一部を発見食品の報酬）。
4. 食品の報酬が完全に覆われるまで各試行の後におがくず/寝具の追加を続け、マウスを確実食品の報酬を見つけるために、完全な鍋で掘るする能力を示しています。
5. マウスが確実に訓練の開始の2時間以内に完全な鍋の食糧報酬を見つけるための能力を実証していない場合は、訓練の二日目に進みます。食物制限の上でマウスを維持し、次の日、この手順を繰り返します。
6. マウスは2日連続の後、食品の報酬のために掘るために失敗した場合はEXPで「掘ることができなかった」として、実験の残りからそれを除外して、注釈を付けるerimental記録。

7.テスト（日16-17）：

1. 初日には、単純な差別（SD）、複合差別（CD）、逆転（R1）、およびイントラ次元シフト（IDS）をテスト。
2. （;オプションのR2）、余分な次元シフト（EDS）2日目に、内寸法シフト2（IDS2）、内寸法シフト3（IDS3）、逆転2をテストします。
3. ペアメディアと香りを表1に示す。
4. 試験日の取り扱いの際には、マウスを飢餓によるテスト中に焦点の欠如を避けるために1食の報酬を与える。この時点から試験日の終わりまで、正しい選択のための報酬以外の任意の食べ物を提供していません。
5. テストの開始時に、鉗子を（ポット間の香りの広がりを制限する）を使用して、正しい選択を示している鍋の食糧報酬の一部を配置します。食物報酬を完全培地（ 図3参照）によってカバーされるべきである。食物報酬から香りキューを回避するために、穀物粉塵oを振りかける段階の開始時にすべてのポットVER。
6. スタートゲートを閉じた状態で待機エリアにマウスを置きます。検査室の両側にポットを置きます。スタートゲートが除去され、タイマーが開始されると試験が開始されます。トライアルあたりの各マウス3分の選択をするようにします。マウスは各試行のための選択をしたまでは（正しいか正しくない）選択肢と時間を記録します。
   注：「選択は」のいずれか鍋で掘るしようとする試みで示されます。マウスがメディアを避難し、それが食品の報酬または食品の報酬を発見するメディアの避難に十分なを見つけるために作成する空間で十分その鼻を突いたかどうDIGは唯一の選択肢として記録されている。マウスは3分以内に選択を行っていない場合、これは選択の余地（誤った）として記録されている。
7. 選択は鍋のどちらかのために作られた後、検査室から選ばれませんでした鍋を削除します。正しい選択が行われた場合、マウスは後ろにマウスを置く前に、食品の報酬を完了することができます待合室。誤った選択が行われた場合、マウスが待合室にマウスを返す前に、その選択のための食物報酬がないことを示すためにポットを探索することを可能にする。
8. 各試験の終了時に、待機エリアにはマウスを置き、スタートゲートを交換してください。
9. マウスはASTの次の段階に進めるために連続して8正しい試験の基準を満たしていることを確認します。マウスが50試行中で連続して8正しい選択を取得しない場合は、その段階を失敗し、テストを完了するために移動することはできません。 6連続しない選択肢（選択肢なしの3分）が参加する失敗せず、次の段階に移動するマウスを禁止しています。

結果

この試験では、典型的な依存指標が基準（または8正しい連続した選択肢）を満たすために、ステージごとの試行回数である。 図4（a）は、ASTを使用して未処理C57BL / 6Jの各段階での基準を満たすために試行の平均数を示しています。マウスは、関連するキュー寸法（臭いやメディア）上の注意のセットを形成したように、連続intradimensional交代で基準を満たすために臨床試験の減少によって示されるようにパフォーマンスが向上し、反転ステージとextradimensionalシフトが満たすために、追加の臨床試験が必要になります基準。それは我々が臭いが関連している場合、基準に試行数の増加にシンプルな差別段階でいくつかの違いを観察反映しているように、2つの関連次元（ すなわち、メディアまたは臭気）のそれぞれで開始する動物の数を相殺することが重要ですキュー（ 図4B）。試験はSD段階で基準に達するようにした場合、第間で有意に異なっている電子2つの関連のキューの大きさ（ すなわち、メディアは、図4Bのように関連し...

ディスカッション

PFCにより媒介される認知柔軟性の欠損は、神経学的および精神神経疾患の様々な関連した重大な障害を表しており、成果及びこれらの障害に罹患している個人の生活の質に大きな影響を持つことができます。マウスでの使用のためのASTの最適化は、皮質介在認知機能障害を前頭前野に結合された疾患の遺伝的基礎を調査するために不可欠である。我々は、上記の方法は、特定の認知障害、認知の柔軟性、信頼性の尺度であることを見出し、そして密接にラットおよび非ヒト霊長類でこのタスクを使用して得られた結果を近似している。記載された方法はラットやマウスだけでなく、私たちの機関で専門家の助言·指導で、以前に記載されたプロトコルの大規模な調査の結果である。

とはいえ、マウスにおいて同様のタスクを使用して、以前の報告は、そのような行動測定の適応性を実証しているいくつかの注意点が^2,6,11。 Colacicco らは、4日間の期間¹¹にわたってテストを広げる2日あたりテスト弁別の数を制限した。これは連続したテストの日に以前に学習の刺激ペアの繰り返しが含まれていた。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
テストチャンバー			社内で製造され、仕様はプロトコル
ラメキンス	BIAコルドン	ブルー900002S12	amazon.com で購入
エッセンシャルオイル:	フロンティアナチュラルプロダクツ協同組合		http://www.frontiercoop.com/prodlist.php?ct=anpceoeo
バッド		で購入 191114
レッドタイム		191140
		190810
ナモンリーフ		191111
ローズマリー		191133
シトロネラジャワ		191112
バニラホホバオイル		191231
アニスシード		191102
ジンジャー
ナツメグ		191161
濾紙、直径9.0 cm	VWRインターナショナル	28310-048
https://us.vwr.com/ Digging Media
ラフィア	ッシュランド8オンス ラフィア		http://www.michaels.com/ で購入1/2 "から1"ストリップにカットグリーン
フェルト	Creatologyベーシックフェルトフォレスト/ダークグリーン36インチx 36インチ		http://www.michaels.com/ で購入 1 cm x 1 cmの正方形にカット
ブラウン フォーム	Creatology Fun Foam 18 x 12 in sheets (light brown/tan)		http://www.michaels.com/ 1/2 cm x 2 cm 長方形にカット
クレープ紙 (黄色)	Celebrate It Paper Crinkle 4 oz イエロー ジャンボ		http://www.michaels.com/ 1/2 "から1"ストリップ
リボン(ターコイズ)	を祝うワイドリボン4 x 10 yd 100%ポリエステル		http://www.michaels.com/ で購入し、1cm×1cmの正方形にカット
リック	セレブレート イット メタリック クリンクル ゴールド 2		http://www.michaels.com/ に購入1/2 "から1"のストリップにカットグ
ーグルアイズ、4 mm		ME4144	http://factorydirectcraft.com/index.php
ブラックスパンコールで購入、3 mm		8780BK
ピンクポンポン、1/4インチ		1018221
パイプクリーナー、赤		108430
寝具材料/おがくず			社内の動物から取得リソース
タイマー	コントロール カンパニー	5000	で購入 http://www.control3.com/5000p.htm
軽く甘くした乾燥朝食シリアル ループ	HEB		記載されているプロトコルで使用されるハニーナッツトーストオーツ麦、軽く甘いコーティングされた朝食用シリアルをお勧めします