エレクトロポひよこ胚脊髄における遺伝子発現差のRNA-配列解析

サマリー

このビデオは、in ovoエレクトロポレーションによるトランスフェクション後に、解剖されたニワトリ胚性脊髄サンプルの全トランスクリプトーム解析を実行するための基本的な手順を示しています。

要約

ニワトリのオボエレクトロポレーションは、神経発達中の遺伝子機能を特定するための迅速で安価な方法です。このような実験的操作後の差次的に発現する転写産物のゲノムワイド解析は、トランスフェクションされたコンストラクトによって引き起こされる下流の影響のほぼ完全な全体像を明らかにする可能性があります。この研究では、エレクトロポレーションと差次的に発現した転写産物の同定との間のすべてのステップを含む、トランスフェクションされた胚性脊髄のサンプルからトランスクリプトームを比較するための簡単な方法について説明しています。第1段階は、エレクトロポレーションのガイドラインと、リボヌクレアーゼフリー環境でのHH23胚からのトランスフェクションされた脊髄半分の解剖、およびトランスクリプトームシーケンシングに適した高品質のRNAサンプルの抽出に関する指示で構成されています。次の段階は、GalaxyパブリックサーバーにおけるRNA-Seqデータセットのフィルタリングと比較に関する一般的なガイドラインを用いたバイオインフォマティクス解析であり、これにより、小規模から中規模の実験のためのローカルな計算構造が不要になります。代表的な結果は、解剖法が高品質のRNAサンプルを生成すること、および2つのコントロールサンプルから得られるトランスクリプトームが本質的に同じであることを示しています。さらに、DNAコンストラクトの実験的過剰発現を対照サンプルとの比較後に視覚的に検証できる1つの例が提供されています。この方法の適用は、脊髄の初期発達に関与する神経因子の機能に関する新たな発見を促進するための強力なツールになる可能性があります。

概要

OVOエレクトロポレーションで部分的にDNAが^1-5を構築して、in vivoでの胚の構造をトランスフェクトするための迅速かつ安価な方法を表しているので、ライブ生物に関する遺伝学的研究は、頻繁にモデルとしてニワトリ胚を使用しています。このようpCIG ⁶または⁷のPMEとして目的の遺伝子と一緒に蛍光レポーターを含むもの転写物をコードするシストロン性発現ベクターは、下流の分析のための胚を処理する前に、立体顕微鏡下で所望の領域でのトランスフェクションの質の迅速な検証を可能にする。

DNA配列決定における最近の進歩により、これは、RNA配列^8,9を用いて、RNAサンプルからデジタル全トランスクリプトーム発現プロファイルを得ることが可能である。したがって、代わりにそのようなin situハイブリダイゼーション 、免疫組織化学および定量PCR、cDNAライブラリーの調製のためのように並列に少数の遺伝子産物の解析を可能にする時間のかかる方法のハイスループットシークエンシングは、全トランスクリプトームの情報を提供することができる。一つ一つの遺伝子の発現レベルに対する影響の実験的観察は、次に使用される構築物によって改変経路に対する強力な洞察を提供してもよい。使用される生物ゲノムアセンブリが​​利用可能である場合、これは、このように、ニワトリ胚を再度適切なモデルであり、特に容易である。

ユーザが信頼できるゲノム配列決定センターへのアクセス権がある場合、主な問題は、高品質のRNAサンプルを得ることである。この研究は、RNA-配列に適したトランスフェクトされた神経管、ならびに得られたデータセットのインシリコ分析における下流の工程からのRNAサンプルを得るための方法を示す。 48時間のインキュベーションに続いてHH12-13でエレクトロポレーション後、トランスフェトランク脊髄の半分は、リボヌクレアーゼを含まない条件下で解剖直後に溶解し、さらにRNA精製およびライブラリpreparatまで超低凍結による分解から保護されていたイオン。

ギャラクシー公開サーバ^10は、ハイスループット配列決定データを分析するための空きリソースへのアクセスを提供する。登録ユーザーのために提供スペースの量は、このようにローカルな計算インフラの必要性を排除し、小規模な実験のために十分である。 RNA-配列データ解析、フィルタリング、整列および遺伝子発現の定量/比較を含む。 RNA-配列データ解析のための一般的なガイドラインがあるが、フィルタリングパラメータは、配列決定の品質に大きく依存し、生データの品質管理分析の後に決定されるべきである。

このプロトコルは、入手して、in vivoでトランスフェクトしたニワトリ胚性脊髄からRNA-配列プロファイルを比較する手順について説明します。代表的な結果として、空のベクターでトランスフェクトした二つの独立した対照試料から得られたデータセットの比較は、方法は、再現性があり、示差的EXPRESの同定を可能にするはずであることを示した実験試料におけるSEDの転写産物。従って、この方法の適用は大きく一つの実験後の発見の数を増加させ、したがって、その後の調査のために、大量のデータセットを提供する可能性を有する。

プロトコル

1.エレクトロポ卵内 HH12-13鶏胚の神経管への関心のコンストラクト

トランスフェクションの満足できるレベルを有する個体の迅速な同定を可能にするために、好ましくはシストロン性転写物に、蛍光レポーターを使用するか、またはインターカレーウイルス2Aペプチド¹¹で目的のタンパク質に融合した。注：この段階のための典型的なインキュベーション時間は37.8℃で、周りの48時間である。

1. ×1 1/2針18のGに結合された注射器でアルブミンの3ミリリットルを取り除いた後、卵に小さなウィンドウを開きます。胚の可視化を強化するために、胚^1-4の下の滅菌リンゲル液中で1:50に希釈インド少量のインクを噴射する。
2. 無菌のリンゲル液で胚をカバーした後、それが満杯になるまで神経管の後端を通しての2.5μg/μlのDNAを含む10mMのTris-HCl、pHが8.2と0.1％の食品色素（F、D＆C）溶液を注入後脳領域まで。 、腹部に沿って4ミリメートル¹離れた位置の白金電極（直径0.5mm）をエレクトロポレーションし、それら⁴の間に100ミリ秒の間隔で5〜50ミリ秒のパルス及び20 Vを送達する。
3. エレクトロポレーション後、彼らはステージHH23に達するまでより48時間操作された胚をインキュベートし、蛍光実体顕微鏡下に横腹領域において、トランスフェクションの高いレベルを提示する個人を識別する。
   注：エレクトロポレーション後のインキュベーションの持続時間は、実験の目的に依存します。電気穿孔プラスミドは2時間²の後に有意な発現レベルを生成することができる。関心が早期発症遺伝子である場合にはこのように、電気穿孔後の潜伏期間を短縮することができる。

2.収穫が正常胚をトランスフェクトし、エレクトロポ脊髄の半分を解剖

注：この手順は、それぞれ10胚および利回りのために2〜3時間から続く1胚あたり-2μgの全RNA。神経管の解剖は、微細な動きを必要とし、いくつかの練習セッションは、実験試料に適用する前に必要になることがあります。

1. のRNase汚染除去溶液で、または4時間¹² 150℃で焼成することにより、金属解剖ツールを除染し、DEPC処理PBSを準備します。唯一の新しい認定RNaseフリープラスチック製品を使用してください。
   NOTE：収穫した後、それは切開中のRNaseの混入を防ぐために、標準治療に従うことが重要である。
2. 細かい解剖ハサミと篩い分けコレクションスプーンを使って胚を収穫。 100ミリメートルペトリ皿に冷たいDEPC処理PBSに胚を保つ。
3. 細かいピンセットで、（前部肢芽と後肢芽の前方限界の後方限界の間）全体腹部を切り出し、冷たいDEPC処理PBSを含む新しい皿にこのセクションを転送します。
4. 異なる3で穿孔する2本の細いガラス針を使用して、神経管と近軸中胚葉の間の胚の各背外側側に指摘している。
5. 中央穿孔2枚のガラス針を導入し、ゆっくりと神経管前後軸に沿ってそれらのいずれかを離れて移動。最初の動きが到達していなかった穿孔のためにこれを繰り返します。細かいピンセットで取り外した近軸中胚葉を削除します。
6. 、横向きに胚を回し神経管と脊索の間ピンセットの先端を挿入し、二つの構造を分離する前後軸に沿って反対方向でそれらをスライドさせます。
   注：これは、まだ神経管に取り付けられた中胚葉のほとんどを除去する必要があります。
7. 必要であれば、軽くピンセットの別のペアで神経管を保持しながら、ピンセットで引っ張ることにより、付着したままで中胚葉組織のいずれかの大きな部分を削除します。終了したら、そっと用いた冷DEPC処理PBSを含む別の皿に神経管を転送RNaseフリーのガラスパスツールピペット手動ピペットポンプに結合され、すべての管を解剖するまで氷上に保つ。
8. 2半分に神経管を分割。このために、内腔にピンセットの閉じたペアの鋭い先端を挿入し、それを介してピンセットを移動することにより、屋根板を開く。この後、ピンセットの先端で床板を切断して半分を分ける。
9. 替えの氷冷DEPC処理PBSで満たし1.5mlチューブに蛍光解剖スコープと転送の下で非エレクトロポ半分からエレクトロポレーション。必要であれば、プラスチック壁に取り付けられた任意の組織を解放するために、チューブの沈降を促進するために穏やかにマイクロチューブをフリック。
10. 3秒間100×gでスピンし、1mlのマイクロピペットで非常にゆっくりと、できるだけ多くのPBSを取り除く。どんな胚性物質がピペットチップに吸引されるかどうかを監視するためにマイクロチューブを通して輝く光源を見ながら、これを行う。これが発生した場合には、ゆっくりと放電しcentrifugaを繰り返する。
11. 神経管の半分あたりのRNA抽出のための溶解液70μlのを追加し、内容物を混合するチューブをフリック。 5分間激しくボルテックス、室温でインキュベートする。 5分のインキュベーションを繰り返し、さらに2回ボルテックスする。 -80℃で保存してください。
12. 次のステップのための十分な収量を確保するために、サンプルごとに少なくとも8神経管の半分を収集します。いくつかのエレクトロポレーション/切開セッションは神経管の十分な数を蓄積する必要がある場合に小さいサンプルをプールする。各条件について、重複や三連のために十分なサンプルを格納。

3. R​​NAを精製し、イルミナシーケンシング用のライブラリを準備

1. -80℃の貯蔵からのサンプルを取り出し、15〜30分間氷上に置きます。完了するまで室温で解凍を再開します。
2. 渦ウェルと5分間室温で残す。 1分間15000×gで再びボルテックスと遠心機は、不溶性物質をペレット化する。
3. 上清を新しいチューブに移し、総RNA単離キット取扱説明書に従ってRNA抽出に進む。濃度を高めるために推奨される最小ボリュームで溶出する。
   注：クリーンアップ後のDNase処理はRNA-配列のデータセット中のゲノムDNA配列の潜在的な汚染を回避するために推奨される。
4. 内容物を混合し、品質管理分析のための5μlを除去するためにチューブをフリック。ライブラリの準備まで-80℃で残ったサンプルを保存する。これらの試料は、RNAの分解を避けるために一回だけ解凍されるべきである。
5. RNA 6000ナノキットを使用して、バイオアナライザー機器で精製RNAを実行する。 RIN値は続行するには、少なくとも7以上でなければならない。
6. イルミナ互換性RNA-のSeqライブラリ調製キットを使用してライブラリを生成し、単一の読み取りは100bpを生成するように設定HiSeq器具の1レーンに4図書館まで多重化する。可能な場合は、潜在的な技術的なアーティファクトを最小化するために、同じランですべてのサンプルが含まれています。
   注：これは、最大5000万Rが得られるはずですほとんどの遺伝子¹³のカバレッジを得るために十分以上のものですサンプルあたりEADS、。

4.ギャラクシー公開サーバ¹⁰においてRNA-配列データセットを比較してください。

NOTE：Serverストレージスペースが限られており、多数の試料を比較する実験では、フィルタリングステップで生成された中間ファイルの削除を要求することができる。

1. （ギャラクシー公開サーバにユーザーアカウントを作成しhttps://usegalaxy.org ）とFTPはFASTQ形式でイルミナデータセットをアップロードします。
2. NGS下FastqGroomer ¹⁴ツールでアップロードされたファイルを準備します。QCと操作メニュー 。品質スコアが既にのPhred + 33（サンガー）でエンコードされている場合、単純に各データセットの属性の下fastqsangerにファイルの種類を変更することで、このステップをスキップします。
3. NGSの下FastQCツールを使用して各データセットの一般的な品質を分析：QCと操作私をNU。
   注：これらの読み取りの端部をトリミングするために使用されるパラメータの推定値を提供するように特別な注意が、塩基配列の質ごとおよび塩基配列の含有量の結果のグラフィックスに与えられるべきである。
4. QCと操作メニュー：トリムがNGSの下にツールFASTQ品質トリマー ^14を用いて低品質データで終わる3 'を破棄するように読み取ります。唯一の3 'が20以下の品質スコアのために終了処理するためのツールを設定します。
5. クリップツール（使用して読み取ってから、アダプター配列を除去http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/を QCと操作メニュー：NGSの下）。左未満45 bpの、入力に使用されるアダプタのシーケンスで読み込んで破棄し、両方のクリッピングおよび非クリッピング配列を含むよう出力を選択するためのツールを設定してください。さらに、ほとんどの低品質の塩基は既に最後の工程で除去されたため、未知の塩基とのシーケンスを破棄しないように選ぶ。
6. ツールトリム配列 （使用してhttp://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ NGS下）：FastQCによって検出された5 '配列バイアス（通常は10）を除去するために読み込んでのQCと操作メニューを、最初の拠点をトリミング。
   注：この時点で、それは再びFastQCを実行し、データセットの品質が向上したかどうかを判断するために以前の分析と比較することをお勧めします。
7. ダウンロードして、イルミナiGenomesからUCSCゲノムブラウザの最新のニワトリゲノムアセンブリをアンパック（ http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn ）および全ゲノムFASTA形式ファイルと遺伝子注釈GTF形式のファイルをアップロードする銀河の歴史にGETデータ]メニューの下にツールのアップロードファイルを使用して。
8. マップはTopHat2 ^15歳未満のアライナーを使用したニワトリゲノムに各サンプルについて読み取っNGS：RNA分析メニュー 。履歴からゲノムを使用することを選択し（ ステップ4.7でアップロードFASTAファイルを選択します）。
9. RNA分析メニュー：NGSの下カフス ^16を使用して、各サンプルの予測トランスクリプトームを構築します。 （歴史、 ステップ4.7からFASTAファイルから） バイアス補正を実行し、 正しいマルチリードを使用して、ガイドとして参照アノテーションを使用するかを選択します（ ステップ4.7でアップロードGTFファイルを選択します）とオプションをオンにしてください。
10. RNA分析メニュー：NGSの下Cuffmerge ^16を使用して、すべてのサンプルの予測トランスクリプトームをマージします。 （歴史、ステップ4.7からFASTAファイルから）とシーケンスデータ（ ステップ4.7からGTFファイル）参照アノテーションを使用するかを選択します。
11. RNA分析メニュー：NGSの下Cuffdiff ^16を用いて、各サンプルについてTopHat2によって生成されたBAMファイルを比較。分野では転写物は私を選択Cuffmergeによって生成されたトランスクリプトームをrgedと（歴史、 ステップ4.7からFASTAファイルから） バイアス補正を実行し、 正しいマルチリードを使用して、オプションをオンにします。
12. ソート差動式はフィルターの下のツールを使って数値的にソート列13（q値）で昇順のテーブルをテストして、メニューをソートします 。
    注：実験条件の間に有意な差発現を示す遺伝子/転写物は最も低いQ値を紹介します。
13. カバレッジグラフで視覚的に結果を確認するには、最初のツールはBEDToolsメニューの下ゲノムカバレッジ ¹⁷ のBedGraphを作成し使用してbedGraph形式にBAMファイルを変換する。報道せずに地域の報告を無効にするには、明確な区間としてスプライスされたエントリを治療し、比較されているすべてのデータセットのためのシーケンシングの深さを正規化係数によってカバレッジを拡大することを選択した。
14. 使用して大物形式に結果のbedGraphファイルを変換するツールウィッグ/ BedGraph·ツー·大物 （ http://www.genome.ucsc.edu/ ） 変換フォーマットメニューの下。 UCSCゲノムブラウザ（でカスタムトラックとして大物ファイルをアップロードhttp://www.genome.ucsc.edu/ galGal4アセンブリ用）とデータセット内のカバレッジを可視化するために目的の遺伝子を検索します。

結果

記載された方法を検証するために、2つの対照サンプルは、空のベクターのPME ⁷とインサートニワトリSCRT2 ¹⁸のジンクフィンガードメインをコードSCRT2-ZNFの構築を含む同じベクターでトランスフェクトされた胚から1つのサンプルを用いてエレクトロポレーション胚から生成した。各11-22μgのトータルRNAを得た試料は、8〜12の胚のプールから得た。すべての3つのサンプルは、高品質のRNAがこのプロトコルを用いて得ることができることを実証し、バイオアナライザー機器（ 図1）を用いて行っ品質チェック10の最適RIN値を獲得した。

配列決定の後、記載され、フィルタ処理の読み取りの百分の83から91の配向率を増加させた（データは示さず）。予想されるように、全体的に比較した場合、二つの制御サンプルからのトランスクリプトームの比較は散布図には明確な差を示さなかった（ 図2）およびピアソン相関係数は0であった。99.さらに、SCRT2配列の一部を含んでいる軌跡に沿ってすべての3つ...

ディスカッション

ここでは、鶏脊髄のエレクトロポレーション後の効果を分析するためのガイドラインを提供する。 DNAベクターのエレクトロポレーションは、より頻繁に目的の遺伝子を過剰発現するために使用されるが、一方はまた、遺伝子機能のノックダウン条件^19-21を生成するために、siRNAのためのドミナントネガティブ、quimericタンパク質または前駆体をコードする構築物を使用することができる。実際、gain-及び機能喪失型分析の両方から得られるトランスクリプトームプロファイルの比較は、より特異的な効果を発見する可能性を有する、示差的に、各条件での反対の方法で発現する遺伝子を指摘することができる。

いずれかの方法は、RNA抽出を下流適用される場合、RNA-配列ライブラリーの合成は、出発物質の最小初期量を必要とする。このプロトコルで、8胚は約10μgの全RNAのをもたらすのに十分であるべきである。十分な作業濃度を損なうことなく、個人の小さい番号から始まることはおそらくあり小さい体積の最終希釈を可能にRNA抽出システムの使用で可能。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
インドのインク	任意のサプライヤー18G
x 1 1/2針	BD	305196
3ミリリットルの注射器	BD	309657
トリス	MPバイオメディカル	819620
FD&C Blue 1	Spectra Colors Corporation	5.FC.0010P0	視覚化に使用される食品染料
(1 L)
- 7.2 g NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.37 g KCl	シグマ・アルドリッチ	P-4504
- 0.225 g CaCl2•2H2O	フィッシャー・サイエンティフィック	10043-52-4
- 0.217 g Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S-9390
- 0.02 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2Oを800mlにし、pHを7.4
します。   - ddH2Oから1L
- フィルターとオートクレーブ
PBS(リン酸緩衝液)(1 L)
- NaCl	Sigma-Aldrich	S-9888
- 0.2 g KCl	シグマ・アルドリッチ	P-4504
- 1.15 g Na2HPO4•7H2O	シグマ・アルドリッチ	S-9390
- 0.2 g KH2PO4	Sigma-Aldrich	P-5379
- ddH2Oを800mlにし、pHを7.2
に調整します。   - ddH2Oから1Lおよびフィルター
- 1 ml DEPC(ジエチルピロカーボネート)	Sigma-Aldrich	D-5758
- 激しく振って、室温
- オートクレーブ
ふるい分けスプーン	任意のサプライヤー
滅菌済み 60 x 15 mm ポリスチレン ペトリ皿	コーニングライフサイエンス	351007
RNaseZap RNase 除染ソリューション	ライフテクノロジー	AM9780
ファインポイント手術用ハサミ	任意のサプライヤー
ストレートファインポイントピンセット	任意サプライヤー
1.1 x 75 mmガラス毛細管から作られたプルガラス針	キンブルチェイス	40A502
9インチガラスパスツールピペット	任意のサプライヤー
手動ピペットポンプ	任意のサプライヤー
クリア1.5ml微量遠心分離機ポリプロピレンチューブ	コーニングライフサイエンス	MCT-150-C
マイクロ遠心分離機	任意のサプライヤー
RNAlater RNA安定化ソリューション	ライフテクノロジー	ズ AM7020
RNA水性全RNA分離キット	ライフテクノロジー	ズ AM1912
分子生物学グレード エタノール	任意のサプライヤー
RNA 6000 ナノキット	アジレントテクノロジー	ズ 5067-1511
2100 電気泳動バイオアナライザー Instrument	Agilent Technologies	G2939AA
Truseq RNA Sample Preparation Kit v2	Illumina	RS-122-2001/RS-122-2002