このビデオは、in ovoエレクトロポレーションによるトランスフェクション後に、解剖されたニワトリ胚性脊髄サンプルの全トランスクリプトーム解析を実行するための基本的な手順を示しています。
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この記事について
サマリー
要約
ニワトリのオボエレクトロポレーションは、神経発達中の遺伝子機能を特定するための迅速で安価な方法です。このような実験的操作後の差次的に発現する転写産物のゲノムワイド解析は、トランスフェクションされたコンストラクトによって引き起こされる下流の影響のほぼ完全な全体像を明らかにする可能性があります。この研究では、エレクトロポレーションと差次的に発現した転写産物の同定との間のすべてのステップを含む、トランスフェクションされた胚性脊髄のサンプルからトランスクリプトームを比較するための簡単な方法について説明しています。第1段階は、エレクトロポレーションのガイドラインと、リボヌクレアーゼフリー環境でのHH23胚からのトランスフェクションされた脊髄半分の解剖、およびトランスクリプトームシーケンシングに適した高品質のRNAサンプルの抽出に関する指示で構成されています。次の段階は、GalaxyパブリックサーバーにおけるRNA-Seqデータセットのフィルタリングと比較に関する一般的なガイドラインを用いたバイオインフォマティクス解析であり、これにより、小規模から中規模の実験のためのローカルな計算構造が不要になります。代表的な結果は、解剖法が高品質のRNAサンプルを生成すること、および2つのコントロールサンプルから得られるトランスクリプトームが本質的に同じであることを示しています。さらに、DNAコンストラクトの実験的過剰発現を対照サンプルとの比較後に視覚的に検証できる1つの例が提供されています。この方法の適用は、脊髄の初期発達に関与する神経因子の機能に関する新たな発見を促進するための強力なツールになる可能性があります。
概要
OVOエレクトロポレーションで部分的にDNAが1-5を構築して、in vivoでの胚の構造をトランスフェクトするための迅速かつ安価な方法を表しているので、ライブ生物に関する遺伝学的研究は、頻繁にモデルとしてニワトリ胚を使用しています。このようpCIG 6または7のPMEとして目的の遺伝子と一緒に蛍光レポーターを含むもの転写物をコードするシストロン性発現ベクターは、下流の分析のための胚を処理する前に、立体顕微鏡下で所望の領域でのトランスフェクションの質の迅速な検証を可能にする。
DNA配列決定における最近の進歩により、これは、RNA配列8,9を用いて、RNAサンプルからデジタル全トランスクリプトーム発現プロファイルを得ることが可能である。したがって、代わりにそのようなin situハイブリダイゼーション 、免疫組織化学および定量PCR、cDNAライブラリーの調製のためのように並列に少数の遺伝子産物の解析を可能にする時間のかかる方法のハイスループットシークエンシングは、全トランスクリプトームの情報を提供することができる。一つ一つの遺伝子の発現レベルに対する影響の実験的観察は、次に使用される構築物によって改変経路に対する強力な洞察を提供してもよい。使用される生物ゲノム....
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プロトコル
1.エレクトロポ卵内 HH12-13鶏胚の神経管への関心のコンストラクト
トランスフェクションの満足できるレベルを有する個体の迅速な同定を可能にするために、好ましくはシストロン性転写物に、蛍光レポーターを使用するか、またはインターカレーウイルス2Aペプチド11で目的のタンパク質に融合した。注：この段階のための典型的なインキュベーション時間は37.8℃で、周りの48時間である。
- ×1 1/2針18のGに結合された注射器でアルブミンの3ミリリットルを取り除いた後、卵に小さなウィンドウを開きます。胚の可視化を強化するために、胚1-4の下の滅菌リンゲル液中で1:50に希釈インド少量のインクを噴射する。
- 無菌のリンゲル液で胚をカバーした後、それが満杯になるまで神経管の後端を通しての2.5μg/μlのDNAを含む10mMのTris-HCl、pHが8.2と0.1％の食品色素（F、D＆C）溶液を注入後脳領域まで。 、腹部に沿って4ミリメートル1離れた位置の白金電極（直径0.5mm）をエレクトロポレーションし、それら4の間に100ミリ秒の間隔で5〜50ミリ秒のパルス及び20 Vを送達する。
- エレクトロポレーション後、彼らはステージHH23に達するまでより48時間操作された胚をインキュベートし、蛍光実体顕微鏡下に横腹領域において、トラ....
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結果
記載された方法を検証するために、2つの対照サンプルは、空のベクターのPME 7とインサートニワトリSCRT2 18のジンクフィンガードメインをコードSCRT2-ZNFの構築を含む同じベクターでトランスフェクトされた胚から1つのサンプルを用いてエレクトロポレーション胚から生成した。各11-22μgのトータルRNAを得た試料は、8〜12の胚のプールから得た。すべての3つのサンプルは、高品質のRNAがこのプロトコルを用いて得ることができることを実証し、バイオアナライザー機器（ 図1）を用いて行っ品質チェック10の最適RIN値を獲得した。
配列決定の後、記載され、フィルタ処理の読み取りの百分の83から91の配向率を増加させた（データは示さず）。予想されるように、全体的に比較した場合、二つの制御サンプルからのトランスクリプトームの比較は散布図には明確な差を示さなかった（ 図2）およびピアソン相関係数は0であった。99.さらに、SCRT2配列の一部を含んでいる軌跡に沿ってすべての3つ.......
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ディスカッション
ここでは、鶏脊髄のエレクトロポレーション後の効果を分析するためのガイドラインを提供する。 DNAベクターのエレクトロポレーションは、より頻繁に目的の遺伝子を過剰発現するために使用されるが、一方はまた、遺伝子機能のノックダウン条件19-21を生成するために、siRNAのためのドミナントネガティブ、quimericタンパク質または前駆体をコードする構築物を使用することができる。実際、gain-及び機能喪失型分析の両方から得られるトランスクリプトームプロファイルの比較は、より特異的な効果を発見する可能性を有する、示差的に、各条件での反対の方法で発現する遺伝子を指摘することができる。
いずれかの方法は、RNA抽出を下流適用される場合、RNA-配列ライブラリーの合成は、出発物質の最小初期量を必要とする。このプロトコルで、8胚は約10μgの全RNAのをもたらすのに十分であるべきである。十分な作業濃度を損なうことなく、個人の小さい番号から始まることはおそらくあり小さい体積の最終希釈を可能にRNA抽出システムの使用で可能。
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
CYIYはFAPESP(2012/14421-5)によって支援されており、FMVはFAPESP(2009/53695-0)からのフェローシップによってサポートされています。この研究で使用したRNA-Seqライブラリの準備とシーケンシングを行ったカリフォルニア大学デービス校のDNA Technologies Core、ハイスループットシーケンシングデータ解析ツールのための優れた無料のインターフェースを提供してくれたGalaxyチーム、そして彼女の研究室スペースでの撮影を許可してくれたMarianne Bronner博士に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| インドのインク | 任意のサプライヤー18G | ||
| x 1 1/2針 | BD | 305196 | |
| 3ミリリットルの注射器 | BD | 309657 | |
| トリス | MPバイオメディカル | 819620 | |
| FD&C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | 視覚化に使用される食品染料 |
| (1 L) | |||
| - 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.37 g KCl | シグマ・アルドリッチ | P-4504 | |
| - 0.225 g CaCl2•2H2O | フィッシャー・サイエンティフィック | 10043-52-4 | |
| - 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| - 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2Oを800mlにし、pHを7.4 | |||
| します。 - ddH2Oから1L | |||
| - フィルターとオートクレーブ | |||
| PBS(リン酸緩衝液)(1 L) | |||
| - NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| - 0.2 g KCl | シグマ・アルドリッチ | P-4504 | |
| - 1.15 g Na2HPO4•7H2O | シグマ・アルドリッチ | S-9390 | |
| - 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2Oを800mlにし、pHを7.2 | |||
| に調整します。 - ddH2Oから1Lおよびフィルター | |||
| - 1 ml DEPC(ジエチルピロカーボネート) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| - 激しく振って、室温 | |||
| - オートクレーブ | |||
| ふるい分けスプーン | 任意のサプライヤー | ||
| 滅菌済み 60 x 15 mm ポリスチレン ペトリ皿 | コーニングライフサイエンス | 351007 | |
| RNaseZap RNase 除染ソリューション | ライフテクノロジー | AM9780 | |
| ファインポイント手術用ハサミ | 任意のサプライヤー | ||
| ストレートファインポイントピンセット | 任意サプライヤー | ||
| 1.1 x 75 mmガラス毛細管から作られたプルガラス針 | キンブルチェイス | 40A502 | |
| 9インチガラスパスツールピペット | 任意のサプライヤー | ||
| 手動ピペットポンプ | 任意のサプライヤー | ||
| クリア1.5ml微量遠心分離機ポリプロピレンチューブ | コーニングライフサイエンス | MCT-150-C | |
| マイクロ遠心分離機 | 任意のサプライヤー | ||
| RNAlater RNA安定化ソリューション | ライフテクノロジー | ズ AM7020 | |
| RNA水性全RNA分離キット | ライフテクノロジー | ズ AM1912 | |
| 分子生物学グレード エタノール | 任意のサプライヤー | ||
| RNA 6000 ナノキット | アジレントテクノロジー | ズ 5067-1511 | |
| 2100 電気泳動バイオアナライザー Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
参考文献
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn....
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