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方法論記事

の伝播

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DOI:

10.3791/51953

⸱

2014年9月25日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Texas at Tyler, 2U. S. Horticultural Research Laboratory, USDA ARS

この記事について

サマリー

ここでは、in vitroでHomalodisca vitripennis細胞やHOCV-1を伝播するためのプロトコルを提示する。媒体はHOCV-1陽性培養物から除去し、RNAを168時間ごとに24時間抽出した。細胞生存率をトリパンブルー染色によって定量した。全ウイルス粒子は、感染後抽出した。抽出されたRNAは、定量RT-PCRによって定量した。

要約

ガラス状の翼狙撃兵（Homalodisca vitripennis）は米国南西部で発見、非常vagileと雑食昆虫です。これらの昆虫はXylella fastidiosa（Xにfastidiosa）、ブドウのピアース病（PD）の病因である木部が制限された細菌の優勢なベクトルである。ピアース病は、経済的に有害である。したがって、H. vitripennisは、病原体管理戦略のターゲットとなっている。 Homalodiscaのcoagulataウイルス-01（HOCV-01）と同定dicistrovirusはHの死亡率の増加と関連していたvitripennis集団 。宿主細胞はHOCV-01の複製に必要とされるため、細胞培養は、ロジスティックや生物農薬生産のための経済的価値がある目標と複製のための均一な環境を提供します。 H.の大規模増殖のために本研究では、システムpを組織培養を介した細胞が開発されたvitripennisウイルス複製のメカニズムをroviding。 HOCV-01は、全身昆虫から抽出され、培養されたH.に接種したさまざまなレベルで細胞をvitripennis。培養培地は168時間、24時間毎に除去し、RNAを抽出し、定量RT-PCRで分析した。細胞は、トリパンブルーで染色し、光学顕微鏡を用いて細胞生存性を定量化するために計数した。全ウイルス粒子は、全細胞培養崩壊が発生する前であると判断した時点であった、感染後96時間までの抽出された。細胞はまた、蛍光染色を施し、F-アクチンの取り付けおよび核完全性に対するウイルス活性を調査するために、共焦点顕微鏡を用いて観察した。この研究の結論は、Hである。 vitripennis細胞を培養し、バイオ農薬の生産を可能にするために適切なレベルでHOCV-01の大量生産のために使用されることが可能である。

概要

（Homalodisca vitripennisゲルマール1821）ガラス状の翼狙撃兵はXylella fastidiosa（Xにfastidiosa）、北米1ブドウ（PD）のピアース病の原因因子の優勢なベクトルとして同定されている。昆虫個体群管理はすぐにカリフォルニアのブドウ栽培産業へと南部米国各地、この破壊的な問題に対処するための研究の焦点となっている。家族Dicistroviridae、Homalodisca coagulataのウイルス01（HOCV-01）に属するプラスセンス一本鎖RNAウイルスは、野生H.で同定されているvitripennis集団および殺虫剤に害虫の抵抗性を低下させながら、それらの集団2-4の死亡率を増加させることが示さ。

効果的にリアH.感染させる手法の開発実験室の設定で成体までvitripennisがあるため困難であった H。 vitripennisは宿主植物5-8さまざまなを必要とする別のステージ特異的な栄養ニーズを持っている。具体的な施設は、リアライブHに必要とされる米国ではvitripennis;そのため、細胞培養は、より経済的で実行可能な代替だけでなく、HOCV-01の検出およびレプリケーション2,9にとってますます不可欠です。 H.の細胞培養を確立するための基本的な方法は、一方vitripennisが記述され、これらの方法はまだ、このようなウイルス2のような生物的防除剤の商業生産のために利用されていない。

次の手順の全体的な目標は、生物的防除剤としての利用に適しHOCV-01を高濃度で製造することである。ウイルス複製がなぜ成功し、Hを栽培し、最適化された生細胞を必要とし、 vitripennis培養は、ウイルスの収益性の高いレベルを生成するの進展に不可欠です。

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プロトコル

1細胞培養

注：米国農務省農業研究サービス（フォートピアス、フロリダ州、米国）での博士ウェイン·ハンター研究所によって確立Homalodisca vitripennisた細胞株は、初期線維芽細胞及び単層を含む混合細胞の段階で構成されるラボ株式を開始するために使用された。

  1. 25cm 2の培養フラスコを20〜24℃の温度範囲に維持され、無菌の実験室環境では、次の手順を実行します。
  2. 育成とH2G +ヨコバイ媒体、修正されたWH2ミツバチメディア10（ 表1）を使用して25cm 2の組織培養フラスコに培地を維持する。
  3. 〜53％の湿度で24℃で培養フラスコをインキュベートする。
  4. 例えば、培養増殖をモニターし、異常な細胞増殖のためにチェックし、潜在的な汚染物質を監視し、CULを越え、成長の進行状況をチェックするために100Xの総合倍率（TM）での倒立顕微鏡を使用してくださいトゥーレ表面。
  5. 培養表面を乱すことなく10日 - 7日毎完全培地変化（フラスコあたり〜4ミリリットル培養培地）を実行します。
  6. 培養表面が、細胞を解離するためにエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む0.25％トリプシンを用いて細胞増殖（コンフルエント）によって覆わ約80％である場合、培養物を通過させる。各培養フラスコにトリプシン3ミリリットルと短期間酵素に培養物（複数可）を公開する - 〜2の追加 - 完全な細胞解離を達成するために、（5〜10分）。
  7. 酵素活性を停止し、遠心分離コニカルチューブにソリューション全体を転送するために - （3mlの〜2）培養フラスコ（複数可）に新鮮な培地を同量を追加します。
  8. 350×gで6分間、4℃で遠心分離により細胞をペレット化。
  9. 細胞ペレットを乱すことなく上清を除去し、各チューブに新鮮な培地〜8ミリリットルを追加します。静かにピペットを用いて細胞をホモジナイズする。
  10. 1での分割培養：2比25 cm 2のフラスコ（〜セルsoluti 4mlのフラスコ当たりで）及び新たに渡された文化を残して、懸濁液中の細胞がフラスコの表面にしっかりと付着させ48時間平静。
    注：1cm 2の成長表面を有する48ウェル滅菌組織培養プレート中の細胞の培養も可能であり、それらは〜250μlのに培養培地の体積の減少と培養フラスコと同様に維持することができる。

2全ウイルスの抽出

  1. ウイルス陽性のHの体全体を均一化〜10秒間隔ボルテックス0.02％のジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物（DETCA）とリン酸緩衝液中vitripennis、pH約7.2、ノー存在する組織のより大きな塊がなくなるまで。 4℃または4℃で16時間22000×gで4時間124,500×gで超高速遠心分離を経由してウイルスを抽出します。一番上に沈殿物が形成した場合、滅菌綿棒11でそれを削除してください。
  2. 上清を捨てる。
  3. ペレットを収集し、0.4％のNa-デオキシコール酸および4％のポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル（ブリジ52）を含む、5ミリリットルの10mMリン酸緩衝液（無DETCA）、pH約7.2で溶解する。
    1. よくペレットを混合するために、チューブの側面からペレットを除去し、必要に応じて、溶液中まで押しつぶす。
    2. ペレットは、必要に応じて溶液中に行くと2のチューブ11内に組み合わせる助けるために〜5ミリリットル刻みで、10 mMのリン酸緩衝液を追加します。
  4. 遠心分離し、15分間11、300×gでソリューションを提供します。
  5. 上清を除去し、0.45μmのフィルターを通して溶液を渡し、大規模なコレクションチューブ11内のろ液を収集します。
  6. 3.5 kDの分子量カットオフ（MWCO）を用いて透析膜に転送するろ液、11を必要に応じて何DETCAを含まないリン酸緩衝液（pH7）に10 mMの少量を使用した。
  7. 4℃でのddH 2 Oで満たされた大きなビーカーに透析膜を配置します。のddH 2 Oを1時間ごとにFを変更するまたは5から6時間後、膜11中の白色の沈殿物が形成されるまで。
  8. 膜内から精製されたウイルスを回収し、のddH 2 O を 90μlに溶液10μlを添加することによって、10倍希釈シリーズに、100％のウイルス液を施す：100,000その後1の希釈に達するまでのddH 2 Oをさらに90μlに希釈液10μlを加える。
  9. -80℃で保存ウイルス液。

3。ウイルス複製

  1. 48ウェル培養プレートにおける種子細胞と細胞増殖が80％コンフルエント（細胞が平均速度で成長している場合は約72時間後に合格）になるまで、すべての行を育てる。
  2. 一番上の行を除いて、 等 100希釈、：細胞増殖がコンフルエント、 すなわち、1:10希釈、1つの行の一つの行に達する連続希釈したウイルスを用いてセルの各行に接種する。コントロールとして一番上の行を使用し、ボリュームコントロールなどの各ウェルにのddH 2 O10μlのを追加します。
    1. 前ウイルスと培養中のいずれかの井戸の最初の接種に、各行の最初のウェルを、実験的な細胞数と比較するための出発ベースライン細胞濃度を確立解離とカウントするため。
  3. pH変化を示す培地中のいずれかの色の変化のためと細胞形態の変化のためのウイルス接種後、培養プレートを24時間毎に監視します。
  4. 100X TMに倒立顕微鏡を用いて、各時点で試験板の画像つの列。
  5. -80℃でRNA抽出とウイルス定量化または長期-20℃でそれぞれ24時間の時点で撮像された列からすべてのメディアを取り外し、短期的に保管してください。
  6. 再懸 ​​濁細胞ペレに酵素活性を停止させ、0.25％トリプシンEDTAおよび新鮮培地のみ〜250μlのを使用して、1.9の新鮮な培地〜250μlの-以前のステップ1.6で説明したように培地を除去した後、ウェルから細胞を解離させるトン。
  7. 一週間にわたって各24時間の期間のための細胞解離後の細胞数を実行するための細胞を含有する各チューブに0.4％トリパンブルー染色液10μlを追加します。汚れが細胞数を実行する前に、10分間静置する。
    1. 汚れや生細胞への曝露の1時間以内に細胞数を実行すると、汚れだけでなく、非生存細胞を取り込むために開始されます。
  8. ゆっくりとマイクロピペットを用いて、標準的な血球計数器の両側に染色された細胞溶液10μlを加える。溶液を、気泡を避けるために、毛管作用によって取り込まれることを可能にする。
  9. 血球計数器の両側に実行可能な（非染色）細胞（血球計数器16の正方形の4カウントに相当）の数をカウントします。削除された列の各ウェルのために細胞数を実行します。
  10. 各列からの細胞数を平均し、全細胞カウント数取得するには、次の式を使用します。x希釈係数（セル/ 4の平均数）=セル×10の数を 4ミリリットル。これは、培養中の細胞密度または生存細胞の数である。

細胞培養から4ウイルスの抽出

  1. 処理されたHを削除する1.8酵素活性を停止させ、0.25％トリプシンEDTAおよび新鮮培地のみ〜250μlのを使用して、 -以前のステップ1.6で説明したように培養フラスコから細胞をvitripennis。
  2. 上清を捨てる。
  3. 2.8 -以前のステップ2.3で説明したプロトコルに従って、培養細胞からウイルスを抽出します。

5。RNA抽出

  1. 製造業者のプロトコルごとの液体サンプル用に設計されたグアニジニウムチオシアネート - フェノール - クロロホルム抽出を使用して、各1週間のウイルス試験中に回収した培地のサンプルからRNAを抽出します。
  2. ストアを-80℃でサンプルを抽出した。

6 RT-PCR

  1. 使用した伝統的なPCR法を実行して、RT-PCRのためのウイルスの基準を確立ウイルスとのプライマー対HOCV RT-PCRプライマー1（フォワード5'-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 '、5'-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3を逆転'）全身H.から分離するvitripennis。
  2. 主題PCR産物は、0.1％臭化エチジウムを含む2％アガロースゲルで120 Vで60分間電気泳動をゲル化する。
  3. ゲルからのバンドを切り出し、製造業者のプロトコルに従ってゲル抽出キットを用いて精製する。
  4. プールは、すべて切除し、ゲル精製し、製品と、さらに基本的なエタノール沈殿により精製し。全体的な試料濃度を増加させるためにトリスEDTA（TE）の約30μlの沈殿生成物を溶出する。
  5. 核酸検出のための260/230波長設定を使用して分光光度法を介してプールされたサンプル中のcDNAのレベルを定量化する。
  6. 57 ngの/ 57 AG /μL（10 -18）μLの範囲までの精製標品の10倍連続希釈系列を実行します。 iを記載したものと同様の連続希釈を行うnの濃度の要件の違いのために作ら調整を2.8。
  7. 低存在転写産物の信頼性の高い定量化と定量RT-PCRキットを使用して定量RT-PCRを行うことによって希釈系列の検出限界を決定します。
    注：5×10 -3コピーよりウイルス濃度は低いが検出されない。
  8. ステップ5.1で、前述のように実験試料からRNAを抽出し、分光光度法を使用して定量化する。
  9. 5 ngの/ヌクレアーゼを含まない水を使用してμlに抽出されたすべてのサンプルを正規化します。
  10. 次のように低コピー数を感知する能力を持つワンステップ定量RT-PCRキットを用いて25μlの反応として、二重に、すべての試料について定量RT-PCRを行う：50℃で10分間保持し; 5分間95℃で保持。 10秒、30秒、60°C、95°Cの30サイクル;各ステップでの5秒間99℃ - 50から溶融。
    1. 各反応混合物は1倍maste12.5μlのが含まれているように、マスターミックスを作るRミックス、フォワードプライマー1.0μL（0.3μM）、リバースプライマー1.0μL（0.3μM）、逆転写酵素および標準化値に基づいて、テンプレートの可変量の0.25μlの。
    2. RNaseを含まない水で25μlの総反応容量を持参してください。
    3. 5×10 -10、5×10 -8、5×10 -6、5×10 -4、5×10 -2のコピー：各PCRの5つの標準濃度以下のコピー数を使用して実行を含めます。各実行の開始時に早期取得時のノイズを低減するためにちょうど10倍-2.5の蛍光の下にそれぞれの実行のためのしきい値を設定します。

7。共焦点顕微鏡

  1. 各ウェルに直径18mmのガラス製カバースリップを含む12ウェルプレートにHomalodisca vitripennis細胞を成長させる。
  2. 単層が達成された後、四日間の期間プレートに24時間毎に1つの列に接種する。各Cことを確認してくださいolumnがうまくコントロールが含まれている、低ウイルス希釈（1:10）だけでなく、高いウイルス希釈（1：100,000）よく。ステップ2.8から得られたウイルス溶液を使用してください。
  3. 5日目にすべてのメディアを取り出して、1×PBS（pH7.4）で細胞を2回洗浄する。
  4. 30分間、4℃での冷4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。
  5. 1Xリン酸500μlの細胞に緩衝食塩水（PBS）を追加し、低速でロッカー上、室温で10分間、それらを洗ってください。細胞を3回洗浄する。
  6. それらを透過するために、細胞を0.1％トリトンX-100の500を添加する。室温で10分間放置します。
  7. 先にステップ7.5で説明したように、再び細胞を洗浄する。
  8. RTで細胞をブロックするために、5％ウシ血清アルブミン（BSA）溶液500μlを加える。 2時間放置した後、削除してみましょう。
  9. ×PBS中5％BSAを含む250およびF-アクチンのため汚れに各ウェルに希釈液を250μlを追加：在庫ローダミンレッド - 結合ファロイジン（RCP）1に希釈する。
  10. アルミFのカバープレート漂白から染料を防止し、4℃のCO / Nで細胞を培養するためのオイル。
  11. インキュベーションの12時間後にRCPを除去し、4を250μlと交換して '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）（250μg/ ml）を、5％BSAを含む1×PBS中に希釈し、細胞の核を染色する。
  12. 室温で1時間DAPIを含有する細胞をインキュベートする。
  13. 先にステップ7.5で説明したように1×PBSで細胞を3回洗浄する。
  14. 静かに井戸からカバースリップを除去し、抗退色試薬とマウントメディアを使用してスライドを顕微鏡にマウントします。
  15. 共焦点顕微鏡下で観察されるまでスライドを遮光箱に乾燥することができます。 Viewは、できるだけ早く染料が急速にフェードすることができますようにスライドを用意しました。
  16. 63X（油）は平面-apochromateレンズを含む顕微鏡を備えた共焦点顕微鏡システムを用いて画像染色された細胞。
    1. 543±10nmの励起及びRhoadmine赤conjucatedファロイジン575±10 nm発光レーザの波長を設定しますDAPI用、および369±10nmの励起及び450±30 nm発光。
    2. すべての画像を取得するために、検出器のために、同一のゲインとオフセットの設定を使用します。
    3. ソフトウェアを管理イメージに適切な画像処理ソフトウェアおよびソーティングおよびインポート所望の画像を用いて処理画像。

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結果

細胞の付着および成長が一次培養し、継続的な通路から、小規模および大規模の両方の培養フラスコ中の通路の48時間以内に見られた。線維芽細胞成長および発達にも、この時間枠内で観察された。新たに播種したフラスコは、48時間前に妨害されたとき、そこに、細胞の接着では見え下落したこともある遅い成長している文化や全く付着または成長につながる。細胞は、通過する一週間以内に約80％コンフルエントと10〜14日間（ 図1）で単層を形成した。この研究の開始時に培養した初代培養は、任意の形態学的劣化や、全体的な細胞生存率の低下なしに30以上の細胞継代を生き延びてきた。

細胞の付着および成長がプレートにフラスコからの流路の48時間以内に見られた。それは小さな成長面であるように、単層の形成は、約5〜6日間、短い時間で達成された。感染した培養を撮影T 100Xは、光学顕微鏡下衰退セル形状の完全性の徴候を示した。 48時間の感染後に、大きな穴が細胞の表面上に存在したことをどのよう見える。約72〜96時間後、非希釈しHOCV-01（ 図2）に感染し...

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ディスカッション

侵略的な農業の種の流入に関するライジング懸念は、新興害虫や病原体から身を守るための新たな方法論の需要増加につながりました。病気の予防と管理の焦点は、病原体のベクトルの管理を含み、この研究の主な対象となった。経済性、実用的なアプリケーションは、大面積にわたって、低コスト12に大量である必要があるため、農業において、病原ベクトルを管理するためのバイオ農薬のこのタイプを生成するための決定において重要な役割を果たしている。研究開発のための細胞培養を利用する実施は、ますます一般的になっている、そのようなものとして、本研究の影響は重要である。経済的に実現可能な統合された害虫管理（IPM）の戦略を特定することは世界的に継続的な成功の農業生産への鍵であり、本研究における知見は、IPM戦略を改善し、ブドウのPDの発生を低減するの進展に貢献します。

プライマリH. vitripennis細胞培養物を増殖させ、目に見える形態的劣化させることなく1年以上維持された。継代数が急激に細胞の代謝及び増殖特性13を変更すること...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

このプロジェクトに対する資金援助について、Texas Pierce's Disease Research and Education ProgramとUSDA-APHISに感謝いたします。また、共焦点顕微鏡法の支援について、テキサス大学タイラー校健康科学センターのHema Kothari氏にも感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
コーニング細胞培養フラスコシグマ・アルドリッチCLS430168表面積 25 cm2、カントネック、キャップ(プラグシール)
オリンパス DP30BW、IX2-SP、IX71オリンパス倒立顕微鏡・カメラ
トリプシン-EDTA溶液シグマ・アルドリッチT40490.25%、滅菌ろ過済み、BioReagent、細胞培養に適した、2.5gのブタトリプシンおよび0.2gのEDTA&Bull。ハンクス&プライムのリットルあたり4Na;フェノールレッドの平衡塩溶液
Greiner CELLSTAR マルチウェル培養プレートSigma AldrichM893748 ウェル (TC 処理済み、蓋付き)
DETCASigma Aldrich228680ジエチルジチオカルバメートナトリウム三水和物
Corning ボトルトップ真空フィルターシステムSigma AldrichCLS431206酢酸セルロース膜、細孔径0.45 μm、膜面積 54.5 cm2、フィルター容量 500 ml
Brij 52Sigma Aldrich388831ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル
リン酸緩衝液Sigma AldrichP5244滅菌水で 100 mM に希釈した
TRIzol LSLife Technologies10296-028
AgaroseSigma AldrichA5304電気泳動
臭化エチジウムSigma AldrichE7637BioReagent、分子生物学用、粉末
QIAquickQiagen28704
QuantiTect qRT-PCR キットQiagen204243
4% パラホルムアルデヒドSigmaAldrich P6148試薬グレード、結晶
性 PBSSigma AldrichP5368リン酸緩衝生理食塩水
Triton X-100Sigma AldrichX100
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma AldrichA2153
ローダミン 赤結合ファロイジンLife TechnologiesR415ローダミン ファロイジンは、赤オレンジ色の蛍光色素、テトラメチルローダミン
DAPISigma AldrichD9542
ProLong Gold 退色防止試薬Life TechnologiesP36934
LSM510 Meta Confocal SystemCarl Zeiss
LSM Zen 2007 SoftwareCarl Zeiss
Grace'シグマ アルドリッチG8142H2G+ ヨコバイ中型成分
L-ヒスチジン一水和物シグマ アルドリッチH8125H2G+ ヨコバイ中型成分
ミディアム 199 (10x)シグマ アルドリッチM4530H2G+ ヨコバイ 中型
ミディアム 1066 (1x)シグマ アルドリッチC0422H2G+ ヨコバイ ミディアムコンポーネント
ハンクSigmaAldrich51322CH2G+ ヨコバイ中型成分
L-グルタミン (100x)Sigma AldrichG3126H2G+ ヨコバイ中型成分
MEM、アミノ酸ミックス (50x)Sigma Aldrich56419CH2G+ ヨコバイ中型成分
1 M MgCl 溶液Sigma AldrichM8266H2G+ ヨコバイ中型成分
ペン-溶連菌 (w/グルタミン)シグマ アルドリッチG6784H2G+ ヨコバイ中型成分
ナイスタチンシグマ アルドリッチN6261H2G+ ヨコバイ中型成分
ゲンタマイシンシグマ アルドリッチ46305H2G+ ヨコバイ中型部品
デキストロースシグマ アルドリッチD9434H2G+ ヨコバイ中型成分
ウシ胎児血清シグマ アルドリッチF2442H2G+ ヨコバイ中型部品
に結合した高親和性F-アクチンプローブです。

参考文献

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