ラットにおける同種血血栓による虚血性脳卒中のための塞栓中大脳動脈閉塞（MCAO）

サマリー

この論文では、成体ラットにおいて相同血栓(フィブリンリッチ)を伴う塞栓性中大脳動脈閉塞を引き起こす標準的な方法を示します。このモデルは、ヒトの虚血性脳卒中を密接に模倣しており、虚血性脳卒中の血栓溶解療法の前臨床研究に適しています。

要約

組み換え組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）を用いた臨床的には、血栓溶解療法は、急性虚血性脳卒中のための最も効果的な治療のままである。しかし、tPAの使用は、その狭い治療窓によって及び出血性変化のリスクの増大によって制限されます。虚血性脳卒中の治療のための新たな血栓溶解剤や戦略を研究するための適切な脳卒中モデルを開発する緊急の必要性がある。腔内縫合MCAO塞栓MCAO：現在、虚血性脳卒中モデルの2つの主要なタイプはラットおよびマウスにおいて開発されてきた。管腔内縫合技術によってMCAOモデルが広く機構駆動のストロークの研究で使用されてきたが、これらの縫合糸モデルは、臨床状況を模倣せず、血栓溶解の研究には適していないでください。これらのモデルの中では、塞栓MCAOモデルは、密接に人間の虚血性脳卒中を模倣し、血栓溶解療法の前臨床研究に適しています。この塞栓モデルは、最初にOVによるラットで開発されましたergaard らは 1992年の^1、さらにZhang らによって特徴付け1997 ^2。塞栓MCAOがますます注目を集めているが、多くの研究室が直面する技術的な問題がある。血栓溶解研究のための増加のニーズを満たすために、MCA領域内の予測可能な梗塞体積を開発することができ、ラットにおける塞栓MCAOの再現性の高いモデルを提示する。簡単に述べると、修飾されたPE-50チューブを穏やかにMCAの起点に到達​​するカテーテルの先端まで内頸動脈（ICA）の内腔に外頸動脈（ECA）から前進する。カテーテルを介して、単一の相同血餅はMCAの起点に配置される。 MCA閉塞の成功を識別するために、局所脳血流量をモニターし、神経学的欠損および梗塞体積を測定した。本論文で示された技術は、研究者は、脳卒中の研究のためにこのモデルを確立するための技術的な問題を克服するのに役立つはずです。</ pの>

概要

脳卒中は米国における死因の第3位であるが、急性脳卒中治療の選択肢は限られて残っている。現在では、血餅を溶解する組み換え組織プラスミノーゲンアクチベーター（tPA）の静脈内注入は、急性虚血性脳卒中のための最も効率的な療法である。しかし、tPAの使用は、その狭い治療窓によって及び脳内出血のリスクの増大によって制限されます。このため、血栓溶解研究するのに適したストロークのモデルが緊急に必要とされている。

中大脳動脈（MCA）は、ほとんどの場合、ヒトでの行程に閉塞した動脈である。この動脈を中心に、虚血性脳卒中の多くの動物モデルが確立されている。現在では、MCAを閉塞することにより齧歯類局所虚血モデルの二つの主要な種類が開発されている：縫合MCAOモデルおよび塞栓MCAOモデル。管腔内縫合技術によってMCAOモデルが広く機構駆動のストロークの研究で使用されてきたが、これらの縫合糸のモデルはない人間のストロークの最大80％が血栓症または塞栓症によって引き起こされるように、ヒトの脳卒中を模倣する。しかし、血の塊を使用して、塞栓性脳卒中モデルは、密接に人間のストロークを模倣し、血栓溶解の研究に適していると考えられる。この塞栓モデルは、最初1992年にオーバーガードら^。1によってラットにおいて開発され、さらにZhang らにより特徴付けられた1997年²およびディナポリらによって2006年^3。塞栓MCAOは、ますます注目を集めているが、直面する技術的問題がある多くの研究室による。

本稿では、MCA領域内の予測可能な梗塞を開発することができ、成体ラットにおける同種血の塊と塞栓MCAOを製造するための標準的な方法を示しています。この記事で紹介した技術は研究者が脳卒中研究のためのこのモデルを確立するための技術的な問題を克服するのに役立つはずです。

プロトコル

倫理に関する声明：オスの成体Sprague-Dawleyラット（330〜380グラムの重さ）が、このプロトコルで使用されていた。このプロトコルは、LSUの健康科学センター、シュリーブポートで施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、（第8版、全米科学アカデミー「実験動物の管理と使用に関する指針」に準拠している、2011た）。

変性PE-50チューブの調製

1. 徐々チューブを柔らかく、手でガス火の上に長さ30cm、PE-50チューブを握り。静かにチューブを伸ばす。
2. デジタルノギス（ 図1）を使用して、延伸管上のポイントを選択し、それをマークし、長さ1cmの先端部（外径：0.30〜0.34ミリメートル）で長さ25cmのセグメントに修正されたPE-50チューブをカット。

同種血の塊の調製

1. 70％N ₂ Oおよび30％O中のイソフルランでラット（誘導のための5％、維持2-3％）で麻酔<採血前フェイスマスクによるサブ> 2。つま先のピンチによって麻酔を確認してください。
2. 発表された方法⁴でドナーラットの大腿動脈カニュレーションを行い、20cm長のPE-50チューブに直接大腿動脈の血液を移す。血液を凝固さ、室温で2時間チューブを配置し、その後、4℃で22時間、チューブを保持している。注：ステップ3.1で説明したようにカニューレ挿入は無菌技術を用いて行われる。ドナーラットをさらにサンプリングのために回収する。
3. 50ミリメートルのセグメントに、PE-50チューブをカットし、生理食塩水を含む滅菌ペトリ皿にチューブから血餅を洗い流す。
4. 長さ60mmのPE-10チューブに50ミリメートルに長い凝血塊を移し、23Gの針を用いて、通常の生理食塩水を含有する1ミリリットルの注射器に接続された20cm長のPE-50管に、PE-10チューブの両端を接続します（ 図2） 。
5. から血液細胞を除去することができる5分間の他の1つのシリンジからの連続交互運動によって血餅をシフト血餅とフィブリンコアを破壊することなく、血管外凝固血餅の壊れやすいを最小限に抑えます。
6. 40ミリメートル長いセグメントに血餅をカットし、無菌条件下でステップ1.2で説明したように修正されたPE-50カテーテル内に血塊セグメントを転送します。注：すべてのPEチューブはエチレンオキシドで滅菌する。

3塞栓中大脳動脈閉塞（図3A、B）

1. （15分の最低121℃、15 PSI）オートクレーブにより、すべての手術器具を滅菌する。 70％エタノールを用いて、手術テーブルと関連した手術用機器を消毒。
2. ステップ2.1で説明したようにイソフルランでラットを麻酔。両後脚につま先のピンチを実行することによって、麻酔の深さをテストし、（足を引き抜く）のいずれか観察した運動は、動物が手術を行うのに十分に麻酔をかけないことを示します。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、両眼に獣医軟膏の少量を適用します。腹側首と頭の再上の毛皮を剃る皮膚領域を露出させ、電気バリカンでgions。
3. 加熱パッド上に仰臥位でラットを置きます。直腸プローブ、コントロールを挿入し、恒温ブランケット制御ユニットを使用して36.5から37.5℃の間の体温を維持する。
4. 70％エタノールに続いて、10％ポビドンヨードで剃毛した皮膚や周囲の毛を消毒。
5. 解剖顕微鏡下で首に2センチ長い正中切開を行います。手術野を露出し、右総頸動脈（CCA）、外頚動脈（ECA）、内頸動脈（ICA）、および神経および筋膜（ 図3A）の周囲から遊離翼口蓋動脈（PPA）を解剖するために使用するリトラクター。注：アシスタントが動物を準備するのに役立ちますしない場合は、手術の前に、滅菌手袋を変更してください。
6. （迷走神経を傷つけることなく）、周囲の神経から無料でCCAを解剖し、動脈の下で無菌の5-0絹縫合糸を配置します。スリップノット（＃1）を接続し、小さなHEMOSを使用して縫合糸を把握tatおよび身体に向かって教えたプル。
7. ECAとその2つの枝、後頭動脈（OA）と上甲状腺動脈（STA）を解剖。獣医電気外科ユニットを用いて二つの枝を凝固させる。 ECAの下で無菌の6-0絹縫合糸を2枚配置します。
8. 動脈の下に配置された二つのシルク、本体に向かってヘッド（先端）と他に向けて一枚を分離します。 （2＃）の頭に最も近い側に、小さな止血とシルクをつかみ、頭に向かって教えたプルタイトな合字を接続します。後で使用するために他の絹糸で緩い結び目（＃3）を準備します。
9. （迷走神経を傷つけることなく）、周囲の神経からのICAとPPAを解剖。 6-0縫合糸（＃4）PPAを接続します。 ICA（＃5）の周りに6-0縫合糸で引き結びを作る。あるいはまた、微小血管クリップを使用してICAをクリップ。
10. Vannasスタイルの春のはさみとの緊密な（＃2）ルーズ（＃3）合字間のECAに小さな穴（スルー1/2）カット。変性PE-50用浴槽を挿入CCAの分岐に切開して、事前に血液凝固を含む電子。 （＃3）だけで十分な内腔の周りに留置チューブの移動性を維持確保するために緩い結紮糸を締めます。
11. 切り株を解放し、ECAとICAの分岐下の切り株を配置するために小さな穴の部位にECAをカット。これは修正されたチューブが簡単にICAにスライドできるようになります。 ICAを開いて、静かに、カテーテルの先端がMCA（分岐から〜17ミリメートル）の原点に到達するまで、ICAにECAの内腔からチューブを進める。注：前の70％エタノールで滅菌した、ECA内管の外面をチューブの先端を挿入し、滅菌生理食塩水で洗浄した。
12. 100μlのハミルトンシリンジ（ 図3B）を使用して、10秒以上の生理食塩水を10μlと一緒に修正されたPE-50カテーテルを通して血塊を注入。
13. 5分後、ECAからカテーテルを撤回。 ECAを結ぶと、CCAを再度開く。首に切開を縫合。

4。監視局所脳血流量（rCBFの）

1. MCA閉塞の前に、頭蓋骨を露出させ、頭皮が1.2センチ正中切開を行います。歯科スクレーパーおよび滅菌綿スワップで頭蓋骨上の組織を削除します。注：手術の前に、露出した頭皮エリアと周囲の毛を70％エタノールに続いて、10％ポビドンヨードで消毒されています。
2. 2mmの後部と0.7ミリメートルの球状のステンレス製バリ（ 図4）を使用して、ブレグマから5mm横に位置して1.5ミリメートルの直径のバーホールを開けます。
   注：無傷の硬膜にしてください。
3. 0.5ミリメートル硬膜表面の上にプローブを配置します。塞栓後の0（ベースライン）、5、15、30、60、90、および120分で脳血流量を監視し、5、15、30、45、およびtPAの静脈内投与後60分で続ける。脳血流の最後の測定後、頭皮切開を縫合によって閉じられている。注：首の切開の前に私たちは、MCAのocclus前ベースラインとして脳血流を測定イオン。ポストMCA閉塞私たちは首の切開の縫合閉鎖後のrCBFを測定します。したがって、頸部切開を無菌に保たれる。

5。術後ケア

1. 脱水を防ぐ、すぐに手術や痛みの軽減のために必要に応じて、すべての6〜12時間後にBuprenex（0.05ミリグラム/ kgで、SC）を注入するために生理食塩水を皮下2.5mlの注入する。
2. イソフルラン麻酔を停止します。 37℃獣医回収室（動物を暖かく保つ）にラットを置き、観察を続ける。ラットが麻酔から回復することは一般的に10分かかります。次に、滅菌したケージに動物を入れるケージにペトリ皿にいくつ濡れる食べ物を置き、動物滅菌室にケージを返す。
3. 脳卒中後24時間は、ペントバルビタールナトリウム（100 mg / kg体重、IP）の過剰投与によりラットを安楽死させる。

6。神経学的欠損スコア

1. 塞栓後の2時間前とでBedersonスコアを実行します。グレーディングsを使用0-3のCALEは、先に説明した^5：尾によってラットを上げ、0を、床に両方の前肢を拡張し、他の障害を示さない動物（通常の移動）; 1、尾によってラットを高め、対側前肢を曲げ; 2、旋回することなく、横方向のプッシュ（および前肢の屈曲）に対する耐性を減少した。 3、旋回とグレード2と同じ動作。
   注：塞栓後の2時間後にBedersonスコア= 0（なし赤字）示さないラットは、さらなる研究から除外されます。

結果

レーザードップラーフローメトリー（LDF）は脳虚血^6,7の誘導の間脳血流量をモニターした。私たちの研究室を含む多くの研究室が成功したMCA閉塞を有する動物を識別するために、局所脳血流を使用しているが、ベースラインのしきい値は、測定部位に関連している研究室間で変化した。以前に説明したように⁶ LDFのプローブは、2mmの後部とブレグマに対して横5mmと配置されている。脳血流は、0、5、15、30、60、90、及び血餅の注射後120分でモニターした。このデータに基づいて、ベースラインのrCBFの> 70％減少を示す動物のみを、MCAの成功した塞栓性閉塞（ 図5）と考えられている。血餅の注射後2時間、tPAの標準的なラット用量（10mg / kg）の少なくとも^7,8、10％ボーラスと、シリンジ注入ポンプ^7,8を用いて30分かけて90％の連続注入で静脈内投与した。私たちは、脳血流レベルが次第にincreasことを観察したtPAの治療の30分以内にベースライン（ 図5）の> 70％...

ディスカッション

本研究では、MCAの起源は、フィブリンに富む血餅により閉塞されたラットの塞栓MCAO脳卒中モデルを実行するための標準的な方法を、実証した。このモデルの主な利点は：フィブリンに富む血餅によるMCAのステムの閉塞は、ヒトにおける血栓塞栓性脳卒中に似て、塞栓性脳卒中モデルは、線溶療法の前臨床研究を行うのに適しており、このモデルが開発できることMCAによって供給された領域内再現可能かつ予測可能な梗塞容積。

塞栓MCAOモデルを実行するために、血餅の導入、安定性と拠点は梗塞サイズの変化及び影響を受けた脳領域^2,3に繋がる、管理が困難である。以前の研究では、障害となっている血栓をMCA ^2,3のステムに留まっているときMCA領域における再現性の虚血性病変のみ達成できることを実証した。正確に凝血塊を提出し、再現性の塞栓性脳卒中モデルを生成する、この研究では、修正されたPE-50チューブとどのようにMCAの起源とどのようにMCAにフィブリンに富む血餅を注入することに変更されたチューブの先端を導入する準備する方法を示します。以前の報告²

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
rh-tPA	Chemical	Genentech
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Chemical	Sigma	T8877
麻酔気化器	装置	、Soma Technology	Drager Vapor 19.1
充電式高速マイクロドリル	機器	ファインサイエンスツール	18000-17
湾曲ハサミ	機器	ファインサイエンスツール	14117-14
デュモン鉗子(医療#7)	機器	ファインサイエンスツール	11270-20
デュモン鉗子(医療#5)	機器	ファインサイエンスツール	11251-35
バンナススタイルの春はさみ	機器	ファインサイエンスツール	15000-03
獣医用回収室	設備	Pecoサービス	V1200
Genie plusシリンジポンプ	機器	ケント・サイエンティフィック・コーポレーション
ラット脳マトリックス	機器	ケント・サイエンティフィック・コーポレーション	RBMA-310C
デジタルキャリパー	機器	ワールド精密機器
501601 解剖顕微鏡	機器	ワールド精密機器	PZMTIII-BS-LWD
ハミルトンシリンジ	機器	ハミルトン	モデル710
ホメオサーミックブランケットコントロールユニット	機器	ハーバード大学 装置
クリッパー	機器	ブレインツリーサイエンティフィック	CLP-9931
獣医用電気メス	機器	MACAN 製造会社	MV-9
血流量計	機器	Adinstruments
PowerLab 4/30	機器	Adinstruments
LabChart 7.2	ソフトウェア	Adinstruments
1 ml シリンジ	消耗品	ベクトン、ディキンソン・アンド・カンパニー	309659
23 G ニードル	消耗品	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	305143
30 G ニードル		クトン・ディキンソン・アンド・カンパニー
305106 PE-50 チューブ	ベ	クトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	427517
PE-10 チューブ	消耗品	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	427400
6-0 シルク縫合	糸 消耗品	ハーバードの器具	723287
5-0絹の縫合	糸の消耗品	ハーバードの器具	517607

電気 ベ