器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

サマリー

Pair記録は、シナプス的に接続された2つのニューロンからの同時全細胞パッチクランプ記録であり、個々のニューロン間のシナプスの正確な電気生理学的および薬理学的特性評価を可能にします。ここでは、電気生理学が装備された任意の実験室の器官型海馬スライス培養でこの技術を確立するための詳細な方法論と要件について説明します。

要約

Pair記録は、シナプス的に接続された2つのニューロンからの同時全細胞パッチクランプ記録を含み、個々のニューロン間のシナプス接続の直接的な電気生理学的特性評価だけでなく、シナプス前ニューロンまたはシナプス後ニューロンの薬理学的操作も可能にします。器官型の海馬スライス培養で実施すると、2つのニューロンがシナプス的に結合している確率が有意に増加します。この調製により、細胞タイプの同定が容易になり、ニューロンは天然の脳組織と同様のシナプス機能の形態と特性を維持します。ペア全細胞記録の主な利点は、細胞外軸索刺激を利用する他のより粗雑な技術では不可能な、シナプス伝達と可塑性の特性に関する非常に正確な情報を提供できることです。ペアの全細胞記録は、実行するのが難しすぎると認識されることがよくあります。この手法には難しい側面もありますが、特定のハードウェアと方法論の基準に従えば、全細胞パッチクランプのトレーニングを受けた人なら誰でもペア録音を行うことができます。シナプス結合ペアの記録を達成する確率は、健康な器官型スライスと安定したマイクロマニピュレーションにより、シナプス前およびシナプス後の全細胞記録の独立した達成を可能にすることで大幅に増加します。CA3-CA3錐体細胞ペアは、器官型スライス海馬調製物で最も広く使用されていますが、この技術はCA3-CA1ペアでも成功しており、同じスライス調製物でシナプス的に結合している任意のニューロンに適応させることができます。この原稿では、電気生理学が装備された任意の実験室でこの技術を確立するための詳細な方法論と要件を提供します。

概要

グルタミン酸受容体は、中枢神経系のシナプスにおける興奮性シナプス伝達の大部分を媒介する。シナプス後膜のスパインヘッドであるN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）に局在するイオンチャネル型グルタミン酸受容体の二つの主要なサブタイプおよびα-アミノ-3 - ヒドロキシ-5 - メチルイソオキサゾール-4 - プロピオン酸（AMPA）受容体。静止膜電位では、AMPA受容体がシナプス伝達の間にシナプス後電流の大部分を運ぶ。海馬では、NMDA受容体はシナプス後膜におけるAMPA受容体の数の変化を誘発するのに重要な役割を果たしている：「一致検出器」として作用することにより^1は 、シナプス強度¹の変更を開始するために、NMDA受容体はシナプスのメカニズムに関与してそれは細胞下レベルで学習と記憶を下支えすると考えられている。シナプス前伝達物質放出と平行してシナプス後ニューロンの脱分極に応答して、カルシウムは、NMDAを経由して入る受容体はAMPA受容体の挿入または取り外し^2を開始する。これらの受容体の動態は、シナプス可塑性の基礎となる：シナプス強度の低下が長期抑圧^4（LTD）である、シナプス強度の増大が、長期増強の^2,3（LTP）である。 NMDA受容体は、その誘導を制御すると考えられているつつAMPA受容体の移動は、シナプス可塑性の発現に関与すると考えられている。

シナプ....

プロトコル

動物倫理に関する声明：

この原稿に記載されているプロトコルは、オークランドとスタンフォード大学の大学によって確立された動物のケアのガイドラインに従ってください。 P7の仔ラットは、迅速な断頭により安楽死させた。海馬切開をその後直ちに以下に記載のように行われる。

1器官海馬スライス培養

1. 準備
   1. （脳を解剖するためにのみ使用）解剖培地を作製。 、5ミリリットルHEPES緩衝液、2ミリリットル1Mトリスストック液（pH7.2）（0.85％NaCl中各10,000単位）200ミリリットル最小必須培地、2ミリリットルのペニシリン - ストレプトマイシン溶液を組み合わせ、およびフィルターは、0.22μmのフィルターを用いて滅菌する。氷のように冷たい解剖培地中で海馬解剖を行ってください。
   2. 解剖媒体を冷却する。冷凍庫に液体が非常に寒いになるまで解剖を開始する前に約1時間を解剖メディアを配置します。大きな氷​​CRを許可しない形成するystals。必要になるまで氷上で保管してください。
   3. （海馬の解剖を除いてすべてのために使用される）培養液を準備します。 100ミリリットルの最小必須培地を組み合わせて、（1×濃度、液体）ハンクス塩/ W、L-グルタミン/ W、2ミリリットルのペニシリン - ストレプトマイシン溶液（0.85％NaCl中の液体、それぞれ1万台）、2.5ミリ....

結果

シナプス接続は記録電極を経由して脱分極電流パルス（20ミリ用、一般に20〜50 PA）を渡すことによって、活動電位を発射するために、シナプス前ニューロンを刺激することによって明らかである。シナプス後現在のトレースは、次にシナプス前活動電位（ 図3A）のピークの後に短い（<5ミリ秒）で一貫性の潜時で誘発単シナプスEPSCの有無を調べる。シナプス接続されたペアを得ることができる前に、ほとんどの実験では、複数のシナプス後ニューロンが試験される。全体的に、シナプス前CA3細胞の〜1/3がmonosynapticallyアクティブなシナプス結合（ 図3A）によってシナプス後CA3セルに結合され、CA3ニューロンの約20％は、すべてのサイレントシナプス結合^6,8によって接続されている。

ベースラインAMPA受容体媒介電流の振幅は、対になった記録内の試験からの裁判に可変であり、また、独立したパイの間赤の録音（ 図^3B）6,8。平均AMPAR EP.......

ディスカッション

ここでは、器官型海馬スライス培養物において成功対の全細胞記録を確立するための要件を記載している。対になった記録はまた、急性スライスおよび解離培養系^26,27を含む複数の調製物中で行うことができる。ここでの焦点は、シナプス可塑性（すなわちLTP及びLTD）の長い形の誘導になって、それが器官全体細胞記録をペアにことを強調することが重要であり、急性スライスと細胞調製が短い、量子的な大きさに重要な洞察を提供してきた解離したが-TERM可塑性、シナプス前機能のほか、LTPとLTD ^{2,4,8,26,27。}

器官型スライス方式の主な利点は、ニューロン間の接続性の増加である。急性スライス標本におけるシナプスの接続が原因スライス標本中の軸索の接続の切断に低い。われわれの経験では、シナプスconnecteから録音をペアリング急性スライス中のd CA3ニューロンは、取得したペアの録音のみ〜5％で可能であった。すなわち、対の録音の95％が未接続であった。代替案は、一次シナプス接続は²⁶かなり高い海馬培養解離使用することです。しかし、解離培.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Minimum Essential Medium			Stable電動マイクロマニピュレーター
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液			浅いティッシュバス
HEPES緩衝液			DICカメラ
1M トリス原液			アンプ
ハンクs Balanced Salt Solution			Computer
Horse Serum			防振テーブル
プラスチックコーティングされたミニチュアヘラ			直立顕微鏡
ソフトペイントブラシ			データ取得・分析ソフトウェア
手動ティッシュチョッパー			電極プーラー
#2 フィルターペーパー			ファラデーケージ
#5 鉗子
メンブレンインサート
CO2インキュベーター
解剖フード
クラスIIフード