三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

サマリー

細胞移動は、癌のような創傷治癒および免疫応答、および病態生理学的過程として、生理の茄多に関与している生物学的な現象である。 3次元コラーゲンマトリックス遊走アッセイは、3D生理的環境における内の異なる細胞型の遊走特性を分析するための多目的なツールである。

要約

移行する機能は、さまざまな細胞型の特徴であり、胚発生、創傷治癒、および免疫応答を含むいくつかの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。しかし、細胞遊走はまた、拡散、転移を開始するために、原発腫瘍から離脱するために、これらの癌細胞を有効癌における重要なメカニズムである。過去数年以内に、さまざまな細胞遊走アッセイは、異なる細胞型の移動挙動を分析するために開発されてきた。細胞の運動器官の挙動が顕著に2次元（2D）の間で異なり、3次元（3D）環境には、3D環境内に埋め込まれた細胞の遊走の分析は、より有意な細胞遊走をもたらすであろうと仮定することができるので、データ。記載された3Dコラーゲンマトリックス遊走アッセイの利点は、細胞が細胞外マトリックスの主要成分を表すコラーゲン繊維の生理3Dネットワーク内に埋め込まれていることである。のためにタイムラプスビデオ顕微鏡リアル細胞移動は、プロ遊走因子または阻害剤に応答して、複数の移行パラメータならびにそれらの変化の決定を可能に測定される。さまざまな細胞型、細胞、および腫瘍幹細胞、リンパ球/白血球を含む、この技術を用いて分析することができる。同様に、また、細胞クラスターまたはスフェロイドは、コラーゲン格子内細胞塊/スフェロイドからの単一細胞の移住の分析とコラーゲンマトリックス付随内に埋め込むことができた。私たちは、3次元コラーゲンマトリックス遊走アッセイは、生理状の3D環境内で細胞の移動を分析するための多様な方法であると結論する。

概要

細胞融合（概要については^1,2を参照）細胞移動は、胚発生、創傷治癒および免疫応答（レビューのために^3を参照）などの生理学的プロセスの過多に関与している他の生物学的な現象であるように。しかし、移行する機能は、腫瘍細胞が（レビューのために^3,4を参照）転移するための前提条件でもある。

細胞遊走は、さまざまなリガンド（ 例えば 、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ホルモン、細胞外マトリックス成 ​​分）受容体（ 例えば 、受容体チロシンキナーゼによって開始され、いくつかのシグナル伝達経路の相互作用によって導かれる複雑な、まだ完全に理解されていないプロセスであり、ケモカイン受容体、インテグリン）、最終的に脱^{6シグナリング}焦点接着複合体及びインテグリン媒介の再組み立てとアクチン細胞骨格に付随の再編成を引き起こす相互作用^5。

インビトロおよびインビボの細胞遊走アッセイにおけるいくつかの細胞遊走を分析するときはs = "jove_contentは">ボイデンチャンバー/トランスウェルアッセイ^7、アッセイ^8-10治癒スクラッチアッセイ/創傷、三次元（含む、過去数十年の間に開発されている3D）コラーゲンマトリックス遊走アッセイ¹¹だけでなく、生体内イメージング/顕微鏡法（レビューのために^12を参照）。これらの細胞遊走アッセイは、それぞれ長所と短所など 、関連コスト及び設備の必要性や操作、得られたデータの信頼性を有する。

Boydenチャンバー/トランスウェルアッセイおよびスクラッチアッセイ/創傷治癒アッセイ双方は、 インビトロ ^7-10 で細胞遊走を測定するための簡単、低コスト、よく発達したアッセイである。いわゆる上部コンパートメント⁷ -ボイデンチャンバー/トランスウェルアッセイでは、細胞を、細孔（直径約8μm）を含むインサートの上に播種する。任意に、インサートは、細胞外メートルで被覆することができATRIXの成分、 例えば 、フィブロネクチン、コラーゲンなどが 、より生理的環境を模倣する。同様に、内皮細胞は、それによって内皮細胞障壁^13を模倣し、インサートの上に成長させることができた。そのような成長因子及びケモカインなどのメディアやサプリメントを保有下部コンパートメントに定義された時間間隔の間に細孔を通過した細胞は、細胞移動（または溢出）を定量化するために読み出しとして使用される。

スクラッチアッセイに/創傷治癒アッセイ細胞をプレートに播種し、集密度¹⁰まで増殖させる。実験設定プレートに依存してフィブロネクチンのような細胞外マトリックス成分で予め被覆することができる。スクラッチの各側面から細胞単層単一細胞を掻き取ることにより巻き取らキズ/作成した後/傷は、それによって¹⁰ヒーリング/充填、隙間に移行することができます。スクラッチ/傷の両側の間の距離が決定される時間に依存して、細胞¹⁰の移動活性のための読み出しとして使用される。しかし、タイムラプスビデオ顕微鏡、単一細胞が^10を追跡してアッセイを組み合わせることをお勧めしますし、細胞移動（スクラッチ/創傷の充填/治癒につながる可能性がある）、細胞増殖を区別します。

しかし、Boydenチャンバー/トランスウェルアッセイおよびアッセイ治癒スクラッチアッセイ/創傷の両方が、生理的に似た細胞環境に関するむしろ不完全である。スクラッチアッセイ/創傷治癒アッセイで細胞を二次元の予備被覆プラスチックプレートに播種されているのに対し、ボイデンチャンバー/トランスウェルアッセイでは細胞は、プラスチック製の細孔を通って移動しなければならない。同様に、ウェル遊走挙動が二次元と三次元環境³との間で顕著に異なることが認識されている。例えば、線維芽細胞の三次元マトリックス接着は、2つに焦点を特徴と線維性癒着異なるα5β1およびαVβ3インテグリン、パキシリン、他の細胞骨格成分、および焦点接着キナーゼ¹⁴のチロシンリン酸化の含量での次元の基板。同様に、3D環境内に埋め込 ​​まれた細胞は、改変された回遊行動^15を示した。このように、より正確に細胞遊走を分析する遊走アッセイは、3D生理学的または生理的に似た環境の中で、単一の細胞の移動を測定することができますお勧めします。

生体内イメージング/顕微鏡は、3D生理学的文脈の中で細胞移動を測定するためのゴールドスタンダードです。これは、現在までに、起因して可能なだけでなく、そのようなリンパ節^17、内管外遊¹⁶またはリンパ球輸送中の腫瘍細胞および内皮細胞などの異なる細胞型間の相互作用、細胞外マトリックス-細胞相互作用に属していないこのような2光子などの改善された蛍光顕微鏡技術、共焦点レーザー走査顕微鏡検査、バイタル蛍光染料及び蛍光タンパク質誘導体の^12,16,17を発現するトランスジェニックマウス株の使用。また、/顕微鏡生体内イメージングは、手動および自動細胞追跡¹⁸と組み合わせることができる。しかし、2光子共焦点レーザー走査顕微鏡を必要とするだけでなく、動物（および適切なトランスジェニック動物モデル）の生体内イメージング/顕微鏡検査は、かなりコストのかかる技術である。

Boydenチャンバー/トランスウェルアッセイおよびスクラッチアッセイ/創傷治癒アッセイの限界を克服するために、3次元コラーゲンマトリックス遊走アッセイは^11,19を開発した3D環境内の異なる細胞型の遊走を分析する。これにより、移動している細胞は、3Dコラーゲン線維ネットワーク、in vivoの状況により似ている内に埋め込 ​​まれている。相まって、タイムラプスビデオ顕微鏡実際の細胞移動に起因するがdetermiが可能測定され、いくつかの移行パラメータだけでなく、プロの渡り鳥因子または阻害剤に応答したその変化の国家。さまざまな細胞型は、リンパ球および白血球^11,20、造血幹/前駆細胞が^21〜24、および腫瘍細胞^5,25-29含め、この技術を用いて分析することができる。単一細胞に加えて、細胞クラスターまたはスフェロイドは、コラーゲン格子^30,31への細胞のクラスター/スフェロイドからの単一細胞の移住の分析とコラーゲンマトリックス付随内に埋め込 ​​むことができた。

in vivoの状況に近い結果にもたらすインビトロの方法-このプロトコルは、3D環境内の異なる細胞型の回遊行動を分析するための簡単な、しかし強力な技術についての概要を説明します。

プロトコル

移行チェンバースの調製

1. 混合物が溶融するまでミックスと熱：パラフィンワックス/石油ゼリー（1 1）を準備します。ペイントブラシを用いて、パラフィンワックス/石油ゼリーの2-3層描く（1：1）を図1B〜1Dに従ったガラススライドの中央に混ぜる。
   注：私たちは、共通のガラススライドを使用している（76×26×1.0〜1.5ミリメートル（W / D / H））
2. 描きながら凝固を避けるために、スライドガラス上に急速に融解したパラフィンワックス/石油ゼリーミックスを適用します。パラフィンワックス/石油ゼリー層は、長さが約2〜2.5センチメートル、幅0.3〜0.5センチメートルであることを確認してください。パラフィンワックス/石油ゼリー層の厚さは約0.1〜0.15センチメートルにする必要があります。
3. 固化したパラフィンワックス/石油ゼリーミックスにカバースリップを追加し、二から三層ワックス/石油ゼリーミックスパラフィン（ 図1E、1F）でそれを封印。一般的な細胞遊走実験に4-8マイグレーションチャンバーを使用してください。移行チャンバiを置きますラックに直立位置がn。

コラーゲン懸濁細胞ミックスの調製

1. 収穫（ 例えば 、0.25％トリプシン/ EDTAを含む）と目的の細胞を数える。ウシ胎児血清（FCS）を含む培地、抗生物質、推奨サプリメント完全に細胞を再懸濁。 4-8 1.5ミリリットルの反応管と4-6×10 ^4個の細胞を（細胞の総数を分析する細胞型に依存します）を含む20μlの細胞懸濁液を準備し、完全培地で50μlに埋める。
   注：追加の化合物（ 例えば 、成長因子、ケモカイン、阻害剤等 ） を細胞懸濁液に添加する。細胞懸濁液の最終容量は50μLを超えないように、適切なストック溶液を使用する。
2. 4つの細胞遊走実験のために452μlの最終的なコラーゲン懸濁液の総量を準備します。 50μlの10倍MEM（pHは5.1から5.5）および7.5％炭酸水素ナトリウム溶液の27μlの液（pH 9.0〜9.5を追加します。）1.5ミリリットルの反応チューブへと完全に混合する。強烈な紫色の液（pH 9.0〜9.5）に黄橙色から溶液の色ターンを観察します。 10倍MEM /重炭酸ナトリウム溶液に375μlの液体コラーゲン懸濁液を加え、完全に混合する。最終的なコラーゲン懸濁液のpHは約7.5であるべきである（光紫色で示​​されている）。
   注：7.5％重炭酸ナトリウム溶液のpHをチェックしてください。 pHは、CO ₂で飽和させ、（ - 9.5〜約9.0）のpHを増加させるインキュベーター内で開いた蓋（37°C、5％CO _2）で約7.5場所炭酸水素ナトリウム溶液である場合。コラーゲン懸濁液の細胞混合物のpHは、コラーゲン網の安定性のために重要である。それが低すぎると、コラーゲンラティスは、細胞遊走実験の間に崩壊する。
   注：このプロトコルでは、ウシの後肢から液体コラーゲン液（pH 1.9から2.2）を使用します（2.9から3.3 mg / mlのコラーゲンを95％のコラーゲンI型、5％のIV型コラーゲン）。使用してさらにコラーゲン格子調製プロトコルの例そのようなブタやラットなどの他のソースからのコラーゲンタイプIは^、32,33に記載されている。これは1.67ミリグラム/格子の中の究極のコラーゲン濃度を変化させるように使用される溶液のボリュームを変更しないでください。より高いまたはより低いコラーゲン濃度は、コラーゲン繊維の密度及び細胞遊走挙動³⁴に付随し、それらの間の平均距離に影響を与える。
3. 50μlの細胞懸濁液に最終コラーゲン懸濁液100μlを加え、thoroughly.The最終コラーゲン懸濁液（1.67 mg / mlのコラーゲンは）わずかに粘性で混ぜる。正確な量（100μl）を転送するには、細胞懸濁液にそれを転送する前に、一度上下に最終的なコラーゲン溶液をピペット。
   NOTE：コラーゲン懸濁細胞ミックスをpH値が7.5に変更された10×MEM /重炭酸ナトリウム溶液と合わせられるとコラーゲン繊維を直ちに重合を開始する。
4. 目から最終的なコラーゲン懸濁液の細胞ミックスを転送する移行チャンバに電子反応チューブ。静かに均等に遊走チャンバー（ 図1H）の底部にコラーゲン懸濁液細胞ミックスを配布する遊走チャンバーをタップします。ラックに直立位置に移動室を置き、約30分間インキュベートする（37℃、5％CO _2）コラーゲン線維の重合を可能にする。
5. 重合されたコラーゲン格子がわずかに濁っまだ薄紫色であることに注意してください。関心のあるサプリメントで完全培地または完全培地での移行室を記入し、パラフィンワックス/石油ゼリーミックス（ 図1I、1J）と遊走チャンバーを密閉する ​​。

3。細胞移動の記録と解析

このセクションでは、手動の細胞追跡によるタイムラプスビデオ顕微鏡および細胞遊走の分析によって細胞移動の記録を記載している。

1. 顕微鏡と顕微鏡ステージょんのスイッチを入れター。 37℃に温度を調整します。 10倍対物レンズを使用してください。顕微鏡下で遊走チャンバーを配置し、視野内の約50の細胞または複数の焦点を合わせる。
2. マルチカメラビデオ監視ソフトウェアアプリケーションを使用して、タイムラプスモードのレコード細胞遊走。 たとえば 、適切な形式で細胞移動ムービーを保存して、 "*。aviファイル」や「a *のMOV」。このような細胞の種類や実験条件などの情報をサポート含むデータベースへの細胞移動のムービーファイルをリンクします。
   注：私たちはタイムラプス0.75秒、リアルタイムで1分に等しいことを意味1:80の経時係数を使用して、最大2時間、リンパ球およびHSPCsを記録している。腫瘍細胞は、動きの遅い細胞で​​あり、したがって、1の経時的ファクター使用して、少なくとも16時間が記録されています。1,800（タイムラプスにおいて0.5秒、リアルタイムで15分に等しい）。
3. ImageJソフトウェアプラグインと同様に、適切な細胞追跡ソフトウェアアプリケーションを使用して、細胞移動の映画を分析する（概要は¹⁸に示されている）。公平な分析のために、細胞は、ランダムに細胞が遊走アクティブであるかどうか知らないうちに選択されることが決定的に重要である。
   注：私たちは、手動で（核に位置している）マウスカーソルを正確に移動する細胞に従うことによって、実験あたり少なくとも30個の細胞の経路を追跡するために、自社開発のソフトウェアアプリケーションを使用しています。追跡しながら、追跡セルのxy座標が自動的に使用タイムラプスモードに応じて決定される。腫瘍細胞についてのxy座標を（15分リアルタイムに等しい）各0.5秒決定されるのに対し、リンパ球について/ HSPCsのxy座標は、（1分リアルタイムに等しい）各0.75秒で決定される。
4. 典型的な細胞遊走実験のため、細胞あたり60のxy座標の合計を決定します。これは、腫瘍細胞に対するリンパ球/ HSPCsおよび15時間、リアルタイムで1時間リアルタイムに等しい。 A "、"セルはtwの間で移動していないことを示しO時点、「数値」のに対し、「画素」セルが2の時点（ 図2A）との間で移動した距離を示している。
   注：手動細胞追跡は経験が必要です。特に、高速移動する細胞を追跡するのが困難であり、各細胞型の展示を補充因子によって誘発され得る別個の遊走挙動。追跡しながら、細胞分裂の場合には、ランダムに追跡を継続するための1つの娘細胞を選択します。視界フィールドから移動またはトラッキングしながら、死ぬ細胞が無視されていませんが、分析のために考慮される。

4。データ解析

1. 適切なソフトウェアアプリケーション、 例えば表計算プログラムを使用して、細胞追跡データを分析する。
   1. 自己設計されたスプレッドシートのテンプレートに、（ 図2A）、生データを追跡するセルをコピーすることによって、細胞トラッキングデータを分析します。代表、「数値を "の合計を掛け総距離は、セルを「程度」に「ピクセル」を変換するための補正係数を移行しました。
   2. 運動器官の活性（移動速度に相当する）と、アクティブな動き（ 図2C、2D）の時間：2細胞移動パラメータを決定します。
   3. 非移動細胞など（偽陽性細胞の数を減らすために、閾値レベル）より小さい25μm以下に移動した細胞を識別します。 」「これらの細胞の「数値」に置き換えます。
      注：パラメータ「運動器官の活性」（又は移動速度）は、二つの時点（ 図2D）との間で移動した追跡された細胞集団の細胞の割合を表す。 」、「非移動細胞として定義されるのに対し、「数値」は、移動する細胞として定義される。パラメータ「活発な動きの時間」（時間アクティブ）は、細胞が再に移行した合計時間の割合を示し観察期間（ 図2C）の時間枠に設置と。 「数値」は、「、」は、細胞が移動していないことを示し、一方、細胞は、移動したことを示している。このパラメータはさらに移動していない細胞の数を決定するために使用される。
2. 統計的有意性を計算し、細胞移動データを表示する。
   1. マン·ホイットニーU検定を用いて細胞（移動速度）の平均運動器官の活性の統計的有意性を計算する。有意とp値<0.05を考えてみましょう。
   2. のxy図として細胞の平均運動器官の活動を表示し、箱ひげ図、またはバーチャート図など。棒グラフ図として、またはヒストグラムとして、そのような活発な動きや速度の時間のような単一の細胞ベースのデータを表示する。
      注：選択された表計算ソフトウェアアプリケーションは箱ひげ図やヒストグラムチャートツールが含まれていない場合は、オンライン検索は、適切なTUを探しているために実行する必要がありますtorials。

結果

タイムラプスビデオ顕微鏡およびコンピュータ支援細胞トラッキングと組み合わせた使用の3D-コラーゲンマトリックス遊走アッセイは、集団ベースのパラメータ（ 例えば 、運動器官の活動を意味する）と、単一のセルベースのパラメータの両方を含むさまざまな細胞移動のパラメータの決定を可能にする（ 例えば 、活性運動の時間、速度、距離、移行）。得られた細胞追跡データセット、データ処理及びデータ提示の例を図2に示す。データファイルを追跡するセルがテーブル（ 図2A）に類似している。細胞遊走実験あたり30細胞が追跡させ、それぞれの列は、1追跡セルの略です。行は、セルが2時点の間で移動したか否かの情報を含んでいる。 「画素」は、細胞における距離を表す「数値」の合計二つの時点の間で移動し、このセルが移動した総距離である。これは、交流を乗じて「程度」へ「ピクセル」を変換するためのorrection要因。より小さい25μm以下に遊走した細胞は、偽陽性細胞の数を減らすために、非移動細胞として定義される。各セルの速度（ミクロン/分）を「観察期間の合計時間（分）」と「...

ディスカッション

移行する能力は、腫瘍細胞⁴の特徴である。原発腫瘍から剥離すると、周囲の結合組織の腫瘍細胞を通って移動する能力がなければ、ほぼすべての癌患者の死亡の主要な原因である二次病変を、シードすることはできません。このため、関係のため、多くの研究は、癌細胞の移動に焦点を当てている。これらの研究の目的は、効率良く転移形成を損なうまたは減速、腫瘍細胞の移動を遮断する新規の標的分子と標的経路の同定である。そのような努力の例は、転移性、インビトロおよびインビボ ³⁶ に乳癌細胞の広がりおよびトリプルネガティブ乳がんを有する患者において改善された無再発生存と関連しているどのを阻害することが示されている、遮断薬、βかもしれない癌細胞^37。私たちは最近、spontaneに由来するハイブリッド細胞を、実証したヒト乳房上皮細胞株およびヒト乳癌細胞株ではなく、親細胞との間のOU融合事象は、増加した遊走活性²⁶と、ケモカインCCL21に応答した。 CCL21は、細胞融合は、腫瘍（ハイブリッド）細胞が転移特性^39,40を<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ライカ DM IL 倒立顕微鏡	ライカ、ヴェッツラー、ドイツ
顕微鏡 ステージヒーター	Distelkamp Electronic、カイザースラウテルン、ドイツ
JVC C1431 ビデオカメラ	JVC、バート・ヴィルベル、ドイツ
Axis 241Q ビデオサーバー	Axis communication GmbH、イスマニング、ドイツ
Mac G5 コンピュータ	アップルマッキントッシュ
iMac	アップル マッキントッシュ FileMaker
Pro	FileMaker GmbH, Unterschleißハイム、ドイツ
マルチカメラビデオ監視ソフトウェア(セキュリティスパイ)	Bensoftware、ロンドン、英国
ランタイムレボリューションメディア 2.9.0	RunRev Ltd.、エジンバラ、英国
Paraffin	Applichem GmbH、ダルムシュタット、ドイツ	A4264
ワセリン	地元のドラッグストア
Purecol(液体コラーゲン)	Nutacon BV、Leimuiden、オランダ		2.9 - 3.3 mg / mlの牛コラーゲンが含まれています(95%コラーゲンI型、5%コラーゲンIV型)
10x MEM	Sigma Aldrich、タウフキルヒェン、ドイツ	M0275
7.5%重炭酸ナトリウム溶液	Sigma Aldrich、タウフキルヒェン、ドイツ	S8761
EGF	Sigma Aldrich、タウフキルヒェン、ドイツ	E9644
U73122	メルクミリポア、ダルムシュタット、ドイツ	662035	最初にCHCl3に溶解し、使用直前にDMSOに再構成します