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方法論記事

トラッキングアナスタシス、アポトーシスを逆に細胞生存現象のための戦略

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DOI:

10.3791/51964

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2015年2月16日

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1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Center for Cell Dynamics, Department of Biological Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine

この記事について

サマリー

アナスタシスという用語は、死にかけている細胞が細胞の自殺プロセスを後期段階で逆転させ、自分自身を修復し、最終的に生き残る現象を指します。ここでは、アナスタシスを受ける細胞を検出および追跡するためのプロトコルを示します。

要約

アナスタシス（「生活に上昇する」ためのギリシャ語）は、死細胞の回復を指します。これらの細胞が回復する前に、それらはミトコンドリアの断片化、細胞質ゾルへのミトコンドリアのチトクロームc の放出、カスパーゼの活性化、クロマチン凝縮、DNA損傷、核の断片化、原形質膜小疱形成、細胞収縮、細胞表面の曝露を含む、アポトーシスの重要なチェックポイントを通過したホスファチジルセリン、およびアポトーシス体の形成。アポトーシス刺激、それによって瀕死細胞がアポトーシスと潜在的に他の死のメカニズムを逆にすることができ、死の前に削除されたときアナスタシスが発生する可能性があります。したがって、アナスタシスも不適切に損傷した細胞を維持することができ、生理的治癒過程を含むようである。アナスタシスの機能とメカニズムは明らかに健康な細胞を回収した後、過去のイベントを検出するための限られたツールによって部分的に妨げられて、まだ不明である。 anastaを検出するための戦略SISはアナスタシスを変調するために生理学的メカニズムの研究、疾患の病状でアンデッドの細胞の危険性、および潜在的な治療が可能になります。ここでは、生細胞顕微鏡および哺乳動物細胞でアナスタシスを特定し、追跡するための哺乳類のカスパーゼバイオセンサーを使用して効果的な戦略について説明します。

概要

アポトーシス（「死に立ち"のギリシャ語）は、一般的に細胞自殺1-7で終わる一方向のプロセスであると仮定される。すでにアポトーシス経路8,9を開始した細胞を含むそれ以外の動物全体で死んでしまう余分な細胞の生存率のプロ死遺伝子結果の遺伝子破壊。同様に、遺伝子操作は、人工的に表示される信号を「私を食べる」、またはそれは、それらの細胞外マトリックスへの接着性を失い、健康、哺乳動物細胞は、細胞全体の食作用またはentosis、それぞれ10,11による死を免れることができます。しかし、その他の遺伝子操作することなく、正常な健康な哺乳動物細胞および細胞株は、アポトーシス12-15の初期段階から回復することができることを示している。細胞はその典型的な重要なチェックポイントに合格した後に個々の細胞を追跡するためのツールを使用して、我々はさらに、アポトーシス12,13の後期段階からの回復を実証しているLY 2-6「ノーリターンのポイント」をマークします。後期アポトーシスのこれらのチェックポイントは、ミトコンドリアのシトクロムc の放出、カスパーゼの活性化、核の断片化、およびアポトーシス体の形成が含まれる。我々は、細胞死2-6の瀬戸際でアポトーシスのこの逆転を記述するために、「生活に上昇」を意味し、ギリシャ語の複合語「アナスタシス」を採用した。

全体瀕死回復プロセスは、ライブセルイメージングによって観察されていない限り、それはアポトーシス事象を経験したことのない細胞からアナスタシスを受けた細胞を区別するために挑戦している。仕事の数十年は、アポトーシスによる細胞自殺の形態学的特徴は進化的に保存され、生化学的および分子事象16〜19によって駆動されることを明らかにした。これらのイベントは、損傷またはdを排除することにより、単細胞と多細胞生物の発達とhomoeostaticプロセスを調節するために細胞の自己破壊を促進するangerous細胞16-19。アポトーシス細胞は、容易に標準化された形態学的に、アポトーシス1,5,6,16,20の生化学的および分子症状によって区別することができるが、現在アナスタシス12,13に固有の既知のマーカーは存在しない。重要なことは、アナスタシスを受けた細胞は、正常な健康な細胞、およびだけアポトーシスを逆転開始細胞として表示され、アポトーシス死細胞12,13のように見える。このように、新しいツールが与えられた生存細胞は、以前にアクティブなアポトーシス過程を経験したことを確実に締結することが必要である。

それが迅速かつ大規模な破壊プロセスであるため、アポトーシスは、一般的に不可逆的なカスケードとして想定されます。ミトコンドリアは、細胞質ゾル21,22へのシトクロム cなどのアポトーシス誘発要因をリリースした後、いくつかの細胞は、アポトーシスを開始することが日に数分かかることがありますが、カスパーゼは、5分23,24内で活性化細胞質が続くことができるとその後すぐに10分25〜27、及び細胞死内の核凝縮25-27。活性化カスパーゼはそのようなエンドヌクレアーゼ阻害剤DFF45 / ICAD 29,30などの細胞解体2,28、の目的のために重要な構造と機能部品を切断し、不活性化することによりアポトーシスを調整する。カスパーゼはまた、 シトクロム c 31,32のミトコンドリアの放出を促進するために、ミトコンドリアに移行し、BCL-2ファミリーメンバーBID、などのプロアポトーシス因子を活性化する。カスパーゼ活性はまた、貪食33を介してマクロファージまたは隣接セルによる死細胞の貪食を促進するための「私を食べる」信号としてホスファチジルセリンの細胞表面露出をもたらす。さらに、アポトーシス事象は、細胞の生体エネルギーと代謝34,35,36を破壊し 、ミトコンドリアが機能不全にレンダリング。したがって、このような破壊からの回復は、直感的には考えにくい。

オリジナルとは逆に期待管理ポイント、細胞がさえ後期アポトーシス細胞死の過程を逆にすることができます。連続的に培養物中の死細胞の運命をモニターすることにより、我々は、初代細胞および細胞株12,13の範囲内の後期アポトーシスの可逆性を観察した。死刺激の除去は、このようなミトコンドリアの断片化、クロマチン凝縮、DNA損傷、原形質膜小疱形成、ホスファチジルセリンの細胞表面露出、ミトコンドリアのチトクロームc の放出、カスパーゼ活性化、核の断片化、細胞収縮のようなアポトーシスの明白な特徴からの回復を可能にしたとアポトーシス体の形成。これらの観​​察は、アナスタシスの機能、結果、およびメカニズムに関する未回答の質問を上げる。これらの質問に対処するために、前提条件は、確実にアナスタシスを受けた細胞を同定することである。ここでは、以前に後期アポトーシスおよび第反転した細胞を検出するためのライブ顕微鏡法およびカスパーゼバイオセンサーを記載ENが生き残った。

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プロトコル

生細胞イメージングのための細胞の調製

  1. 形態学的変化の検出を容易にするために、このような優れた原形質膜および細胞内小器官の変化を視覚化するために、基板上に平坦であるHeLa細胞（ヒト子宮頸癌）細胞などの接着細胞を選択する。
    アポトーシスの逆転は、初代マウス肝細胞、初代マウスマクロファージ、初代ラット心筋細胞を含む様々な哺乳動物細胞12,13において観察され、また、ヒト胚腎臓HEK-293T細胞のようなラインをセルされた、アフリカミドリザル腎上皮COS：注意-7細胞は、マウス心筋HL-1細胞、マウスNIH 3T3線維芽細胞、フェレット（Mustelaのはフロputoris）脳CRL1656細胞、ヒト皮膚癌A375細胞、ヒト精巣癌CRL1973細胞、ヒト小細胞肺癌H446細胞、ヒト肝癌HepG2細胞、ヒト乳癌MCF7細胞、ヒト前立腺癌PC3細胞、及びヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞。
  2. 洗浄及び殺菌のための無水エタノールでガラス底細胞培養皿の前洗浄ガラスカバースリップ。
    注1：ガラスボトムディッシュの使用は、高品質の微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡検査、および高倍率共焦点またはエピ蛍光顕微鏡（議論を参照）をお勧めします。
    注2：高倍率の場合（40X、60 / 63Xまたは100Xの目的と高開口数1.3または1.4）、シンナーガラスボトム（厚さ0.085〜0.16ミリメートル）と細胞培養皿の使用は、イメージングのための長い作動距離を提供しています（プロトコル3を参照してください）。
  3. 細胞型に応じて、ガラス底培養皿は、ポリ-d-リシン（0.1 mg / ml）で、コラーゲン（0.01 M酢酸中の0.01％溶液）、および/またはフィブロネクチン（5μg/ ml）を播種の前に有するコーティングを必要とすることが細胞。
    注：コーティング剤の種類及び濃度の最適化は、異なる細胞株に必要とされる。 HeLa細胞は、コーティングなしのガラスに直接接着することができる。しかし、いくつかの細胞のsuマウス心筋HL-1細胞のようなCH、ガラス表面に直接接着するが、具体的な文化やコーティングのプロトコル37を必要とすることはできません。
  4. 種子は、〜35ミリメートルプレコーティングされたガラス底細胞培養皿上で2-3×10 5細胞を80％の集密度を達成するための日、5％CO 2（℃）37摂氏温度でインキュベートする。
    注1：細胞密度、培養時間、および培養条件の最適条件は、細胞型に依存して変化し得る。細胞集密度は、細胞のアポトーシス応答を（プロトコル2を参照してください）​​影響を与えることができます。高集密度で、細胞をアポトーシス刺激の同じ濃度にあまり敏感である可能性があります。
    注2：高細胞密度は、個々の細胞とその細胞小器官の形態変化を不明瞭にすることができますように、コンフルエント細胞を上にしないでください。

2.アプリケーションおよびアポトーシス細胞刺激の除去

  1. 使用直前に、37℃の細胞培養培地でのアポトーシス誘導剤をプレミックス。エタノール（3.6から4.5％の体積/体積）は、本デモではアポトーシス誘導を務めた。
    注1：当社の公表と未発表データは、細胞はまた、ジメチルスルホキシド（DMSO、24時間8％容量/容量）、のためのスタウロスポリン（STS、0.5μMとして、他のアポトーシス刺激12,13によってトリガーされるアポトーシスを逆にすることができますことを実証1時間）、およびタキソール（12時間1μM）。アポトーシスを誘発するための投与量の最適化は、アポトーシスを受けるように集団中の細胞の大部分をトリガすることができる最小の投与量を達成するために、細胞の異なる種類のために必要とされる。
    注2：細胞培養​​培地とプレミキシングアポトーシス誘導剤、アポトーシス刺激に対する細胞の不均一な曝露を避けることが重要である。
  2. 画像ベースライン形態を確立するためのアポトーシス誘導剤を適用する前に、細胞培養皿で健康細胞群。
  3. 細胞培養皿から元の培地を除去し、その後に皿に予混合アポトーシス誘導剤の2ミリリットルを適用アポトーシスを受けるように細胞を誘発する。 5％CO 2（または他の通常の培養条件）で、37℃で細胞をインキュベートする。
  4. インキュベーション後、アポトーシスの特徴の進行をモニターするために、光、エピ蛍光または共焦点顕微鏡により細胞を観察する。
    注1：アポトーシスを受けている細胞は、顕微鏡および蛍光ベースのバイオセンサによって検出することができ、アポトーシスの形態的、生化学的および分子的特徴を表示する（参照プロトコル3および4）。
    注2：異なるアポトーシス誘導物質と細胞のインキュベーション時間は、細胞型（例えば、密集度および栄養状態など）、細胞条件、及び適用死刺激の投与量に依存して変化する。慎重な滴定が必要な場合があります。
  5. 細胞がアポトーシスの特徴を表示すると、温かい（37℃、または他の通常の培養温度）新鮮な細胞培養培地で細胞を1回洗浄することにより、アポトーシス誘導剤を除去する。
    注1：アポトーシス細胞はもっと緩く上で接続されているとおり培養プレートは、それが適用されると、細胞が洗い流されないように静かに培地を除去することが重要である。
    注2：ライブ懸濁した細胞を穏やかに遠心分離（160×gで1分間）によって上清から回収し、バック培養皿に添加することができる。
  6. 2ミリリットル/ 5％CO 2中で新鮮な細胞培養培地の35mm皿で37℃で細胞をインキュベートする。あるいは、使用条件培地（健康な細胞から採取した細胞を含まない培養培地）は、さらに、アポトーシス細胞の生存を増強する。
    注：洗浄し、新鮮な培地でインキュベートした細胞は、細胞の大部分はエタノール曝露後12,13エタノール誘発性アポトーシスを逆転することを可能にする。しかし、細胞は他のアポトーシス刺激にさらされているときに、この洗浄工程が必要な場合があり、繰り返し（説明を参照してください）​​。

3.生細胞顕微鏡

  1. 私たちは、37℃（環境制御反転し、共焦点またはエピ蛍光顕微鏡を使用することをお勧め生細胞の顕微鏡検査のため、5％CO 2）。
    注：これは、細胞が水浸漬対物直立顕微鏡を用いて画像にすることも可能である。画像セルに培養培地中に直接目的を浸し。しかし、細胞は、フォーカシング時浸漬対物レンズによって破砕することができる。
  2. 予め温めて（例えば、環境制御室、ステージインキュベーター、対物ヒーターなど）顕微鏡イメージングの前に少なくとも2時間である。
    注：これは、フォーカスとxy平面のシフトのドリフトを避けることができるように、顕微鏡の部品により構成部品の熱膨張及び収縮、熱平衡に達することを可能にする。
  3. 培養細胞を35mmガラスボトムディッシュを置き、倒立顕微鏡のステージ上に（プロトコル1を参照）からの細胞をイメージングするための開口数（NA）1.3または1.4で40Xまたは63Xプラン - アポクロマート対物レンズを用いて細胞画像を取り込むカバーガラスを通して皿の底。
    注意：メディアの2以上の溶液を適用することは避けてください媒体の重量が同じ焦点面に画像が困難細胞のフィールドを作り、ガラス底部の曲率を引き起こす可能性としての35mmガラスボトムディッシュに。
  4. 全体の画像化プロセスの間に、37℃または対応する常温で細胞を維持する。
    注：アポトーシスのプロセス、およびアポトーシスの可能性が高い逆転は、温度に敏感な酵素活性に依存します。したがって、（顕微鏡ステージトップインキュベーターで例えば ）37℃で細胞を維持することが実験を通して重要である。減少温度はアポトーシス刺激を除去した後にアポトーシス応答と回復のレスポンスが遅くなる可能性があります。
  5. 湿度·デバイスを使用するか、メディアからの蒸発による水の損失を減らすために培養皿上（材料を参照）は、透明ホイルを敷く。
    注：ホイルは、DIC顕微鏡用の光の極性を破壊する可能性があります。光路の偏光板を調整することにより、極性を復元します。
  6. でpHを維持顕微鏡上の環境制御室で5％CO 2でインキュベートすることにより細胞培養培地（pHは6.8 -7.3）。
    注：メンテナンス培地のpHはまた、（材料を参照）HEPES緩衝液を添加することにより、または商業CO 2非依存培地を使用することによって達成することができる。最適条件は、細胞型に依存して変化し得る。
  7. 細胞/細胞内構造または発現バイオセンサ（プロトコル4で詳細）の高品質画像を得るために必要な最低の蛍光強度を減少させることによって光毒性を避けるために、画像形成プロセスの間に細胞の蛍光/レーザー（励起光強度）の曝露を最小限。

中およびアポトーシスのイベントの後の検出と追跡アナスタシス4.戦略

  1. 原形質膜小疱形成、細胞質の凝縮、細胞収縮及びアポトーシス小体の形成（ 図1Aを参照してください- C、E）。
    1. タイムラプス生細胞diffeを実行しますrential干渉コントラスト（DIC）または位相差顕微鏡健康セルのグループを追跡し、（生細胞顕微鏡検査のためのプロトコル3を参照してください、との説明を参照）、その細胞形態を観察する。
      注1：セルに光毒性を避けるために、DIC /位相契約イメージングのための光源の強度を減らします。
      注2：DIC及び位相差顕微鏡を使用できない場合は、共焦点または落射蛍光顕微鏡法のための生細胞の形態を概説すると、細胞形態をモニタするために、細胞質ゾルの染色にCellTrackerを使用する。
    2. （アプリケーションおよびアポトーシス刺激の除去のためのプロトコル2を参照）アポトーシスを受けるように細胞を誘発する細胞死刺激を適用する。
    3. そのような細胞膜小疱形成、細胞質の凝縮、細胞収縮およびアポトーシス体形成（ 図1A、1B、1C、1E）として、アポトーシスの形態学的特徴のために処理した細胞を観察します。
    4. 新鮮な培地を細胞と死の刺激、および再供給細胞を洗い流すdisplaアポトーシスのyの形態学的特徴。
      注1：細胞死刺激を適用または灌流細胞培養チャンバーを使用することによって達成することができるタイムラプス生細胞イメージングの間、顕微鏡ステージ上の細胞培養培地を変え、または慎重に触れずにピペッティングして細胞培養皿上で直接実行することができる撮像間隔中皿。
      注2：使用フォーカスドリフト補償システム（議論を参照）細胞培養培地を変更した後顕微鏡システムの熱平衡の損失による細胞の焦点が合っていないようにする。
    5. 連続タイムラプスイメージングは​​、アポトーシスの特徴を示す細胞の運命を追跡する。アポトーシスを逆細胞が損傷を修復し、正常なフラット形態（ 図1A、1B、1C、1E）を取り戻すことができる。
  2. ミトコンドリアの断片化、DNA /クロマチン凝縮、核断片化（ 図1D、1F、1Gを参照してください）。
    1. mitochondを可視化リアス、50nMののMitoTracker赤/深赤色/緑色蛍光色素で染色細胞と同時に、5％CO 2、37℃で20分間、培養培地中のヘキスト33342青色核染料を10μg/ mlの核を染色する。
      注1：細胞毒性を回避したときに必要性バックグラウンド蛍光を減少させるために染料およびインキュベーションの期間の濃度を低下させる。染色のための染料およびインキュベーション時間の最小量のノイズ比に対する良好な信号を得るために染色条件を最適化する。
      注2：そのようなアポトーシスの間にミトコンドリアから漏れないのMitoTrackerレッドCMXRos、のMitoTrackerディープレッドFM、またはのMitoTrackerグリーンFM、ミトコンドリア用の蛍光汚れを使用してください。これは、アポトーシスとアナスタシス時のミトコンドリアの形態を可視化することができます。これらの汚れの詳細については、資機材の表を参照してください。
    2. 光退色を避けるために、暗闇の中で染色された細胞を保管してください。
    3. 細胞を洗浄することにより余分な汚れを削除する3、各洗浄の間に、新鮮な培地中で1分間インキュベートし、37℃のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液または新鮮な細胞培養培地と時間後、さらに過剰な許可する最終洗浄前に20分間、新鮮な培地中で培養する汚れは、イメージングのために、非特異的バックグラウンドシグナルを低減するために、細胞を終了します。
      注：イメージングのための高いバックグラウンドを生じ得る染色した後、細胞培地でインキュベーション時間を短くしてください。
    4. アポトーシス誘導が適用される前に画像の健康な細胞へのリアルタイムの生細胞の共焦点またはエピ蛍光顕微鏡を実行する（生細胞の顕微鏡検査のためのプロトコル3を参照）。
      注：健康な細胞は、ほとんどの細胞型（ 図1D、1F、1G）に管状ミトコンドリアと丸い核を表示する。
    5. アポトーシスを受けるトリガー細胞（細胞にアポトーシス刺激の適用および除去のためのプロトコル2を参照してください）​​。
    6. タイムラプス生細胞のミトコンドリアの変化を観察する顕微鏡や原子力morphologを継続死刺激が細胞に適用された直後にIES。管状のミトコンドリアと丸い核を表示する健康な細胞とは対照的に、そのようなミトコンドリアの断片化と腫れ、クロマチン凝縮、核断片化などのアポトーシスの特徴を表示するために、細胞を観察します。
    7. 細胞がアポトーシスの特徴を表示すると、新鮮な培地で洗浄し、供給細胞、および細胞の運命を追跡するために、タイムラプスイメージングを続ける。アポトーシスを逆に細胞は、正常なミトコンドリアと核形態（ 図1D、1F、1G）を取り戻す。
      注：細胞（DIC顕微鏡法のためのプロトコル4.1を参照）の同じグループに細胞形態の変化を観察することによってアポトーシスの段階にアクセスするための付加的な情報を得ることが可能な場合に並列にDIC顕微鏡法を実行する。
  3. 安定してシトクロム c -GFP融合広報を発現する細胞を使用してシトクロムcのミトコンドリア放出を検出するotein（ 図2を参照）。
    1. ステイン細胞が安定的に（生細胞のミトコンドリア染色4.2.3するには、手順4.2.1を参照してください）偏細胞のミトコンドリアを標識しのMitoTrackerレッドで-GFP 23,24シトクロムcを表現する。
    2. 健康な細胞（生細胞イメージングのためのプロトコル3に詳細を）追跡するために、リアルタイムの生細胞の共焦点またはエピ蛍光顕微鏡検査を行います。
      注： シトクロム c -GFP信号は主に健康な細胞（ 図2A のi、2B）のミトコンドリアに局在する。
    3. アポトーシスを受けるトリガー細胞（細胞にアポトーシス刺激の適用および除去のためのプロトコル2を参照してください）​​。細胞質ゾルへのミトコンドリアからシトクロム c -GFPの転位を観察するタイムラプス顕微鏡検査を続行（ 図2Aii-III、2B）。
      注：サイトゾルへのシトクロムc のミトコンドリア放出は、ミトコンドリア外膜透過（MOMP）のマーカーである4、ミトコンドリア依存性アポトーシス21,22における重要なステップ
    4. 細胞は細胞質中のシトクロム c -GFP信号を表示すると、細胞死刺激を削除し、新鮮な培地に供給細胞（プロトコル2を参照してください）。細胞質のGFPを有する細胞の運命を追跡するために、タイムラプスイメージングを続行します。
      注：アポトーシスを逆に細胞が正常な細胞形態を取り戻し、バックミトコンドリア（ 図2Aiv-VII、2B）の劣化または転座を通じて、おそらく彼らのサイトゾルのシトクロム c -GFP信号を減らす。
    5. （DIC顕微鏡のプロトコル4.1を参照）は、単一の細胞または細胞群における細胞形態の変化を観察することによってアポトーシスの段階にアクセスするための追加情報を取得するために並列にDIC画像をキャプチャする。
  4. カスパーゼのバイオセンサーを用いてカスパーゼ活性を検出した（ 図3を参照）。
    1. のためのカスパーゼバイオセンサーNES-DEVD-YFP-NLSとのトランスフェクト細胞16アポトーシス刺激13にそれらをさらす前に、24時間である。
    2. （生細胞核染色するための手順を4.2.3に4.2.1を参照してください）​​細胞核を標識し、ヘキスト33342でトランスフェクションした培養物を染色する。
    3. 健康な細胞（生細胞イメージングのためのプロトコル3に詳細を）追跡するために、リアルタイムの生細胞の共焦点またはエピ蛍光顕微鏡検査を行います。
      注：NES-DEVD-YFP-NLSバイオセンサ信号は、主にその核外移行シグナル（NES）に起因する健康な細胞の細胞質ゾルに局在する（ 図3A、3Biと3C、ディスカッションを参照してください）。
    4. アポトーシスを受けるトリガー細胞（細胞にアポトーシス刺激の適用および除去のためのプロトコル2を参照してください）​​。 YFPの核移行を観察するタイムラプス顕微鏡検査を続行します。
      注：カスパーゼを切断の活性化カスパーゼのバイオセンサーNES-DEVD-YFP-NLSでDEVDモチーフ、（ 図3A、3Bii-IV、ディスカッションを参照）核に細胞質ゾルからYFP-NLS転になる。
      5. 、新鮮な培地でアポトーシス刺激を削除し、供給細胞（プロトコル2を参照してください）​​。
      注：アポトーシスを逆細胞は、正常な細胞形態を回復するが、核YFP信号保持する（ 図3BV-xは、セル1および2、および3D）。
    5. 核YFPを表示する細胞の運命を追跡するために、タイムラプスイメージングを続行します。
      注：核YFP信号は、おそらくそのようなプロテアソーム分解などの正常な細胞クリアランス機構を通じて（ 図3B、VI-X、セル1、結果と考察を参照してください）細胞がアポトーシスを逆転している数時間後に劣化します。
    6. 単一細胞または細胞群における細胞形態の変化を観察することによってアポトーシスの段階にアクセスするための追加情報を取得するために並列にDIC画像をキャプチャする。 （DIC顕微鏡検査のためのプロトコル4.1を参照してください）​​。
  5. ホスファチジルセリンの細胞表面露出（ 図4を参照してください）
    1. GL上にシード細胞お尻は、（プロトコル1を参照してください）​​80％の細胞集密度を達成するためにカバースリップ。
    2. 赤蛍光のMitoTrackerとそれぞれミトコンドリアおよび核、青ヘキスト33342染色で細胞を共染色（生細胞のミトコンドリアと核染色のために4.2.3へのステップ4.2.1を参照してください）​​。
    3. アポトーシス誘導剤を使用することによりアポトーシスを受けるトリガー細胞（プロトコル2を参照してください）​​。
    4. アポトーシス細胞の表面上のホスファチジルセリンの暴露を検出するためのアポトーシス誘導剤の除去の前に、37℃でのアポトーシス細胞を10分間染色する（材料を参照）、蛍光標識したアネキシンVを印加する。
      注1：ホスファチジルセリンは、通常、細胞原形質膜38の内側のリーフレットに隔離されているため、健康な細胞はアネキシンVで染色されていない。アポトーシス細胞は、（ 図4Aおよび図4B）、細胞表面上のホスファチジルセリンに結合するアネキシンVで染色されている。
      注2：蛍光標識アネキシンVはまた、アポトーシス細胞のimmのを染色するために適用することができるediately 10分間のインキュベーションとアポトーシス誘導剤の除去、後に。
    5. 細胞死刺激を取り除く回暖かいPBSまたは新鮮な培地で染色された細胞を洗浄し、次いで（プロトコル2を参照）を5％CO 2、37℃で2時間、新鮮な培地を細胞に供給する。
      注1：アポトーシスは正常な形態を回復し、正常な形態取り戻した後、蛍光標識されたアネキシンV信号を保持する反転細胞（ 図4A、および4B）。
      注2：アネキシンV信号は、回収した細胞に、時間とともに減少（議論を参照）。
    6. 室温で暗所で20分間、1×PBS中で8％のスクロースを含む4％パラホルムアルデヒドで選択された時点で細胞を固定し、退色防止封入剤でスライドガラスカバースリップ上の細胞をマウントする前にホルムアルデヒドを除去するために3回PBSで固定した細胞を洗浄共焦点またはエピ蛍光顕微鏡用（材料を参照）、アポトーシス誘導剤を除去した後、細胞にアネキシンVを観察します。
      注1：固定液中のスクロースは、固定時に細胞膜構造を保持します。
      注2：劣化を防止するために、4℃で暗所にパラホルムアルデヒド溶液を保管してください。
      注3：細胞にコールドショックを回避するための固定のために細胞に適用する前に室温にパラホルムアルデヒド溶液をウォームアップ。

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結果

アポトーシスの反転を研究するために、組織培養細胞は、最初にアポトーシスを誘発する死刺激にさらされている。細胞がアポトーシスの特徴を表示するとき、新鮮な培養培地は、次いで、刺激を洗い流し、その後回復した （ 図1A）を可能にするために死細胞を培養するために適用される。ここでは、アドレス指定されている重要な問題は、個々の死にかけ培養細胞がアポトーシスに向かって進行し、まだアナスタシスを受けることができるどの程度までである。この問題は、決定的に以下に記載する方法を用いて細胞の運命を追跡するためのバイオマーカーと連続モニタリングによって応答することができる。

まず、トラッキングのために必要とされるタイムラプス生細胞の顕微鏡検査を使用し、中、およびアポトーシス刺激12,13への曝露後、前の個々の細胞の応答を記録することによって、組織培養細胞におけるアポトーシスの反転を検出するための我々の戦略を説明する。それらに接続された基板上に広げ、健康な接着細胞（図1Bi）12,13、および糸状...

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ディスカッション

アナスタシスは、細胞死経路を活性化した細胞がその後死んでプロセスを逆にして生き残る現象を指す。ここでは、ライブセルイメージングが実際に同一の個々の細胞は後期アポトーシス細胞死のプロセスを逆にし、次いで生存及び再生し続けることができることを確認するために使用され得ることを実証した。我々のプロトコルは、アポトーシスを誘導し、細胞の大部分は、検証のために、いくつかのバイオマーカーを用いてモニターアポトーシスの反転を受けることができるように、いくつかの最適化された細胞型特異的な処理条件を記述する。技術的な問題については、ガラスボトムディッシュを理由高倍率で高品質のコンフォーカルまたはエピ、蛍光顕微鏡用のロング作動距離を可能にの細胞と顕微鏡対物間の高透明な薄いガラス、の、イメージング12,13、培養の細胞に用いられた、ミトコンドリア断片化を含む古典アポトーシスの観察を容易に、 シトクロム c、及び核凝縮及び断片化のリリース。ガラスはまた、アポトーシスの間、膜小疱形成、細胞の細胞収縮、アポトーシス小体の形成のモニタリングのための高品質のDIC顕微鏡観察を可能にするために、光の極性を歪曲しない。 DICは、細胞...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

当社は、単語 "アナスタシス」アポトーシスの逆転を記述するための示唆のために牧師先生ラルフBohlmannと牧師先生ジェームスVoelzに感謝、安定してシトクロム c -GFPを表現するHeLa細胞についてダグラス·R·グリーン; H446細胞用のチャールズM.ルーディンとエリックE.ガードナー。ビデオでの漫画の図面をアシストするためにヘザーラム。この原稿の貴重な議論のためのイーホイヨ。この作品はサー·エドワード·ユード記念フェローシップ（HLT）、博士ウォルターSzeto記念奨学（HLT）、フルブライト助成金007から2009（HLT）、ライフサイエンス研究財団フェローシップ（HLT）によってサポートされていました、NIHはNS037402（JMH）付与とNS083373（JMH）、および香港大学補助金委員会のAoE / B-07/99（MCF）。ホーラム唐は、生命科学研究財団のShurlとケイクルチ財団フェローである。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
LSM780共焦点顕微鏡カールツァイス
ガラス底培養皿MatTek株式会社P35G-0-14-C
透明 CultFoiカールツァイス000000-1116-084
CO2 独立した媒体ライフテクノロジーズ 18045-088
CellTrackerライフテクノロジーズ C34552
Mitotracker Red CMXRosLife TechnologiesM-7512
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399
蛍光標識アネキシンVBiovisionK201

参考文献

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