初代細胞培養研究のためのひよこ網膜における効率的な遺伝子導入：元オボエレクトロポレーションアプローチ

サマリー

ニワトリ胚網膜細胞培養物は、感光体の生物学の研究のための貴重なツールを構成しています。私たちは文化の前に網膜のプラスミドエレクトロポOVOの元に基づいて、効率的な遺伝子導入技術を開発しました。この技術はかなりこのシステムの実現可能な遺伝子操作を行う、現在利用可能なプロトコルを介してトランスフェクション効率を向上させます。

要約

ニワトリ胚の網膜由来錐体光受容体に富む文化が網膜神経細胞、特に光受容体の生物学を研究し、世界中の研究者のための不可欠なツールとなっています。それらは容易に薬剤開発のためのハイスループット技術に適合させることができるように、このシステムのアプリケーションは、基本的な研究を越え。しかし、これらの培養物における網膜の光受容体の遺伝子操作は、システムの有用性に重要な制限を装った、非常に困難であることが判明しています。我々は最近開発され、現在利用可能な他のプロトコル¹に比べて5倍これらの培養物における網膜細胞のトランスフェクションの速度を増加させるプラスミドのエレクトロポレーション技術OVOの元を検証しています。この方法では、ニワトリ胚の眼は、段階27で摘出され、RPEを除去し、そして網膜のカップは、プラスミド含有溶液中に配置されており、容易に構築お客を用いてエレクトロポレーション電極を作りました。網膜は、次に解離し、標準的な手順を用いて培養されます。この技術は、一般的に感光体集団の25％において導入遺伝子の発現を達成する、プラスミドドリブンRNAi技術の使用を介して、例えば、過剰発現の研究​​に、ならびに遺伝子発現のダウンレギュレーションにも適用することができます。現在の出版物のビデオフォーマットは、一次網膜培養における遺伝子機能の研究を可能にする、分野の研究者にこの技術が簡単にアクセスできるようになります。また、成功した結果と再現性のために、この手順の重要なステップの詳細な説明が含まれています。

概要

ニワトリ胚の網膜からの解離細胞培養物は、広く生存^2-9、10-12分化、神経突起伸長^13、などを含む光受容体細胞生物学のさまざまな側面を研究するために使用されています。このシステムの利点は、ルーベン・アドラーと共同研究者によって1980年代に開発され、彼と他のグループ^14-20によって完成は、動物モデル²¹としてひよこの固有の特性に存在します。でも、胚の段階でニワトリ目の大きなサイズは、培養のための材料を大量に提供します。培養物は、胚日（ED）5使用して実行されたときにまた、 - 6網膜を、55 -この動物における光受容体の約86％であるので、それらの前駆細胞の80％が光受容体^{14,15,18,22,23}として区別し、コーン^24は 、これらの培養物は、この細胞型に焦点を当てた研究のために特に適しています。

我々は最近、develoを持っていますPEDは、したがって、遺伝missexpression研究^1を容易にすることによって、このシステムの有用性を広げ、これらの培養物中の細胞の高効率プラスミドトランスフェクションを可能にする簡単な方法を特徴とします。この技術の開発は、細胞自律的に遺伝子機能の研究を可能にするために、トランスフェクションの許容レベルを提供する方法の科学文献中の空隙から茎。主な神経細胞培養は^25,26....

プロトコル

この作業で説明するすべての手順は、ジョンズ・ホプキンス大学の動物実験委員会によって推奨されるガイドラインに従って行いました。

事前に1：楽器の調製、試薬と料理

1. 卵の調製：卵のインキュベーターで5日間37.5℃、相対湿度60％で受精白色レグホン鶏の卵をインキュベートします。
   注：標準化と胚発生を同期させるための役に立つかもしれ容量ロッキングが、ロッキングインキュベーターは、このプロトコルの結果のために厳密には必要ではないです。
2. プラスミド準備：
   1. 必要に応じてデザインプラスミドは（RNAi技術^1,34を使用することによって例えば）遺伝子の過剰発現またはダウンレギュレーションのために構築します。可能な限り、構築物中のレポーター遺伝子を（例えば、EGFP、RFPまたはのLacZなど）が含まれます。
      注：例えば、CMVのようないくつかの一般的に使用されるプロモーターは、時間後に沈黙になることができます。 CAGのpromotER（CMVエンハンサーとチキンβ-アクチンプロモーター）関心^35-37の遺伝子の効率的な長期的な表現を提供する、非常に良い代替手段です。
   2. 無菌PBS中1.5μgの/μlの濃度でのプラスミド溶液を準備します。オプション：事前にプラスミド溶液を調製し、それが凍結された使用可能な状態になるまで保管してください。
      注：より高....

結果

ここでは、その後の解離細胞培養のための除核ひよこ網膜カップへのプラスミドのトランスフェクションのための単純なプロトコルを提示します。トランスフェクションは、カスタムの電極（ - 2、図1）を作成することが容易に使用してエレクトロポレーションにより達成されます。このプロトコルで説明するパラメータ（平均22％で）20％の間と27の範囲のトランスフェクション効率を得られるように最適化された（ 図3D）。上記の理由のために、これらの結果は、培養の4日後に定量化される、ということに注意してください。この文脈において、トランスフェクション効率は、全細胞集団内で導入遺伝子を発現する細胞の割合を指します。唯一の感光体集団が考慮されている場合は、トランスフェクション効率は、25％の平均（ 図3D）に増加します。培養物のこれらのタイプは、主に光受容体を研究するために使用されているので、これは重要な特徴です。

electroporatされた細胞培養この技術を用いて編その非エレクトロポDIC照明下でその.......

ディスカッション

このプロトコルの成功のための最も重要なステップは、胚の適切な段階を選択することです。以前の出版物では、胚の段階の範囲は、一般に、インキュベーションまたは胚日の日（ED）によって定義され、これらの培養のために与えられています。したがって、通常、EDに6胚をED 5を使用して同等の結果をもたらすと仮定されます。しかし、我々は、上記のように、ステージ27（ED 5）に、トランスフェクション効率は、全細胞集団の約22％になることを見出しました。まだ効率は28胚（ED 5.5）のステージを使用している場合、ステージ29（ED ^6）1で12％と16％に低下します。その他の重要なステップは、プロセス全体を通じて、無菌状態を維持することを含み;解剖とエレクトロポレーションの間に、網膜の損傷を避けるために必要な手先の器用さを獲得。および細胞のプレーティング時に胚採取の時間から長いギャップを回避します。

良いトランスフェクションefficienを確保するためのもう一つの重要な考慮事項CIESプラスミド含有溶液の濃度である：推奨1.5μgの/μlのは、我々は効率の低下をもたらさなか.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ECM 830 エレクトロスクエアポレーター	BTX/ ハーバード装置	45-0052
ジェネトロード、L字型、5 mm ゴールドチップ	BTX/ ハーバード デバイス	45-0115 モデル 512	アノードとして使用されるゴールドチップ電極
ポリイミドチューブ	ベンションメディカル	カスタムメイド	内径:0.5 mm/肉厚:0.15 - 0.2 mm. 金チップ電極
の絶縁に使用2.5 mm正方形のボックスフィラメント、4.5 mm幅	Sutter Instrument Company	FB245B	陰極電極HBSSを作るために使用され
、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドはありません	Gibco - Life Technologies	14175-095
Moloney Forceps	Roboz	RS-8254	鋸歯状;わずかなカーブ;4.5インチ長さ
デュモンピンセット 5/45	Roboz	RS-5058	パターン #5、45 度角度、.10 x .06mm チップサイズ、長さ 109mm
ボンマイクロ鉗子、1x2 歯	Roboz	RS-5172	タイイングプラットフォーム、1x2 歯、0.12 mm 歯、3.75 インチ長さ、0.3 mm チップ幅

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