方法論記事

使い捨て空気圧バイオリアクターシステムを使用して、哺乳動物細胞の培養

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DOI：

10.3791/52008

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2014年10月10日

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1Center for Biotechnology Education, Johns Hopkins University, 2PBS Biotech, Inc.

この記事について

サマリー

空気圧式バイオリアクターを使用して、哺乳類細胞の増殖のためのこの使い捨てバイオリアクターシステムの組み立て、操作、および性能を実証します。

要約

哺乳類、昆虫、幹細胞の栽培とスケールアップにおける最近の進歩は、新しい治療法と個別化医療の革新のための大きな機会を生み出しました。しかし、これらの進歩を治療用途に応用するには、堅牢で柔軟性があり、費用対効果の高いバイオリアクターシステムを可能にするin vitroシステムが必要になります。現在、研究および商業環境で利用されているバイオリアクターシステムがいくつかあります。しかし、これらのシステムの多くは、さまざまな細胞タイプの確立、増殖、および増殖のモニタリングには最適ではありません。これらのシステムで制御するのが最も困難な培養パラメーターには、流体力学的せん断の最小化、栄養素の勾配形成の防止、均一な培地の曝気の確立、微生物汚染の防止、培養条件のリアルタイム監視と調整などがあります。空気圧式シングルユースバイオリアクターシステムを使用して、マイクロキャリア上で増殖した哺乳類細胞に対するこの新しいバイオリアクターの組み立てと操作を実証します。このバイオリアクターシステムは、流体力学的せん断と栄養勾配の形成を最小限に抑え、均一な培地の曝気を可能にすることにより、現在利用可能なシステムに関連する多くの課題を排除します。さらに、バイオリアクターのソフトウェアにより、バイオリアクターの運転パラメータをリモートでリアルタイムに監視および調整できます。また、このバイオリアクターシステムは、さまざまな治療用タンパク質、モノクローナル抗体、幹細胞、バイオシミラー、ワクチンを産生するための接着細胞や浮遊哺乳類細胞のスケールアップにも大きな可能性を秘めています。

概要

懸濁液中で成長する細胞は、凝集体として成長した細胞、および細胞基質に係留成長する：哺乳動物細胞株は、その増殖特性に基づいて3つのカテゴリに分類することができる。このビデオで実証エア輪バイオリアクターは、細胞の3種類すべてを成長することができるが、このビデオは、マイクロキャリア上で足場依存性細胞を増殖させるバイオリアクターの使用を実証します。細胞自体が生成物である - 足場依存性哺乳類細胞は、より多くの細胞を産生する目的のために成長させることができる。例えば、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞は、現在、細胞を採取し、病変組織にそれらを注入する目的で栽培されている。このビデオで実証空気圧バイオリアクターは、このアプリケーションのためのそのような間葉系幹細胞の産生に好適であることが判明した（セラら 、私信、2013）。

アンカレッジDEPendent哺乳動物細胞は、典型的には、それらが特別に処理された成長表面1に付着した細胞培養プレート、細胞培養フラスコまたはローラーボトルのような2D培養容器の小さなスケールを成長させる。より多くの細胞が望まれる場合、プレートまたはフラスコを、より多くのまたはより大きな血管を使用することによって拡張することができる。しかし、より費用対効果の足場依存性細胞の大量培養、細胞付着のための表面積を増大させるためのマイクロキャリアと呼ばれる小さな固体ビーズを使用することによって達成することができる。細胞の付着特性に応じて、マイクロキャリアのいくつかの異なるタイプは、デキストラン、ペプチド、またはコラーゲンコーティングされたように、市販されている。マイクロキャリアは、細胞増殖のための大きな表面積を提供体積比に大きな表面積を有し;マイクロキャリアは、細胞がバイオリアクターシステム2で高密度に培養されることを可能にする撹拌で懸濁状態に維持することができる。現在、bioreaの種類接着細胞は、マイクロキャリア上で増殖させるのコンスは、細胞コーティングされたマイクロキャリアの懸濁を維持するために、軸方向翼を使用するスピナーフラスコおよび撹拌タンクシステムを含む。

いくつかの要因は、酸素圧、剪断応力、表面マトリックス、および栄養および代謝物の濃度を含む細胞の培養に成功にとって重要である。バイオリアクターの使用は、増殖条件および有意に低い生産コスト1の電位のリアルタイムモニタリングを可能にする。を含む、 インビトロ細胞培養、撹拌した懸濁液、回転壁容器、中空繊維、ロッカープラットフォーム上でバッグ、バイオリアクター、流動床システム3のためのいくつかの一般的なバイオリアクターの設計がある。これらのシステムの多くは、高コスト、栄養濃度勾配が、流体力学的剪断、細胞凝集、困難サンプリングにおいて、監視、および制御するセルとして、細胞培養のための固有の問題を提示し-upスケールリットルスケールアップ。

各種の付着細胞株は、ウイルスワクチンの生産にまたは遺伝子治療適用のためのウイルスベクターの生産のためのいずれかの、ウイルスの産生に使用されている。このビデオでは、単回使用の空気圧（エアホイール）バイオリアクターシステムを用いて、本発明者らは、ヒト肺癌細胞（A549）腫瘍崩壊アデノウイルスの産生のためのマイクロキャリア上の細胞の培養を示す。空気圧バイオリアクターの設計は、バイオリアクターの底に散布したガスの浮力によって供給されて、垂直攪拌ホイールを使用しています。この穏やかな攪拌方法は、流体力学的剪断力を制限するが、それでも最適な培地と細胞を4ミキシングを保証する。撹拌槽型反応器と比較して、空気圧式反応器は、高容量空気ホイールバイオリアクターシステムと低い壁せん断応力（ 図1）を有している。攪拌タンクバイオリアクターとは対照的に、この単回使用の反応器の垂直インペラ内のガス気泡流により回転される穏やかで均一な媒質混合（ 図2）を可能にする容器。

プロトコル

1。ログイン

  1. バイオリアクターをパワーアップ。ログインページを開くには、任意の場所をクリックします。ユーザー名を選択し、パスワードを入力して「ログイン」をクリックします。

2キャリブレーション

  1. pHセンサ（オートクレーブの前に2ポイント）を校正します。
  2. pHセンサを点検し、センサチップは電解液で満たされていることを確認します。 pH校正ソリューション（電解質）をpH4とpH7の二つのビーカーを用意し、蒸留水で使用可能な洗浄ボトルを持っています。
  3. pHセンサのpHケーブルを接続します。 Helloインタフェースの「アクション」タブに移動し、「キャリブレーション」をクリックします。キャリブレーション溶液の温度フィールドにおけるバッファの温度を入力します。
  4. バッファ1液（pH 4）中のpHセンサを配置し、「ゼロ」のフィールドに値を入力します。安定させ、「キャリブレーション1」ボタンをクリックし、グラフを待ちます。蒸留水でpHセンサーをすすぐ。
  5. バッファ2（pH7）にセンサを配置します。バッファを入力してください「スパン」フィールドに2の値。安定させ、2ボタンを校正クリックし、グラフを待ちます。
  6. クリックして "閉じる"をクリックして「保存」。
  7. 溶存酸素（DO）センサーを校正します。
  8. 確保DOセンサは、数時間のためにシステムに接続されることにより偏光されている。 Helloインタフェースの「アクション」タブに移動し、キャリブレーションをクリックします。 「DO」ボタンをクリックしてください。
  9. DOセンサーを外し、「ゼロ」フィールドに0を入力してください。安定させ、「校正1」ボタンをクリックし、グラフを待ちます。
  10. DOセンサーを再接続し、「スパン」フィールドに100と入力します。安定させ、「校正2」ボタンをクリックし、グラフを待ちます。
  11. クリックして "閉じる"をクリックして「保存」。

センサーおよび試薬容器を3オートクレーブしてからインストール

  1. AUTOC校正、場所センサおよびサーマルウェルの後溶岩パウチ及び121℃、15psiで30分間オートクレーブ。
  2. 生物学的安全キャビネット（BSC）と70％イソプロピルアルコール（IPA）と転送パウチオートクレーブパウチを消毒。容器の外箱を取り出します。
  3. 70％IPAで内装を消毒し、生物学的安全キャビネット（BSC）の容器に移す。内装容器を取り出し、輸送中に与えた損害の容器と配管を点検します。
  4. pHをインストールし、2つのフロントポートにセンサーをDO。左バックポートにサーマルウェルをインストールします。センサーキャップを開きます。
  5. センサーポートを介してセンサガイド。ポートにしっかりとセンサーを通します。
  6. BSCの外容器に移す。
  7. 容器のスリーブの外DOおよびpHセンサケーブルを掛け、何もスリーブになっていないことを確認してください。まず、スリーブに足を容器をスライドさせます。
  8. 慎重に容器サーマルウェルに温度センサーを取り付けます。容器の底部ヒータに支えていることを確認してください。
  9. 削除する彼らのバッグからチューブセット。バイオリアクターコントロールユニット上の対応するコネクタやポンプに配管のマッチングのカラーコーディング。
  10. そのガス出口にコネクタを押して、メインガスラインをインストールします。ガスコンセントにコネクターを時計回りにねじることによってマイクロガスラインをインストールします。排気フィルタチューブをインストールします。
  11. フィルタオーブンを開きます。そのチューブはフィルタにし、オーブンから2フックを通過するように、U-チャネル上で排気フィルタを固定します。
  12. チューブホルダーにコンデンサー袋でチューブを取り付けます。ドアを閉じます。
  13. 次のバイオリアクター制御ユニットに経路追加ラインAとB、両方のメディア線、DOセンサーの背後にあるとベンチの上に採取ライン。
  14. DOおよびpHセンサにケーブルを接続します。

4。中·マイクロキャリアを追加する

  1. 「アクション」タブに移動し、クリックしてコンピュータインタフェースの「コントロールポンプ」。
  2. 殺菌フォーム未使用のメディア添加ライン（1オレンジバンド）とチューブを溶接するか、ルアーフィッティングを使用して、ミディ​​アムボトル/バッグ·ソースとの間の接続ル。
  3. 上のメディアポンプをオンにスライダーをクリックしてください。メディアは培地の添加所望量後にオフポンプにするスライダをクリックしてください。
  4. RTで3時間、のCa 2 +のMg 2 +を含まないPBSをマイクロキャリアビーズを配置します。
  5. 洗浄は、Ca 2 +、Mgを2 +フリーPBSで数回ビーズ。
  6. 115°C、15 psiので15分間オートクレーブ。
    注：この実験では3グラム/ L（乾燥重量）を追加します。
  7. 同様に、反応器に、水和し洗浄し、オートクレーブ処理されたマイクロキャリア媒体中のポンプは、ステップ4.1で追加されました。

5。平衡とワンポイントDO校正

  1. オートにコントローラを設定し、必要な設定値を入力します。ここで、= 15 rpmで、温度SP = 37.0°C、pHは= 7.2、= 100％DO攪拌セットポイント（SP）を使用します。 Pを待ち平衡化arameters。
  2. センサーが完全に偏光していることを確認します。 DO現在価値が安定したことを確認します。
  3. 「アクション」タブに移動し、「キャリブレーション」をクリックします。 「DO A」をクリックし、「ワンポイント」をクリックしてください。
  4. 「スパン」の欄に「100」と入力します。 、クリックして「保存」と「閉じる」をクリックし「キャリブレート1」ボタンをクリックしてください：

6ファイル名を指定して実行を開始する

  1. [アクション]タブに移動します。 「バッチ」をクリックします。バッチ名を16文字以内で入力してオンスクリーンキーボードまたは外付けキーボードを使用してください。
  2. オンスクリーンキーボードの「非表示」ボタンをクリックしてください。オーバーレイで「開始」をクリックして確認し、「バッチを起動」をクリックしてください。

7細胞で接種する

  1. 未使用のメディア添加ライン（1オレンジバンド）と溶接による細胞ボトル/バッグ·ソースとの間の無菌接続を形成配管またはルアー継手を使用する。
  2. メディアポンプでチューブのシリコーン部分を取り付け、ポンプと容器との間のチューブに向かって矢印のようにします。
  3. 管クランプが開いており、その分枝状管クランプが閉じているか確認してください。上のメディアポンプを回してセルを追加した後に「オフ」をクリックし、スライダーをクリックします。
  4. 「アクション」タブに移動し、「コントロールポンプ」をクリックします。

8サンプリング

  1. として頻繁に文化を監視するために、必要に応じて接種した後、以下のように培養物からサンプルを描く。
  2. 「アクション」タブに移動し、「サンプルを取る」をクリックしてください。サンプリングポンプのサンプリングチューブを配置し、画面上の指示に従って、サンプリングストップコックを操作します。
  3. これらのサンプルについて少なくとも毎日、顕微鏡観察および細胞数を実行します。
  4. 細胞は、この（c）に、所望の密度に達したとき1.2×10 6細胞/ ml ASE、ウイルス接種物を加えて細胞を感染させる。
  5. 無菌的に20ミリリットルの注射器に接種材料を追加して、原子炉の予備加算ポートのいずれかに注射器を接続します。シリンジプランジャーを押して、反応器への接種材料を紹介。
  6. アデノウイルスの細胞内粒子濃度培養をサンプリングして分析し続けます。

結果

図3では、バイオリアクターランの開始のためのパラメータが示されている。この図は、温度、溶存酸素、pHおよび撹拌のパラメータを設定する前に画面を示します。パラメータが設定されると、実行パラメータを連続的に監視され、調整が必要な条件を維持することができる。ソフトウェアは、問題の容易な同定を可能にする継続的な読み出しを生成します。 、FBS SAFCアンチフォームC、2mmのL-グルタミンおよびマイクロキャリアを3g / L 250ppmの10％を含むDMEM 2.5 Lを用いて、この実験では、システムは、そのように酸素原子百分率が50％である安定化され、温度は37℃であり、pHは7.2である。反応器を4×10 7細胞/ ml（または10細胞/マイクロキャリア）の濃度でA549細胞を接種される。この実行のために選択されたパラメータは、2時間（ 図4）内のマイクロキャリアに付着した細胞の大部分をもたらした。 12時間後、細胞を、鬼である平坦化マイクロキャリアの表面上に拡散trating記号（ 図5）。 24時間までに、マイクロキャリアは（ 図6）、細胞を含まない無マイクロキャリアおよびマイクロキャリア上の細胞の無い大きな塊の細胞の比較的均一な分布を有する。 A549細胞によるマイクロキャリアのコロニー形成の割合は、24時間、その後90％（ 図7）75重量％である。細胞を48時間後（ 図8）の後に〜100万個の細胞/ mlに指数関数的に成長し続けた。 50時間で腫瘍溶解性アデノウイルス（2×10 8ウイルス粒子/ ml）をの用量による感染後、密度がmlの120万個/まで増加した後、溶解感染が進むにつれて減少し始めた。ウイルス接種の〜10,000倍の増幅があった。

以前の実験では、ガスの流れを監視し、調節すること、細胞増殖（未発表データ）を最大化するために重要であることを見出した。急速に成長する細胞は、酸素のシステムとを枯渇することができますゼロに落とすDOレベル。細胞が成長を続けている間、それははるかに遅い速度であった。これは、対数増殖期の間に細胞の要求を満たすために酸素の流れを監視し、調整することが重要である。各ランは、毎日細胞数とpHは、DOおよび温度とを比較することにより、最適な成長のために分析することができる。

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さまざまな原子炉の容量で壁面せん断力を測定スターラータンクバイオリアクターと比較して空気圧バイオリアクターシステム（PBS）の図1に流体力学 。

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図2。空気圧エアホイールリアクターインペラー。

52008 / 52008fig3highres.jpg "/>
バイオリアクターの実行を開始するために、パラメータの3空気圧エアホイールソフトウェアのスクリーンショット図。

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A549細胞2時間後に接種した。図4。マイクロキャリア植民地化。（平均マイクロキャリア径〜180程度である。） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図5に12時間培養開始後、A549細胞は、取付平坦化、およびマイクロキャリアに広がっている。5highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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培養中の24時間後に細胞で覆われた図6のマイクロキャリア。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-6
A549細胞によるマイクロキャリア植民地化の図7の割合は接種後。

figure-results-7
図8 adenovir、培養前の生A549細胞の数と感染後当方は、ウイルス感染工程は50時間で起こったことに注意してください。

ディスカッション

この単回使用バイオリアクターシステムを使用するのが比較的簡単であり、原子炉監視および分析のためのリアルタイム分析を提供する。これは、3000万人以上の細胞/ mlに達し、セル密度を有する哺乳動物および昆虫細胞培養のための非常に適しています。本報告書11に記載されたA549細胞のほかに、私たちも同様にバイオリアクター中で、SF-9昆虫細胞を成長している。空気圧エアホイールが提供する穏やかな混合は、細胞の損傷を軽減します。この原子炉を設定するときに、いくつかのステップが重要である。まず、適切なpH値のキャリブレーションとは、センサーは培養液の最適なモニタリングのためおよびpHまたは系内の酸素を調整する試薬の添加のために重要であるようにしてください。第二に、試薬およびシードボトルは充填され、ルアーの添付ファイルは、BSCのような無菌環境で行う必要があります。試薬ボトルは、無菌環境の外に移動されると、バイオリアクターフィードラインへの接続は、微生物汚染を避けるために注意して行わなければならない。

このバイオリアクターシステムは、それが細菌培養のために設計されていない哺乳動物および昆虫細胞株に適していますが。システムは、細菌細胞のために必要とされる急速混合し、酸素化を提供することはできません。細菌の増殖は最高の攪拌タンクバイオリアクターで達成される。哺乳動物または昆虫細胞培養のための他の単回使用バイオリアクターと比較して、このシステムは、使いやすいランの分析のための十分なデータを提供し、私たちが評価した他の単回使用システムよりも同等以上の細胞増殖を有している。

単回使用空気圧バイオリアクターシステムは、ワクチン、生物学的治療薬の分野における研究および臨床用途の多くを満たす幹細胞、および医学4をパーソナライズする可能性がある。また、このシステムの柔軟性がバッチ、フェドバッチ、灌流、およびトランスフェクションベースのバイオリアクターアプリケーション5を可能にする。最後に、単回使用の使い捨てバイオリアクターシステムはpotenを持つ大規模な工業生産のニーズを満たすためやガイドラインおよび国内外の規制当局6-10の勧告に付着したTiAl。

開示事項

著者D.ジルーとY橋村は、この記事で使用される試薬および器具を生産するPBS Biotech社の従業員です。

謝辞

このプロジェクトは、ジョンズ・ホプキンス大学のプロボストオフィスがゲートウェイ・サイエンス・イニシアチブを通じて一部支援しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
PBSの3 PBS
シングルユースアセンブリPBS
ヒト肺癌細胞(A549)ATCCCCL-185
DMEM高グルコース中胎児
ウシ胎児血清
トリプシンEDTA、0.25%
Cytodex 1マイクロキャリアGE3781
消泡剤 CSigmaA8011

参考文献

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