エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

Summary

ここでは、再プログラミング戦略とヒス​​トンデアセチラーゼ阻害剤ベースのエピソームを用いて末梢血からのヒト人工多能性幹細胞を生成するためのプロトコルを記述している。

Abstract

この原稿を効率的にエピソームプラスミドおよびヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤を用いて末梢血からの統合を含まないヒト誘導多能性幹細胞（iPS細胞）を作成するためのプロトコルを示す。このアプローチの利点は、（1）原料として、末梢血の最小量の使用。 （2）リプログラミングベクター非統合。 （3）ベクトルフリー性IPSCを生成するための費用効果的な方法。 （4）シングルトランスフェクション。 （5）小分子の使用は、エピジェネティックな再プログラミングを容易にする。簡単に述べると、末梢血単核細胞（PBMC）ルーチン瀉血サンプルから単離し、次いで、再プログラミングに著しく適している、高度に増殖性の赤血球前駆細胞集団を得た定義された成長因子の中で培養される。非統合、OCT4、SOX2、KLF4、MYCL、LIN28A、およびp53の短いヘアピン（SH）RNAを発現する非伝播エピソームのプラスミドはintroduですシングルクレオによって派生赤芽球へのced。強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現するエピソームの同時トランスフェクションは、トランスフェクションされた細胞の容易な同定を可能にする。エプスタイン-バー核抗原1（EBNA1）を発現する独立した複製欠損プラスミドはまた、エピソームのタンパク質の増大した発現のための反応混合物に添加される。トランスフェクションされた細胞は、その後の継続的再プログラミングのために照射したマウス胚性線維芽細胞（iMEFs）の層上にメッキされている。否やIPSC様コロニーはヌクレオ後約12日目に現れるように、HDAC阻害剤は、エピジェネティックなリモデリングを促進するために培地に添加される。我々は、HDAC阻害剤を含めることが日常的に2倍にすることによって完全に再プログラムIPSCコロニーの生成を増加させることを見出した。 IPSCのコロニーは典型的なヒト胚性幹細胞（hESCの）形態を示したら、それらを穏やかに継続的な成長および増殖のための個々のiMEFコーティングした組織培養プレートに移す。

Introduction

iPS細胞は、多能性遺伝子の最小限のセットの異所性発現を介して細胞組織から誘導される。この技術は、最初に非常に多能性状態¹で表現されるOCT4、SOX2、KLF4、およびcMYCはヒト線維芽細胞のレトロウイルス形質導入によって実証された。これらの一時的に発現「再プログラミング因子」は、ヒト胚性幹細胞²に、標的細胞のエピジェネティックな風景や遺伝子発現プロファイルが類似して変更する。作成後は、性IPSCは、潜在的に、さらなる調査のための任意の組織型に分化させることができる。したがって、それらは、再生医療、疾患モデル、および遺伝子治療用途において使用するための有望。しかし、統合ウイルスのゲノムを破壊することは、内因性遺伝子発現、細胞の表現型の影響を変化させる可能性があり、最終的に科学的な結果にバイアスをかける。さらに、ランダムウイルス統合は有害な携帯電子につながる可能性悪性形質転換³または発癌導入遺伝子⁴の再発現の可能含めffects、。将来の臨床応用は、非組み込みIPSCの生成が必要になります。

染色体外環状DNA分子であるエピソーム、効果的なコストを発生させるための戦略を提供し、統合のないiPS細胞^5。 表1に示したエピソームベクターの組み合わせは、再プログラミングは、OCT4、SOX2、KLF4、MYCL、およびLIN28A因子発現する。 pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-Fプラスミドは、細胞リプログラミング^6を強化するため、TP53の一時的な抑制のためのp53 shRNAを含まれています。複製欠損pCXWB-EBNA1ベクターは、EBNA1式 ⁷の一過性の増加を提供することで、初期化因子の増幅および増加初期化の効率を促進する。 pCXLE_EGFPプラスミドはDETEの目的のためにヌクレオ混合物に加えることができるトランスフェクション効率をrminingまたはセルソーティングアプリケーションに最適です。 p個のCXWB-EBNA1を除いて、このプロトコルで使用されるエピソームプラスミドは、宿主細胞の分裂⁸中エピソームの複製およびパーティションを媒介する、ウイルス複製およびEBNA1遺伝子のエプスタイン-バーウイルス起点を含む。エピソームは自然に連続したIPSC拡張⁷で失われます。サブクローニングおよびeGFP発現の損失から推測できるエピソームベクターの損失を有するiPS細胞の特徴付けは、将来の臨床応用のための完全に統合フリー性IPSCをもたらすことができる。

IPSCの生成のプロセスに固有の系統特異的遺伝子および多能性関連遺伝子の再活性化の抑制である。遺伝子発現の調節は、転写因子、調節DNAエレメント、およびRNAポリメラーゼのアクセスが対象とすることを可能にするDNAとクロマチンの修飾を含む、核内の複数のレベルで生じる遺伝子。グローバルクロマチン修飾を介したエピジェネティックな風景のリモデリングは、多能性遺伝的プログラムの再発現に重要なコンポーネントです。遺伝子発現の調節に重要である特定のクロマチン修飾は、ヒストンDNAコイルの減少緊張を通して遺伝子を標的とするためのアクセスを許可する特定のリジン残基でのヒストンのアセチル化である。 HDAC阻害剤は、アセチル化状態^11を支持する可能性が、IPSCの再プログラミングおよびhESCの自己再生^9,10を増強することが示されている小分子である。統合レンチ^12を用いて、公開前から適合以下に記載されるプロトコルは、エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて、末梢血から最適化IPSCを生成するためのステップバイステップの方法を提供する。ここで使用されるHDAC阻害剤の濃度は、ウェアによって記載されたものの半分であるら ^9、日常標準にわたって完全に再プログラムIPSCコロニーにおける2倍の増加につながっているHDAC阻害剤なしでエピソーム再プログラミングプロトコル。再プログラミングのこのレベルは、我々は、レンチウイルスの方法で観察する効率と同等である。このプロトコルを用いて、効率的に年齢87歳と同じくらい古い個人からのIPSCを生成した。

Protocol

フレッド·ハッチンソンがん研究センターの治験審査ボードと子どもの "sフィラデルフィアの病院で承認され、インフォームドコンセントを書かれ、末梢血サンプルを採取する前に、患者から得られた。すべての施設のガイドラインが観察された。MEF生成を含む全ての動物実験と奇形腫形成は施設内動物管理使用委員会によって承認された。

PBMCおよび赤芽球の拡大1.フィコール分離 - 0日

1. ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で1：末梢血1に希釈する。 15ミリリットル丸底ポリスチレンチューブでは、慎重に室温フィコール - ハイパックの3ミリリットルに希釈した血液7mlのレイヤ。
2. 30分間400×gでサンプルを遠心。
3. PBMCをプラズマと曇った白色層として見フィコール - ハイパックとの間のインタフェースに定住しているでしょう。滅菌したトランスファーピペットを使用して、PBを収集1 15ミリリットルコニカルチューブにMCを。 DPBSを用いて10 mlにボリュームを持参してください。
4. 血球計を使用して、PBMCをカウント。
5. ピペットで5分間300×gで別々の15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に2×10 ⁶のPBMC。 90％ウシ胎児血清（FBS）/ 10％ジメチルスルホキシド（DMSO）中で2×10 ⁶のPBMC / mlの濃度で残存する細胞凍結スピンダウンする。
6. QBSF 60無血清培地（光から保護）+ペニシリン/ストレプトマイシン（1％）+アスコルビン酸（50 ng / ml）を+細胞因子（SCF、50 ng / ml）を+インターロイキン3（IL-幹：増殖培地を準備3、10 ng / ml）を+エリスロポエチン（EPO、2 U / ml）を+インスリン様成長因子1（IGF-1、40 ng / ml）を+デキサメタゾン（1μM、光から保護し、新鮮なアリコートを解凍し、各メディア変化する）。
7. 作りたての拡張培地2mlおよび再懸濁2×10 ⁶ PBMCを12ウェル組織培養プレートの1ウェルに置き、5の雰囲気を37℃の加湿インキュベーター中でインキュベート％O _{2、5％CO 2、90％N 2。}
8. 3日目と6日目に、培地を交換してください。
   1. 細胞を回収し、残りの細胞を収集するためにQBSF-60の2ミリリットルとよく洗う。
   2. 5分間300×gで細胞懸濁液を遠心し、上清を吸引除去する。
   3. 新しい増殖培地2mlに細胞を再懸濁し、同じ12ウェルプレートに戻す。

ヌクレオ2.リプログラミング細胞 - 9日目

1. 滅菌した1.5mlのエッペンドルフチューブ（ 表1）に再プログラミングプラスミドをピペット。
2. 滅菌1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに補足（メーカーにより供給）とピペットでヌクレオソリューションを混ぜる。
3. ピペット2加湿37℃インキュベーター中で12ウェルプレートの場所の1つのウェルに増殖培地（5％O _{2、5％CO 2}および90％N _2）の前に細胞を添加する平衡化のための溶液。
4. 集める培養した細胞と、残りの細胞を収集するためにQBSF-60の2ミリリットルとよく洗う。
5. 5分間300×gで細胞を遠心し、上清を吸引除去する。
6. DPBS 5mlに再懸濁し、5分間300×gで遠心分離して細胞を洗浄する。
7. 上清を吸引除去する。
8. 生成気泡を避けるように注意しながら、クレオ液+サプリメント100μlの細胞ペレットを再懸濁する。
9. 、リプログラミングプラスミドを含有するチューブに細胞懸濁液をピペットピペット上下回、およびヌクレオキュベットの底にサンプルをピペット。
10. クレオマシンにキュベットを配置し、プログラムのT-019を実行します。
11. クレオキュベットに（ステップ2.3で平衡化プレートから）予め温め拡大培地100μlを移す。
12. すぐに予め温め増殖培地のウェルにサンプル全体と預金を集める。白、フローティング死んだ細胞の破片を集めることは避けてください。
13. 成長のために加湿した37℃インキュベーター（5％O _{2、5％CO 2、90％N 2）}にプレートを置き。

3.メッキフィーダー細胞 - 10日または11

1. 10日目に、プレートフィーダー細胞。
   1. ゼラチンコート1 6ウェル組織培養プレート。
      1. プレートの各ウェル中にハンクス緩衝生理食塩溶液（HBSS）中の0.1％ゼラチンのピペットから1m
      2. 少なくとも5分間、加湿した37℃のインキュベーターでプレートを置きます。
      3. 使用直前に、プレートからゼラチン溶液を吸引する。
   2. 予め温めMEF培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ FBS（10％）+ペニシリン/ストレプトマイシン（1％））の10ミリリットルに3000 cGyをで照射し、2×10 ⁶マウス胚線維芽細胞の1バイアルを解凍する。
   3. 5分間300×gで細胞を遠心し、上清を吸引除去する。 12 MEF培地mlのピペット2mlに細胞を再懸濁Iゼラチンコート6ウェルプレートの各ウェルNtoの。 12日目まで、加湿した37℃インキュベーター（5％O _{2、5％CO 2、90％N 2）}にプレートを置き。

4.フィーダー細胞上で細胞をプレーティングし、培地を交換 - 12日目

1. 1 15ミリリットルコニカルチューブにヌクレオフェクト細胞を収集し、QBSF-60の2ミリリットルとよく洗浄することにより、残った細胞を収集します。 5分間300×gでサンプルを遠心。
2. 準備再プログラミング中：イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）+ FBS（10％）+非動物L-グルタミン（1mM）を+非必須アミノ酸（NEAA、1％）+ペニシリン/ストレプトマイシン（1％）+β β-メルカプトエタノール（0.1ミリモル）+塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF、摂食、10ng / mlの新鮮な追加）+アスコルビン酸（摂食、50μg/ mlの新鮮な追加された）。
3. 上清を吸引し、リプログラミング培地12ミリリットルで細胞を懸濁します。細胞懸濁液をウェルあたりピペットを2mlにフィーダー細胞の6ウェルプレート（セクション3で調製した）。室温で30分間、50×gでプレートを遠心する。
4. 成長のために加湿した37℃インキュベーター（5％O _{2、5％CO 2、90％N 2）}にプレートを置き。 IPSCコロニーは（1-2週間）に出現し始めるまで、一日おきにリプログラミングミディアムに変更します。
5. 準備したhESC培地：DMEM / F12 1：1 +ノックアウト血清代替（20％）+ペニシリン/ストレプトマイシン（1％）+ NEAA（1％）+非動物L-グルタミン（1mM）を+ピルビン酸ナトリウム（1％） +炭酸水素ナトリウム（0.12％）+βメルカプトエタノール（0.1 mM）の+のbFGF（給餌、10ng / mlの新鮮な追加）
6. HDAC阻害剤を準備します（給餌で​​新鮮な追加、100μM）酪酸ナトリウム、suberanilohydroxamic酸（SAHAは、200 nMの、給餌で新鮮な追加された）。 IPSCコロニーが出現したら、毎日培地を交換、hESCの培地+ HDAC阻害剤で細胞を供給し始める。
   NOTE：ナトリウム酪酸プラスチックチューブに吸着する小分子であり、tはherefore 4℃でホウケイ酸ガラス管に入れて保管してください。

5.切り分けIPSCクローン

1. IPSCのコロニー（20-25細胞）を単離するのに十分な大きさになったら、P20ピペットでそれらを選ぶ。
2. HDAC阻害剤の準備：酪酸ナトリウム（給餌、100μMで新鮮な追加された）を、SAHAは（摂食、200 nmで新鮮な追加）
3. のhESC培地+ HDAC阻害剤+クローニングとリカバリサプリメントを含む個々の35mm皿でiMEFs上に分離したコロニーを置きます。
4. コロニーをピッキングした翌日には、ヒトES細胞培地+ HDAC阻害剤に培地を変更します。
5. IPSCコロニーは継代のために準備が整うまで、毎日培地を変更してください。
6. コロニーが継代2-3で安定いったん媒体からHDAC阻害剤を除去します。

Results

三日後、およびヌクレオiMEFsにヌクレオフェクト細胞を播種する前に、成功したヌクレオの効率は、eGFPのために蛍光顕微鏡によって推定されるべきである。 図1のeGFPを発現する全細胞集団の約5〜10％の典型的なヌクレオ実験を示す。

再プログラムIPSCコロニーは約2週間後にヌクレオ表示されるようになります。コロニーが明確に定義された境界線を有するほぼ円形であり、高い核-細胞質比、（2）可視小体（ 図2、明視野）（1）小さい、密に詰まった細胞を含む特徴的なhESC形態によって同定することができる。不完全に再プログラムされた細胞が劣化したり、容易に真のIPSCコロニーとは区別される不均一な細胞塊を形成することになるのどちらか。

我々は完全に特徴づけるために選択した代表的な株のうち、すべては、sを表現tandard多能性マーカー（ 図2）、（図2）の内因性多能性遺伝子を再活性化、およびフォーム奇形腫NOD-SCIDマウスに注射した...

Discussion

このプロトコルを使用するときに成功したIPSCの生成のために、考慮すべきいくつかの重要な注意事項があります。偏差が目標前駆細胞集団の非効率的な刺激およびIPSCの生成の低い効率につながる可能性がある赤芽球の膨張段階で、培地交換スケジュールは厳密に従わなければならない。各培地交換新鮮デキサメタゾンで新しい増殖培地を作ることが重要である。そしてQBSF-60基本培地およびデキサメタゾンは、貯蔵中に光から保護されるべきである。ヌクレオ中、DPBS洗浄は広範な細胞死を生じる、アークヌクレオから電流が発生することがあり、細胞懸濁液から過剰の溶質を除去することが重要である。約10日後にヌクレオ、プレートはIPSCコロニーの外観のために毎日検査しなければならない。いくつかの小さなコロニーが存在していると、リプログラミング培地はprolongeとして（HDAC阻害剤で）のhESC中]に変更する必要があります血清に対するdの曝露は、自発的な分化を誘導することができる。

実験用のセットアップおよび使用可能なリソースに応じて、プロトコルへの変更が考えられる。低酸素状態は、IPSCの生成¹³

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	°Cで保存してください。
DPBS	Life Technologies	14190-250	4°Cで保管。
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	4°Cで保管
ウシ胎児血清(FBS)	Life Technologies		10437028-20°Cで保存。必要な場合までC。解凍、アリコート、4°Cで保管します。
ジメチルスルホキシド(DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	室温で保存してください。
QBSF-60 無血清培地	フィッシャーサイエンティフィック	50-983-234	4°Cで保存
ペニシリン/ストレプトマイシン	Life Technologies 15140122		4°Cで保存
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VCA-1003	°Cで保存します。
2%ゼラチン溶液	Sigma-Aldrich	G1393	4°Cで保存。C、37°Cで液化します。使用前のCウォーターバス。
ハンクスバランス生理食塩水(HBSS)	Life Technologies	14175-103	4°Cで保管します。
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)	Life Technologies	11965-092	4°Cで保存
Iscoveの変更されたDulbeccoの媒体(IMDM)	Life Technologies	12440-061	4 °Cで店。
L-グルタミン、200 mM	Life Technologies	25030-081	アリコート、-20°Cで凍結。
非必須アミノ酸(NEAA)、100X	Life Technologies	11140-050	4°Cで保管。C、光から離れて。
DMEM/Ham's F12、1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	4°Cで保存
ノックアウト血清交換	ライフ	テクノロジー10828-028	アリコート、-20°Cで凍結します。
ピルビン酸ナトリウム、100 mM	Life Technologies	11360-070	4°Cで保存。
重曹、7.5%	Life Technologies	25080094	4°Cで保存。
基本的な線維芽細胞成長因子(bFGF)	Life Technologies	PHG0263	DPBSに10 mg / mlのストックを作成し、分注し、-20°Cで凍結します。解凍後、4°Cで保存します。
酪酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	B5887-1G	DPBSで2000倍ストック(400 mM)を製造し、分注し、-20°Cで凍結します。解凍後、4°Cで保存します。
hES細胞クローニング&リカバリーサプリメント	ステムジェント	01-0014-500	-20°Cで販売。必要な場合までC。解凍後、4°Cで保存します。
ESC認定のBDマトリゲル	BDバイオサイエンス	35-4277	上で4°Cで一晩解凍します。C、事前に冷却したピペットチップを使用して、事前に冷却したチューブに分注します。-20°Cで保管します。必要な場合までC。4°Cで解凍します。C、すぐに使用してください。
ステムスパンSFEM	STEMCELL Technologies	9650	アリコート、-20°Cで凍結します。
アスコルビン酸、粉末	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	DPBSに5 mg / mlのストックを作り、滅菌フィルター、4°Cで保存します。
組換えヒト幹細胞因子(SCF)	R &Dシステム	255-SC-010	100 μSFEMのg / mストック、アリコート、-20°Cで凍結します。解凍後、4°Cで保存します。
組換えヒトインターロイキン3(IL-3)	R &Dシステム	ズ203-IL-010	100 μSFEM中のg / mlストック、アリコート、-20°Cで凍結します。解凍後、4°Cで保存します。
エリスロポエチン(EPO)	R&D Systems	287-TC-500	SFEMで1000 U/mlの在庫を作り、分注し、-20°Cで凍結します。解凍後、4°Cで保存します。
組換えヒトインスリン様成長因子1(IGF-1)	R &Dシステム	291-G1-200	100 μSFEM中のg / mlストック、アリコート、-20°Cで凍結します。解凍後、4°Cで保存します。
β-メルカプトエタノール	Sigma-Aldrich	M7522	DPBSで1000倍ストック(100 mM)を作ります。
デキサメタゾン	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Make 50x stock (50 μM)DPBSでは、滅菌フィルター、4°Cで保存します。
SAHA(ボリノスタット)	ケイマンケミカル	149647-78-9	DPBSで2,000倍ストック(400 mM)を作り、分注し、-20°Cで凍結します。解凍後、4°Cで保存します。
12ウェル組織培養プレート	フィッシャー・サイエンティフィック	08-772-29
15 ml 円錐管	Sarstedt	62553002
1.5 ml エッペンドルフ管	フィッシャー・サイエンティフィック	05-408-129
6 ウェル組織培養プレート	フィッシャー・サイエンティフィック	08-772-1B
35 mm ティスエ培養プレート	BD Biosciences	353001
10 ml 使い捨て血清ピペット	フィッシャー・サイエンティフィ	13-675-20
5 ml 使い捨て血清ピペット	フィッシャー・サイエンティフィック	13-675-22
2 ml 使い捨て血清ピペット	フィッシャー・サイエンティフィ	13-675-17
20 μl ピペットチップ、バリアチップ	Genessee	24-404
ガラスパスツールピペット	フィッシャーサイエンティフィック	13-678-20D
ピペットエイド	フィッシャーサイエンティフィック	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624