脳はよくインビトロまたは異所性の分析によって示されていない資質を持つユニークなサイトです。再現性のある場所および成長特性を有する同所性マウスモデルを確実に定位固定装置及び低圧シリンジポンプを用いて頭蓋内の注射を使用して作成することができる。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
特に脳のようなユニークな生理学的および建築資質を持つサイトにインビトロおよび異所性モデルができない-同所腫瘍モデルは、生きた動物のコンテキストで、現在で介入することなく、腫瘍の種類の特性を研究するための最良の方法です。そのような血管系、血液脳関門、代謝、薬物送達および毒性、およびその他の関連要因のホストなどの機能を占めている。同所性モデルもそれらの限界を持っているが、関心のある適切な手法腫瘍細胞を正確にはヒトの脳において最も密接に模倣する条件組織に移植することができる。一貫性の速度および圧力で正確に測定された容積を正確に定義するための場所を提供する方法を採用することにより、予測可能な成長速度を有するヒト脳腫瘍のマウスモデルが再現可能に作成され、さまざまな介入の信頼できる分析のために適切であることができる。ここに記載されているプロトコルは、TEに焦点を当てて設計および頭蓋内注射の準備、手術を行うと、成功したと再現性の腫瘍の成長を確保し、異なる脳の腫瘍モデルの範囲に合わせてカスタマイズすることができ、さまざまな条件のための出発点を提供するchnical詳細。
概要
脳腫瘍細胞のインビトロ研究は、増殖、生存、遊走、および癌細胞の浸潤を駆動する分子メカニズムを解剖するための非常に貴重である。培養細胞実験は、シグナル伝達経路を定義する潜在的な治療標的が示唆され、薬物治療に対する細胞応答を特徴付けることができる。しかし、in vitroでのシステムは、医薬品への生物の応答を予測するのはあまりにも単純化している。それらは生理的反応、免疫応答、細胞微小環境、および動物生体系の全体的な不均一性を欠いている。臨床観察を1に動物モデルを比較する際の重要な相違をもたらし、人間のプロセス内のイベントを再現しないことが可能な場合、遺伝子操作さのモデルは、非常に貴重なことができますが、分子の違いは種とマウス細胞の間に存在する。脇腹の皮下にヒト脳腫瘍細胞株の皮下（SQ）注射を含むマウス異種移植片モデルは、実行が容易であるおよび測定;彼らは、遺伝子改変および薬物投与/送達、代謝および毒性の影響に対処するために使用することができる。重大な欠点は、しかし、SQモデルの有用性を制限する。微小環境は、天然に存在する脳腫瘍の再現しない：さまざまな細胞型および組織の相互作用を;脳に特有のローカルな血管系、および無数の他の要因は複製することはできません。より正確に、天然に存在する脳腫瘍のユニークな環境を再現し、医薬品介入の効果をテストするには、マウス同所モデルが利用されるべきである。また、同所技術が人間の主要な非癌性細胞（分化した細胞または前駆）遺伝子操作....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
すべての記載された手順を見直し、当社の制度的動物管理使用委員会によって承認された。
1実験を計画
- 噴射すべきセルを選択してください。接着細胞培養株、遺伝的に改変されたクローン、神経前駆細胞、初代培養、または脱凝集性腫瘍：さまざまなソースからの細胞を注入するための候補である。希望モデルのタイプは、注射の最も適切なサイトを定義します。
- 注射のための細胞数を決定します。腫瘍を形成するのに必要な細胞数は、細胞株に応じて変化し、経験的に決定されなければならない。腫瘍増殖速度は、細胞型、細胞数および組織培養継代回数に大きく依存する。 1×10 4〜2×10 5以上の注射ごとに複数に及ぶ細胞数を変化させ、成長率の腫瘍を作り出した。
- 注射のためのボリュームを制限します。細胞は、無血清培地またはリン酸緩衝sの最小の容積に懸濁されるべきである26 G針を滑らかで、容易な通過を可能にアリーン（PBS）が挙げられる。小さい体積は、実際に、脳内に送達より正確で得られた腫瘍を定義し;最適な結果は、3〜6μlの範囲の容積を注入することによって得られる。混合サンプリング、正確な測定を可能にするために関係なく、計画された注入回数を、懸濁した細胞の少なくとも50μlの最終全体積を準備することを計画。
- モデルに適したマウスを選択してください。ヒト腫瘍のマウスモデルは、典型的には、免疫媒介性移植片拒....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
信頼性の高い頭蓋内異種移植片は、この記載された技術を使用して作成することができます。マウスの頭蓋骨（ 図1）の重要な構造を識別することはブレグマの認識を可能にし、正確で再現性の注入場所に調査員を案内します。これらの研究ではU251親系統は、ルシフェラーゼ（U251-Luc）、ノまたはU87でトランスフェクトしたU251細胞は、ヒトGBM組織培養細胞はSF-DMEMの4〜6μlの懸濁した不死化し、2.5ミリメートル（右）側方、1.5mmの前方に注入ブレグマに対して、3.5mmと腹側（ 図2）。
得られた腫瘍は視覚化及び磁気共鳴イメージング（MRI、 図3）、 インビボでの発光イメージング（IVIS、 図4）、またはルーチン肉眼的病理技術（H＆E染色、 図5）により分析することができる。 appropriaを決定するために特に注意を払わなければならないと最適化を実施テ細胞および注入の位置は、所望のタイ.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
ヒト脳癌の同所性マウスモデルは、臨床治療の有効性を評価するための優れたツールであるが、脳組織内の細胞の配置を最適化するために注意しなければならないことができる。腫瘍の大きさの研究過度のアリコート量、準最適な注入技術及び性急な注入速度が漏出し、望ましくない場所での腫瘍細胞の出現をもたらし得ることが示されている（脳室、脊髄、硬膜外の領域など ）と高変動2（個人的な観察）。非細胞サンプルのマイクロプロセッサ駆動型配信の分析は滑らかで均一な配信と一貫性のある圧力3に起因する、マイクロポンプの使用がより合焦点配達、より少ないサンプル逆流と注入の手動方法よりも変動を生じたことを発見した。それは、わずか2または4μlの容量で定位固定装置とアライメントコンソール当量の使用を必要とされる細胞の数を凝縮させるために挑戦することができるがプログラム可能なマイクロポンプでuipped同様の増殖率と再現性と信頼性の高い腫瘍をもたらすことができる。異種移植モデルは、本当に、特に免疫不全のホストと、天然に存在する腫瘍の微小環境、開始と発展を複製ことはできませんが、よく設計され、実装同所モデルが最善の選択肢.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは、開示することは何もない。
謝辞
博士はキーティングは、DODのグラントCA100335によって資金を供給し、聖剣帯の財団奨学生です。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| デジタルディスプレイコンソール付き小動物定位固定装置器具 | Kopf | モデル940 | |
| マウスガス麻酔ヘッドホルダー | Kopf | モデル923-B | |
| マウスイヤーバー | Kopf | Medel 922 | |
| イルミネーター | フィッシャー12-562-36 | ||
| UltraMicroPump III | WPI | UMP3 | |
| Micro4 マイクロプロセッサ | WPI | UMC4 | |
| 可変速ハンドヘルドロータリードリル | ドレメル | モデル300 | |
| 歯科用ドリルビット、1.0 mm | スポエルティング | 514554 | |
| 歯科用ドリルビット用アダプター:3/32インチコレット | ドレメル | 481 | |
| 加熱パッド | |||
| マウス用 | イソフルラン気化器システム | ||
| イソフルラン気化器を定位固定装置フレーム | |||
| InstrumentsPrecision 25 μ | |||
| l マイクロシリンジ | ハミルトン | 7636-01 | モデル702、針なしマイクロ |
| シリンジ針、26s G | ハミルトン | 7804-04 | RN、25 mmポイントスタイル2 |
| 先端の細いはさみ(ストレート、シャープ/シャープ) | |||
| 中型の標準ハサミ | |||
| 標準鋸歯状鉗子 | |||
| 鋸歯状止血剤 (2) | |||
| 先端の細い鉗子 | |||
| Supplies | |||
| Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon) | MWI | J463G | |
| 外科用ブレード #10, ステンレス (フェザー) | Fisher | 296#10 | |
| イソフルラン (フルリソ) | VetOne | NDC 13985-528-60 | アイテム#502017。液体吸入麻酔薬。連邦法は、この薬を認可された獣医師によって、または獣医師の命令で使用することを制限しています。 |
| カルプロフェン(リマジル注射剤50mg / ml) | ファイ | ザーNDC 61106-8507-01 | 食塩水で希釈 |
| 科軟膏(人工涙液) | ラグビーNDC 0536-6550-91 | ||
| 局所抗生物質(AK-Poly-Bac) | Akorn | NDC 17478-238-35 | |
| ポビドンヨード局所消毒薬、10%(ベタジン) | ベタジン | NDC 67618-150-04 | |
| 過酸化水素、30% | フィッシャー | 頭蓋骨のランドマークを視覚化するための | H325-100 |
| 滅菌生理食塩水 | VetOne | NDC 13985-807-25 | 希釈液、洗浄組織 |
| 骨ワックス | WPI | アイテム #501771 | |
| 滅菌ドレープ | McKesson | 25-517 | |
| 滅菌手術用手袋 | McKesson | (適合する) | |
| 滅菌ガーゼパッド、2 x 2 | フィッシャーブランド | ||
| 22028556 滅菌ガーゼパッド、4 x 4 | フィッシャーブランド | 22-415-469 | |
| アルコール調製パッド(中) | PDI | B603 | |
| 滅菌綿先端アプリケーター | フィッシャーブランド | 23-400-114 | |
| 滅菌 0.5 ml スクリューキャップチューブ 細胞用キャップ | USA Scientific | 1405-4700 | 細胞用 |
| 個別包装滅菌ディスポピペット | フィッシャー | BD 357575 | 針洗浄液用 |
| BD インスリン注射器 針付き | 鎮痛剤用 | フィッシャー | 329461 |
| 洗浄用 | 70%エタノール | ||
| 洗浄用滅菌 diH2O | |||
| 針洗浄液 | 用マイクロチューブ | ||
| 蓋骨マーキング用 | フェルトペン(専用) | ||
参考文献
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nature reviews. Cancer. 10, 470-480 (2010).
- Yamada, S., et al.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
