タンパク質分解の体系的な分析のためのレポーターベースの成長アッセイ

サマリー

ここでは、ユビキチン-プロテアソームシステムによるタンパク質分解の相対的な速度を定量化するための堅牢な生物学的アッセイについて説明します。アッセイの読み出しは、液体培養における酵母の増殖速度であり、これは必須代謝マーカーに融合した分解シグナルを含むレポータータンパク質の細胞レベルに依存します。

要約

ユビキチン - プロテアソーム系（UPS）によるタンパク質分解は、すべての真核生物におけるタンパク質ホメオスタシスのための主要な調節機構である。細胞内タンパク質分解を決定する標準的なアプローチは、タンパク質の減少の速度論に従うための生化学的アッセイに依存している。そのような方法は、多くの場合、面倒で時間がかかり、複数の基板や劣化状態を評価することを目的とした実験に、したがって適していない。別の方法として、細胞増殖に基づくアッセイは、定量的にタンパク質レベルの相対的変化を決定することができないそれらの従来のフォーマット、エンドポイントアッセイであることが、開発されてきた。

ここでは、忠実に酵母細胞増殖速度にそれらを結合することによって、タンパク質分解速度の変化を決定する方法を説明する。この方法は、URA3のウラシル要求性酵母細胞が外因的に発現されるレポータータンパク質によって救助され-deleted確立選択システムに基づいています、本質的なURA3遺伝子および分解行列式（デグ）の間の融合から成る。レポータータンパク質は、その分解速度は、デグロンによって決定され、一方、その合成速度が一定になるように設計されている。ウラシル欠損培地における細胞増殖はUra3遺伝子の相対的なレベルに比例するように、成長速度は、レポータータンパク質の分解に完全に依存している。

この方法は、正確に細胞内タンパク質分解速度の変化を測定する。 （a）は、E2結合酵素の構造と機能は、（c）の同定と新規デグロンの特性を分析し、タンパク質分解、（b）は、既知のユビキチン結合因子の相対的寄与を評価する：これは、に適用した。それはまた、他の細胞経路の機能に関連するタンパク質レベルの変化を監視するに適合させることができるようにdegron- URA3ベースのシステムの適用は、タンパク質分解フィールドを越え。

概要

ユビキチン - プロテアソーム分解系は、全ての真核生物におけるタンパク質恒常性の維持に関与している主要な調節機である。 UPSは、最初にポリユビキチン標識タンパク質は26Sプロテアソームによって分解された後、標的タンパク質に複数のユビキチン分子をコンジュゲート。ほとんどの場合、ユビキチン媒介性分解のための律速段階は、E2は酵素を結合させると、E3は酵素（E3リガーゼ^）1を連結することによって仲介される、基質ユビキチン化である。結果的に、特定のタンパク質の細胞内安定性は、ユビキチン抱合とその同族ユビキチン化酵素の活性に対する感受性を反映している。

E3リガーゼは、UPSの主な基質認識コンポーネントです。このように、これらの酵素は、その安定した対応²で露光存在しないかのいずれかであるそれらの基質内デグロンを認識する。細胞周期mの例えば、多くの規制当局USTのために細胞周期の進行を維持するために一時的に特定の方法で合成され、分解される。これらのタンパク質の分解は、多くの細胞シグナル調節キナーゼ^3,4によって媒介されるリン酸化によって制御される。一方、異常に折り畳まれたタンパク質は、不可解なデグロンを通じて認識される。これらは通常、天然の構造に隠されていると構造摂動時にさらされている領域である。このようなデグロンは、疎水性ドメイン^5-7と本質的に無秩序セグメント^8が含まれ^ています。

網状赤血球溶解物⁹でのファンダメンタルズのタンパク質分解および特性のためのユビキチンシステムの独創的発見以来、酵母遺伝学は、ユビキチンシステム¹⁰の構成要素の多くを発見に尽力した。 UPSによるタンパク質分解の体系的な分析のためのモデル生物として酵母の成功は、UPSが高いという事実に主に起因しているLyは実験システムとしての従順と相まって、すべての真核生物において保存^4。実際、酵母ベースのシステムは、一般的にユビキチン化機構の作用メカニズムを解読するために使用される。

生化学的手段によってタンパク質分解を研究することは、通常、細胞抽出物の調製を必要とします。動物細胞タンパク質、タンパク質相互作用及び機能を維持する比較的穏やかな条件下で抽出することができるが、酵母¹¹ロバスト細胞壁の存在は、タンパク質の回収に影響を与える可能性がかなり厳しい破壊条件を必要とする。実際、酵母細胞破壊のための異なる手順が正しく、それらの相対的な細胞豊か​​さを表す量で完全なタンパク質を回復する能力がかなり異なる。さらに不正確さは特定のタンパク質の分解速度を決定するために使用されるメソッドの違いに固有のものである：イム続く代謝標識ベースの「パルスチェイス」実験munoprecipitation、特異的タンパク質^12を単離するために、多くの場合、厳密に定量的ではない。タンパク質の分解は、この方法によって比較されたときにこのようにして、余分な注意が結果の解釈に注意すること。この欠点を回避するために、代替のシクロヘキシミド（CHX）追跡アッセイは^、12を用いることができる。このアッセイでは、翻訳阻害剤は、細胞培養物に添加し、タンパク質の定常状態レベルの時間的変化は、続いてモニターされる。タンパク質合成の長期の阻害は、細胞傷害性であるようにもかかわらず、CHXの使用は、比較的短い半減期（<90分）を有するタンパク質に限定される。注目すべきことに、上記のアッセイの両方が常に利用可能でないタンパク質に特異的な抗体の使用を必要とする。

これらの技術的限界を克服するために、研究者は、細胞抽出と直接タンパク質の処理を必要としないいくつかのアプローチを開発しました。 1つのアプローチは栄養要求まことにの確立に基づいています必須の代謝酵素をコードする遺伝子の欠失によって得られる目株。このような遺伝子は、OMPデカルボキシラーゼをコードHIS3、LEU2、LYS2およびTRP1、アミノ酸生合成に必要な酵素のための符号化、並びにURA3（のUra3）、ピリミジンリボヌクレオチド生合成の重要な酵素が含まれる。 URA3広くタンパク質分解の研究で使用されている。これらのアッセイでは、のUra3の構成的発現は、ウラシル欠損培地中で¹³ URA3細胞の増殖を救出。その結果、デグロンの融合を通してのUra3を不安定するとウラシルを欠く最小培地で細胞増殖を減少させることができる。この方法は、劣化の識別を含む、様々なタンパク質分解研究で⁵決定基に使用されている、E3は¹⁴リガーゼ補助ユビキチンは¹⁵因子および新規UPSのデグロン¹⁶の発見。これらの方法の全ては、アッセイの読み出しとして、寒天プレート上の細胞増殖を用いた。ただし、tは彼の成長基準（ポジティブ/ネガティブの成長）、堅牢で効率的な、ほとんどが定性的であるとデグの効力または種々の補助劣化要因の相対的寄与を評価するために重要である定量的情報を提供していませんしながら。

そこで開発され、融合系-degron URA3によるタンパク質分解の体系的かつ定量的な分析を可能にする酵母ベクターおよびスクリーニング方法を利用している。プロトコルは、選択的条件下で液体培養物（GILS）および標準的な増殖曲線の生成に成長速度を測定扱いやすいアッセイに基づいている。ラグ、指数（対数）と固定相 - 酵母増殖動態は、3つの主要な相によって特徴づけられる。のUra3-デグロンの発現のレベルによって決定される選択条件下で対数期、中酵母複製動態の計算は、公平な定量的測定oをを提供fはタンパク質の分解。この方法は、複数の株に同時に複数のUPS基質の分解速度を測定し、比較することと、様々な条件の下で適用することができる。

プロトコル

1.細胞培養

1. （a）は、URA3 -degron融合プラスミドの選択および維持のために、（b）は、付加的な代謝マーカーを含むプラスミドと、そのようなTry467（ 表2）のような適切な栄養要求性酵母細胞を形質転換する。
   注：適切なプラスミドの例はYDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-URA3（LYS2）（Deg1- UV）である。これはDeg1の含む融合タンパク質を含有する酵母組込みプラスミドである-酵母転写に由来しデグロン。係数MAT2 ^17、FLAGエピトープ-安定ERタンパク質、およびURA3 ^15,18（ 図3A） -イムノブロッティング、Vma12による検出。 （この研究でかつ適切なプラスミドのその他の例に用いられたプラスミドについては、表3を参照してください。）
2. プラスミドの選択および維持のために、アミノ酸の選択マーカーを欠いた適切な定義合成（SD）培地の下で寒天プレート内の細胞を保つ 19まで（例えば、Deg1 -UVは、SD-LYS選択培地で選択され、維持される）。
3. 定常期に達するまで、プラスミド維持のための適切な選択SD培地で30℃で細胞をO / Nを成長させる。検査されるべきサンプルの数（セクション2）に応じて、試験管内または96ウェルプレートに細胞を増殖させる。

分析のための2.細胞調製

1. サンプル（N≤15）の少数をアッセイする場合には、細胞を希釈し、以下のように培地を交換する。
   1. 96ウェルプレート（透明底）にウェルあたりSD培地150μlでO / N培養から細胞50μlを希釈する。ブランクは、培地のみを含むもので注意、最初のサンプルが指定される。
   2. マイクロプレートリーダーを用いて96ウェルプレート中の試料のOD ₆₀₀値を決定します。
   3. WHから、希釈係数（×4）でOD ₆₀₀読み取り値を乗算することにより、各ウェル内の実際のOD _600を計算するICH空白読書の値が減算される。ランベルト·ベールの法則に従って計算さ1cmの経路長を得るために、0.55で割ることによって得られた値を正規化する。標準的な96ウェルプレート中の細胞を200μlのOD _600を測定する際に注意し、この値は一定である。
   4. 0.25のOD _600を 、エッペンドルフチューブに移すために相当する量で、酵母細胞を得るために必要な正確な量を計算する。
   5. 1分間、高速（12000×gで）で細胞をスピンダウン。
   6. 0.25のOD _600を得るために、（セクション3.1を参照）上清を除去し、適切な選択培地の1ミリリットル中に細胞を懸濁します。
   7. 96ウェルプレート中の新しいウェルに希釈された菌株の200μlのを転送します。
2. サンプル（N> 15）の多数は、試験しようとする場合、細胞を希釈し、以下のように、前のOD ₆₀₀を測定することなく、培地を交換する。
   1. 静止細胞の10μlのを転送（セクション3.1を参照）、適切な選択培地190μlの（希釈1:20）を含む新しい96ウェルプレートに96ウェルプレートに、O / Nで増殖させた。

選択条件下で液体培養3.成長動態（GILS）

1. のUra3-デグロンレポーターを用いた成長測定のために、次のメディアを使用します。
   1. 非制限的な条件の下で酵母増殖のポジティブコントロールのための、（セクション1.2を参照）、プラスミドの選択SDメディアを使用しています。ないプラスミドの選択が必要でない場合、例えば、Deg1 -UV、必要なすべてのアミノ酸（完全なSD）を含有するSD培地として組込みプラスミドを使用するときに使用することができる。
   2. 制限された条件下での増殖を測定する実験試料については、SD-URA培地を使用しています。
2. マルチモードマイクロプレートリーダーの設定：15分間30℃で、OD ₆₀₀の測定間隔のインキュベーション温度、1分毎に7分の軌道と線形振盪サイクル
   注：このデュアルモード揺れ、細胞の均一な分布が得られるように最適化された。しかし、他の揺れモードやさえなしに振とうも同様に動作する可能性があります。
3. 30℃で細胞をインキュベートし、マイクロプレートリーダーO / Nまたは細胞が静止期（12~24時間）に達するまで。
4. スプレッドシートファイルに生データをエクスポートします。
5. （;詳細はセクション4を参照するための最小限の倍加時間（MDT））細胞がその人口規模を倍増するためのMDTcalc、（時間で）最小限の時間を計算し、カスタマイズされたソフトウェアプログラムを使用して、酵母の増殖速度を決定する。

最小限の倍加時間（MDT）4.計算：MDTcalcアルゴリズムの原則

NOTE：MDTcalcアルゴリズムの原理は、SD完全培地中で増殖させTry467酵母細胞（ 表2）の代表的なサンプルを使用して、データスプレッドシート、および成長のプロットを示し、 表1および図1に示されている、のrespectively。

1. サンプルウェルで得られた測定値のそれぞれから、それぞれのウェルにおいて得られたOD ₆₀₀空白値を、減算します。 0.55によって得られた差分を分割する（96ウェルプレートの場合）の光路長を補正する。最終的な値（ 表1、トランス）プロット時間に対して実際の酵母増殖曲線（OD ₆₀₀ /時間）（ 図1A）を生成する。
2. 非線形曲線（ 図1B）に対数増殖期に変換するために変換された値のそれぞれについてのlog _{2（OD 600）を}計算する。
3. 時間0で開始し、N <10（; 図1C、表1、スロープ）まで、一度に一つの時点を移動する10の時点間隔の傾きを算出する（N = 10）。
4. 倍増する細胞集団に要する時間が取得する各傾きの逆数の値を計算した（ 表1、1 /勾配; 図1C）。最小限の計算MDT（; 図1C、表1、黒い四角形）を決定する1 /スロープ値。選択された時間間隔からのサンプル中の細胞（ 表1、1 /スロープ、黒い四角形）について計算MDTを抽出する（赤い矩形によって概説表1、1B、1D図 ）。
   NOTE：SD-URA培地上での細胞増殖の速度は、MDTに反比例する。

5. MDTcalcの使い方

1. コンピュータ内の指定したフォルダに補充プログラムファイルをコピーします。
2. 成長データを含むスプレッドシートファイルを保存して閉じていることを確認してください。スタート画面が表示されます確認するMDTcalcアプリケーションプログラムを開きます。
   1. 図2に示されているように、必要な情報を挿入します。
      1. 「ファイルパス 'の下では、スプレッドシートファイルを検索するために右の四角形をクリックしてください。
      2. ここで、t 'シート名'の下では、スプレッドシートの名前を書く生データが置かれている彼。
      3. 「開始位置」の下では、スプレッドシートが最初のサンプルの時間0の座標挿入します。
      4. 「時間列」の下では、時点カラム（時間は秒単位で提供されるべきである）の場所を定義する文字を挿入します。
      5. 「空白列 'の下では、空欄（通常は必ずしもそうではない中で96ウェルプレートのA1）の場所を定義する文字を挿入します。
      6. 「OD値」の下では、MDT計算（通常は0.15〜0.25）の開始に必要な最小限の変換されたOD ₆₀₀値を選択します。 MDTのみ定義さOD ₆₀₀値以上に達した試料について計算されるように、この値を設定すると、過剰な希釈のラグフェーズにおける培養のためのMDTの計算を防止する。
   2. 最後の値が入力されると、画面の下部にある「計算」ボタンを押してください。右側のプログレスバーが徐々にgまで変化していることを確認してくださいREEN。計算プロセスの間、スプレッドシートファイルを開かないでください。
   3. スプレッドシートにMDT計算の完了時に画面上に自動的に表示されたデータの2セットをエクスポートします。最小限のOD値試験に合格するために、各ウェルの（a）MDT値（セクション5.2.1.6に設定されたように）とMDTを算出し、そこから間隔の（b）は、初期時点（スタート：データが含まれていることを確認時間）。

結果

レポーター基質の分解にDoa10経路の酵素の役割を調査する

それは伝統的な分解アッセイと比較したGILS方法の妥当性をテストするには。この実験は、ER-膜の成分の相対的な寄与を評価するローカライズされたタンパク質の品質管理レポーター基質Deg1- VU（ 図3A）の分解に対して^20,21複雑Doa10 E3リガーゼ。 Deg1- VUプラスミドは、 野生型細胞に、またはその後にCHXチェイスアッセイ⁶により決定されたE2結合酵素、UBC7（UBC7）及びタンパク質の安定性のための遺伝子を欠く細胞に組み込まれた。抗FLAGイムノブロットは、 野生型細胞 （ 図3B）には存在しなかったUBC7細胞において安定Deg1 -vuタンパク質バンドを明らかにした。 野生型細胞におけるDeg1

ディスカッション

ここでは、相対的な蛋白分解速度を決定するための細胞増殖に基づくアッセイを記載し、（GILS） '選択的条件下で液体培養での成長速度」と呼ばれる。 、これは、セットアップが簡単で、データ収集および解析は、簡単であり、それは非常にモジュール化されている：GILSアッセイは、いくつかの利点を有する。したがって、GILSハイスループットアプリケーションのための自動化に適応させることができる、ユーザフレンドリーなマルチウェルプレート形式で複数のサンプルを同時に適用することができる。最も重要なことは、GILSは非常に、再現性の定量的かつ堅牢なデータを提供し、陽性/陰性の増殖について選択寒天プレートに基づく成長アッセイよりも柔軟性があります。また、GILSは、関連するUPSコンポーネントまたはデグロンの活性を反映して、タンパク質分解速度または定常状態レベルの小さな変化を検出できるように非常に敏感である。最後に、GILSアッセイはgrowtと比較して有意に短い成長期（<12時間）を必要とする寒天プレート上の時間アッセイ（通常は2~4日）。

GILSアッセイは、タンパク質分解を研究す...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Difco 酵母窒素塩基 w/o アミノ酸および硫酸アンモニウム	BD Biosciences	233520	SD最小培地での酵母増殖用。 供給されるアミノ酸は次のとおりである: アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン
硫酸アンモニウム	シグマ - アルドリッチ	A4418
グルコース	シグマ - アルドリッチ	16325
アデニン	シグマ - アルドリッチ	A8626
ウラシル	シグマ - アルドリッチ	U0750
アミノ酸	最高利用可能な純度
96ウェルプレート	Nunc	167008	他の互換性のあるブランドは、
Cyclohexamide	シグマ - アルドリッチ	C7698	ワーキングコンク0.5 mg/ml
インフィニット 200 PRO シリーズ	テカン		酵母のインキュベーションやOD600測定用。他の互換性のある温度制御リーダーを使用できます。
MDTcalc			実験用ソフトウェア