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方法論記事

マウス胚のレトロウイルス感染は、造血分化の解析のための細胞由来の胚様体幹細胞

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DOI:

10.3791/52022

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2014年10月20日

 ,  ,  , 
1Harper Cancer Research Institute, 2Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine, 3Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

この記事について

サマリー

分化胚性幹細胞(ESC)における時間的遺伝子発現の操作は、誘導性遺伝子システムを使用して達成することができます。しかし、これらの細胞株の作製には費用と時間がかかります。このプロトコルは、ES由来細胞の分化における導入遺伝子の迅速な発現と、その後の下流の造血分化の解析を実現します。

要約

胚性幹細胞(ESC)は、細胞分化の分子メカニズムを解明するための優れたモデルです。これらは、初期の造血前駆細胞(HPC)の発生を調べるのに特に有用です。ESCにおける遺伝子発現は、発生における個々の分子の役割を決定することを可能にするいくつかの手法によって操作することができます。1つの問題は、特定の遺伝子の発現が、その時間的発現に応じて異なる表現型効果を持つことが多いことです。この問題は、ドキシサイクリン誘導性導入遺伝子システムなどの技術を用いて目的の遺伝子を誘導的に発現するESCを作製することで回避できます。しかし、これらの誘導性細胞株の作製には費用と時間がかかります。ここでは、ESC由来の胚様体(EB)を単一細胞懸濁液に分解し、細胞懸濁液にレトロウイルス感染させた後、吊り下げてEBを改質する方法を説明します。次に、下流の分化をフローサイトメトリーによって評価します。このプロトコルを用いて、ESC分化開始時のmicroRNA遺伝子の外来性発現がHPC生成をブロックすることが実証されました。しかし、新生中胚葉が産生された後にEB由来細胞で発現すると、マイクロRNA遺伝子は造血分化を促進します。この方法は、特定の胚葉組織を導出した後の遺伝子の役割を調べるのに有用です。

概要

マウス胚性幹細胞(ESC)は多能性であり、サイトカイン白血病阻害因子(LIF)1の存在下で未分化のままで自己複製します。LIFを抜くと、胚様体(EB)と呼ばれる3次元(3D)構造に自発的に分化します2。3Dアーキテクチャにより、外胚葉、内胚葉、中胚葉の3つの胚葉が発達し、後に成熟組織タイプ3が生まれます。ESCは、細胞分化の分子メカニズムを解明するための優れたモデルであり、特に初期の造血前駆細胞(HPC)4の発生の研究に優れています。

>jove_content5,6。また、遺伝子を過剰発現するために使用されている手法も数多くあります。ESCの遺伝子発現を改変するために使用された最初の技術は、組換えレトロウイルスにESCを感染させることであった7,8。しかし、目的の遺伝子は、ESCが前駆細胞と成熟細胞タイプに分化するため、しばしばサイレンシングされます。レンチウイルスの使用は、ウイルス発現遺伝子のサイレンシングを制限することに成功しています9。過剰発現に使用される他のウイルスベクターには、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス10が含まれる。さらに、発現プラスミドを安定的に導入するための標準的なトランスフェクション技術は、ESC導入遺伝子発現に広く使用されています11。これらのシステムの難点の1つは、特定の遺伝子の発現が、その時間的発現によって異なる影響を与えることが多いことです。例えば、Smad1タンパク質は、EB発生の異なる段階で造血細胞の発達に異なる影響を与える12,13。

この問題は、目的の遺伝子を誘導的に発現するESCの生成によって回避することができます。ESCで導入遺伝子を誘導的に発現させる最も一般的なシステムは、大腸菌(大腸菌)由来のテトラサイクリン耐性オペロンを使用します。いくつかの異なるテトラサイクリンシステムが開発されています。より人気のある戦略の1つは、Kybaと同僚14によって開発されました。彼らは、逆テトラサイクリントランスアクチベーター遺伝子が構成的に活性なROSA26遺伝子座に挿入されたESCライン(Ainv15)を作製しました。テトラサイクリン応答エレメント(TRE)、下流のLoxP部位(バクテリオファージP1由来のX-over P1の遺伝子座)、およびプロモーターレスネオマイシンカセットをX染色体上のHPRT(Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase)遺伝子座に導入しました。CRE組換えアプローチを用いて、ネオマイシン耐性遺伝子の発現を促進する真核生物プロモーターとともに、目的の遺伝子をLoxP部位に挿入することができます。正しくターゲットを絞った ESC は、G418 選択によって分離されます。次に、これらの標的クローンを、導入遺伝子のドキシサイクリン(またはテトラサイクリン)誘導性発現について試験する必要があります。このアプローチにより、HoxB4、Stat5、SCL、および Smad714-17 を誘導的に発現する ESC ラインの生成に成功しました。しかし、これらの誘導性細胞株の作製には時間がかかります。ここで説明する方法は、ESC由来の胚様体(EB)を単一細胞懸濁液に分解し、発生の異なる日に細胞懸濁液にレトロウイルス感染させ、その後、懸垂滴によってEBを改質する方法です。下流の分化は、後でフローサイトメトリーによって評価されます。この記事では、EB由来細胞におけるmiRNAの発現が造血分化にどのように影響するかの例を示します。この方法は、特定の胚葉組織を導出した後の遺伝子の役割を調べるのに有用です。

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プロトコル

1。胚様体（EB）の形成

  1. マウス胚線維芽細胞（MEFを）上で維持されているのESCをゼラチン適応させる。通路のESCのMEFを除去するために0.1％ゼラチンでコーティングした6ウェル組織培養プレートに3回。
    1. （ 表1）未分化の細胞を維持するためにLIFとESCの維持培地中で細胞を成長させる。細胞が80％コンフルエンスを超えないことを確認してください。低継代細胞（MEFから除去した後、10以下の継代）細胞分化のために使用します。
  2. ESCははEB分化培養する前日に、継代細胞がので、彼らは約50〜70％コンフルエント翌日になります。細胞の多能性を保持するためにESCの維持培地中で細胞を培養し続ける。
  3. 6ウェルプレートのウェルあたり：分化、吸引ESCの維持培地との日に1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（137mMのNaCl、2.7mMのKCl、11.9 mMリン酸緩衝液、pH7.4 PBS）で洗浄した。
    1. 0.25％tryps200μlのを追加します。EDTA /中各ウェルに加え、3分間37℃でインキュベートする。
    2. 分化培地を800μlのトリプシン/ EDTAを不活性化する。ブレークアップするための細胞を単一細胞懸濁液にP200チップで2ミリリットル中に上下にピペットで血清学的ピペット。メディアはピペット先端インターフェイス間で上がらないようにP200チップは端にぴったりとフィットしていることを確認してください。
    3. 上下にピペットで約5〜10倍。ピペッティング時に泡を作成しないように注意してください。
  4. を15mlコニカルチューブに細胞を移す。 PBSで10ミリリットルにボリュームを起動します。室温で5分間、315×gで遠心分離する。
  5. 上清を取り除きます。 LIFを含む残りのメディアを削除するには5ミリリットルPBSで2回洗浄する。各洗浄のためのステップ1.4のように遠心分離する。
    1. 分化培地（ 表2）2ml中の最終細胞ペレットを再懸濁。
  6. 血球計または細胞カウンターで細胞を計数10cmのペトリ皿中6,000-10,000細胞/ mlをプレート（非組織培養処理）。
    1. 各ESC株について経験的に正確な細胞/ mlを決定します。通常、細菌仕事や低付着プレートに使用する無菌のペトリ皿を使用してください。
      注：最良の分化の結果を得るには、EBをプレートに付着することなく、懸濁液中に残っている球体を形成すべきである。少なくともアドヒアランスを持つものを見つけるために、プレートのいくつかのブランドをテストします。
    2. 5％CO 2、37℃の組織培養インキュベーター中で分化するのESCをインキュベートする。
試薬 ストック 最終濃度 ボリューム 会社 カタログ番号
のDMEM 1倍 410ミリリットル S igma /アルドリッチ D5796
FBS（ES選抜し） 100％ 15％ 75ミリリットルハイクローン SH30070.03E
非必須アミノ酸 100X 1倍 5ミリリットルライフテクノロジーズ 11140
L-グルタミン 100X 1倍 5ミリリットルライフテクノロジーズ 35050
Penncillin /ストレプトマイシン 100X 1倍 5ミリリットルライフテクノロジーズ 15070
βメルカプトエタノール 14.3 M 114μM 4μlのシグマ/アルドリッチ M3148
白血病抑制因子（LIF） 10 7単位/ ml 千単位/ ml 50μlのミリポア ESG1107
ontent "> 表1：ESC保守メディア。

試薬 ストック 最終濃度 ボリューム 会社 カタログ番号
のDMEM 1倍 410ミリリットルシグマ/アルドリッチ D5796
FBS（ユーザーは、最適な分化についてスクリーニング） 100％ 15％ 75ミリリットルハイクローン SH30070.03E
非必須アミノ酸 100X 1倍 5ミリリットルライフテクノロジーズ 11140
L-グルタミン 100X 1倍 5ミリリットルライフ【分析シナジー 35050
Penncillin /ストレプトマイシン 100X 1倍 5ミリリットルライフテクノロジーズ 15070
βメルカプトエタノール 14.3 M 114μM 4μlのシグマ/アルドリッチ M3148

表2：分化培地。

ウイルス感染のための2の準備EB細胞

  1. （2日目と3日目の間）、開発の目的の段階では、15ミリリットルコニカルチューブに10センチメートルペトリ皿からのEBを転送します。 5ミリリットルのPBSでプレートを洗浄し、円錐管に洗浄を追加します。
  2. 5分間室温で315×gでのEBをペレット。 5ミリリットルのPBSでEB細胞を洗浄。
  3. （タンパク質分解およびコラーゲン分解酵素を含む）解凍した細胞剥離溶液1mlを加え、37℃の水浴（またはインキュベーター）内チューブを配置OCCで30分間（フリックまたは軽ボルテックスから）asionalに攪拌。
  4. 分化培地の1ミリリットルを追加します。ピペットで上下にP200ピペットチップで2ミリリットルをピペットで。 30〜60分間、再び37℃の水浴中にチューブを置きます。
  5. 5分間315×gで細胞をスピンダウンし、PBSで細胞を洗浄。

3。ウイルス感染

  1. 分化培地1.5 mlの細胞を再懸濁。 6ウェル非組織培養処理プレートに細胞懸濁液を移す。
  2. 事前に標準的な技術によって、レトロウイルスを準備します。ウイルス力価に応じて、細胞へのウイルス上清の5から100を添加する。これはEBのその後の改革を阻害するとして、感染を強化するためにポリブレンを追加しないでください。
  3. 室温で90分間、2,120×gで遠心分離することによってウイルスで細胞をSpinoculate。

4ハンギングドロップでウイルス感染のEB細胞を分化

  1. 私の各ウェルに分化培地2 mlを加えnfected EB細胞懸濁液。
  2. ピペットでmultipipettorsための滅菌試薬槽への感染のEB細胞懸濁液3.5ミリリットル。 820μlの15〜20行をピペットするためにマルチピペッターを使用して、15センチメートルペトリ皿の反転蓋の上にドロップします。
  3. ペトリ皿の下半分に、滅菌PBSまたは水10mlを追加します。その後、ペトリ皿の上に落下し、市町村と蓋を反転。滴が、チャンバの加湿を保つために逆さまにPBSで蓋または下記の水からぶら下がっていることを確認します。
  4. 5.0％CO 2、37℃の組織培養インキュベーターに皿を置き。
  5. 2日後、吊り内に形成されたEBは、分化培地中の4.5 mlの蓋と洗浄を反転させることにより低下集める。
    1. 新しい10センチメートル非組織培養ペトリ皿へ伝達媒体とのEB。分化培地と10cmプレートへの転送3ミリリットルでもう一度蓋を洗ってください。
  6. 8の合計の後にフローサイトメトリーによる分析のために細胞を回収する日間の培養は、分化培地（-LIF）への細胞の初期転送から開始する。

フローサイトメーター分析のための5。の準備細胞

  1. 10ミリリットルピペットで15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移す。 5ミリリットルのPBSでプレートを洗浄し、同じ円錐チューブに移す。
  2. 315×gで細胞をペレット化。 10ミリリットルのPBSでペレットを洗浄する。
  3. 解凍した細胞剥離溶液1mlを加え、時折撹拌しながら30分間37℃の水浴中にチューブを置き。いくつかの細胞表面抗原の検出のために、トリプシンを用いてもよい。
  4. 1ミリリットル分化培地を追加し、ピペッティングし、2mlピペットでダウン。助けるためにピペットの先端にP200チップを使用ブレークアップ単一細胞懸濁液にEBを消化した。
    1. 内在性膜タンパク質は、細胞表面にリサイクルするために60分間再び37℃の水浴中に管を置き。
  5. 5分間315×gで細胞をペレット化。
  6. 細胞w iを洗う第0.1％ウシ血清アルブミンフラクションV（BSA）をPBS（PBS / BSA）中で調製し、特異的な蛍光タグ化抗体で細胞をインキュベートする。

造血前駆細胞のための6。フローサイトメトリー分析

  1. 5ミリリットル12×75ミリメートルの丸底チューブ中の10 6のEB由来細胞を配置します。補償の設定フローサイトメーターを調整するために、製造者の指示に従って補償ビーズを使用しています。
  2. 315×gで細胞をペレット化。チューブ内の残留PBS / BSA溶液中で上清と再懸濁ペレットをオフに注ぐ。
  3. ESCのHPCを検出するために、蛍光標識抗体で細胞をインキュベートする：抗マウスCD41-PE（R-フィコエリトリン）および抗マウスCD117（cKitの）-APC / CY7（アロフィコシアニン7）。
    1. PBS / BSA中100：抗体1に希釈する。各サンプルに希釈した抗体を100μlを加える。各ベンダー、クローン、ロット又は抗体に対する抗体の正確な希釈を決定します。個別の細胞を標識するための最適な希釈を決定します。
  4. 暗所で30分間氷上でサンプルをインキュベートする。
  5. 5分間315×gで2ミリリットルのPBS / BSAおよびペレットの細胞を追加します。
  6. 300のPBSμlあるいは他の等張緩衝液中に吸引し上清とペレットを再懸濁し。
  7. 大きな細胞凝集体を除去するためにセルストレーナーキャップ（0.35μM）を介して再懸濁した細胞をフィルタリングします。
  8. フローサイトメーターで細胞を分析します。

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結果

これらの研究ではESCを使用した（129X1 / SVJマウス系統由来）RW4を糊化。 EBを分化の3日後に単離した。最良の結果を得るにはEBを球状と非接着性（ 図1A、B）である必要があります。ウイルスは、目的の遺伝子と一緒に蛍光マーカーGFPを共発現したピノキュレーションした後、EBをハンギングドロップ法により改質された。 EBを成功裏に2.0、2.5、および3.0日EBから調製した細胞懸濁液から改革された。しかし、EBは、一日4.0 EBから調製した細胞懸濁液から改革することができませんでした。感染および非感染細胞との間のEBのキメラ化は、分化の8日目（ 図2A、B）の蛍光顕微鏡で観察した。 EBの密度は、多くの場合、EBを100％のGFP陽性のように見せます。しかし、異なる焦点面上に焦点合わせたEB（ 図2B）にGFP陽性および陰性細胞の寄与を明らかにすることができる。

フォーHPC開発のr個の分析は、キメラのEBは、分化の8日後に単細胞懸濁液に解離した。 mirn...

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ディスカッション

上述したように、誘導的に目的とする遺伝子を発現ESCクローンはドキシサイクリンシステムを使用して生成することができるが、これらの株の生成は、時間がかかり、労働集約的である。このプロトコールに記載されたEB由来ESCから調製単一細胞懸濁液中の目的の遺伝子を発現する方法である。これらの感染した細胞は、その後の分化を調べるために、ドロップを掛けてEBをに改質されている。実施例（ 図3）においては、分化の3日目に発現した場合mirn23aクラスターの発現は、造血発生を増強することが示されている。この時点で、初期の胚葉組織の発生は、血液前駆細胞を生じさせる初期中胚葉を含むが発生した。 2日目およびRW4 ESCの分化の3胚葉（Pax6の）を表す遺伝子の発現は、内胚葉（のFoxA2）、および中胚葉（T、ねじれ、およびTbx6）は、定量的逆転写酵素PCR（Q-RT-PCRによって検出され、データはない示されている）。 マイルのためにrn23aはHPC産生を増強するためには、初期中胚葉で発現される必要がある。この技術は、導入遺伝子が新規試薬を生成するために多くの労力を費やすことなく、...

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開示事項

著者らは、開示することなく、競合する金融利害関係はありません。

謝辞

この作業は、インディアナ大学医学部センター（IUSM）のExcellence in Molecular Hematology（NIDDK, 5P30DK090948）からのパイロット助成金とフィージビリティ助成金によって支援されました。追加の資金は、IUSMからの生物医学強化助成金によって提供されました。原稿にコメントしてくださったKaren Cowden Dahl博士に感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEMSigma/AldrichD5796
β-メルカプトエタノールSigma/AldrichM3148
FBS (ESスクリーニング済み)ハイクロンSH30070.03E
FBS (定義済み)ハイクロンSH30070.03
非必須アミノ酸ライフサイエンス テクノロジー11140
L-グルタミンライフテクノロジー35050
ペンシルベニア州/連鎖球菌ライフテクノロジー15070
トリプシン/EDTAライフテクノロジー25200
LIF ESGROミリポアESG1107
ACCUMAXミリポアSCR006
トリプシン/EDTAライフテクノロジー25200
ファルコン組織培養プレート 6-井戸フィッシャーサイエンティフィック08-772-1B
ファルコン未処理プレート 6ウェルフィッシャーサイエンティフィック08-772-49
ファルコンペトリ皿 10 cmフィッシャーサイエンティフィック08-757-100D
ファルコンペトリ皿 15 cmフィッシャーサイエンティフィ08-757-148
ファルコンチューブ 5 mlフィッシャーサイエンティフィ14-959-11A
ファルコンチューブ 5ml セルストレーナーキャップ付きフィッシャーサイエンティフィック08-771-23
ホワイト滅菌試薬U.S.A. Scientific111-0700
ラット抗マウス CD41 PE標識バイオレジェンド133906
ラット抗マウス CD117 APC/CY7標識バイオレジェン105826
RW4 ESCsATCCCRL-12418
ズ ズ ズ ズ ック ック ド

参考文献

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