分化胚性幹細胞(ESC)における時間的遺伝子発現の操作は、誘導性遺伝子システムを使用して達成することができます。しかし、これらの細胞株の作製には費用と時間がかかります。このプロトコルは、ES由来細胞の分化における導入遺伝子の迅速な発現と、その後の下流の造血分化の解析を実現します。
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この記事について
サマリー
要約
胚性幹細胞(ESC)は、細胞分化の分子メカニズムを解明するための優れたモデルです。これらは、初期の造血前駆細胞(HPC)の発生を調べるのに特に有用です。ESCにおける遺伝子発現は、発生における個々の分子の役割を決定することを可能にするいくつかの手法によって操作することができます。1つの問題は、特定の遺伝子の発現が、その時間的発現に応じて異なる表現型効果を持つことが多いことです。この問題は、ドキシサイクリン誘導性導入遺伝子システムなどの技術を用いて目的の遺伝子を誘導的に発現するESCを作製することで回避できます。しかし、これらの誘導性細胞株の作製には費用と時間がかかります。ここでは、ESC由来の胚様体(EB)を単一細胞懸濁液に分解し、細胞懸濁液にレトロウイルス感染させた後、吊り下げてEBを改質する方法を説明します。次に、下流の分化をフローサイトメトリーによって評価します。このプロトコルを用いて、ESC分化開始時のmicroRNA遺伝子の外来性発現がHPC生成をブロックすることが実証されました。しかし、新生中胚葉が産生された後にEB由来細胞で発現すると、マイクロRNA遺伝子は造血分化を促進します。この方法は、特定の胚葉組織を導出した後の遺伝子の役割を調べるのに有用です。
概要
マウス胚性幹細胞(ESC)は多能性であり、サイトカイン白血病阻害因子(LIF)1の存在下で未分化のままで自己複製します。LIFを抜くと、胚様体(EB)と呼ばれる3次元(3D)構造に自発的に分化します2。3Dアーキテクチャにより、外胚葉、内胚葉、中胚葉の3つの胚葉が発達し、後に成熟組織タイプ3が生まれます。ESCは、細胞分化の分子メカニズムを解明するための優れたモデルであり、特に初期の造血前駆細胞(HPC)4の発生の研究に優れています。
>jove_content5,6。また、遺伝子を過剰発現するために使用されている手法も数多くあります。ESCの遺伝子発現を改変するために使用された最初の技術は、組換えレトロウイルスにESCを感染させることであった7,8。しかし、目的の遺伝子は、ESCが前駆細胞と成熟細胞タイプに分化するため、しばしばサイレンシングされます。レンチウイルスの使用は、ウイルス発現遺伝子のサイレンシングを制限することに成功しています9。過剰発現に使用される他のウイルスベクターには、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス10アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
1。胚様体（EB）の形成
- マウス胚線維芽細胞（MEFを）上で維持されているのESCをゼラチン適応させる。通路のESCのMEFを除去するために0.1％ゼラチンでコーティングした6ウェル組織培養プレートに3回。
- （ 表1）未分化の細胞を維持するためにLIFとESCの維持培地中で細胞を成長させる。細胞が80％コンフルエンスを超えないことを確認してください。低継代細胞（MEFから除去した後、10以下の継代）細胞分化のために使用します。
- ESCははEB分化培養する前日に、継代細胞がので、彼らは約50〜70％コンフルエント翌日になります。細胞の多能性を保持するためにESCの維持培地中で細胞を培養し続ける。
- 6ウェルプレートのウェルあたり：分化、吸引ESCの維持培地との日に1ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（137mMのNaCl、2.7mMのKCl、11.9 mMリン酸緩衝液、pH7.4 PBS）で洗浄した。
- 0.25％tryps200μlのを追加します。EDTA /中各ウェルに加え、3分間37℃でインキュベートする。
- 分化培地を800μlのトリプシン/ EDTAを不活性化する。ブレークアップするための細胞を単一細胞懸濁液にP200チップで2ミリリットル中に上下にピペットで血清学的ピペット。メディアはピペット先端インターフェイス間で上がらないようにP200チップは端にぴったりと....
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結果
これらの研究ではESCを使用した（129X1 / SVJマウス系統由来）RW4を糊化。 EBを分化の3日後に単離した。最良の結果を得るにはEBを球状と非接着性（ 図1A、B）である必要があります。ウイルスは、目的の遺伝子と一緒に蛍光マーカーGFPを共発現したピノキュレーションした後、EBをハンギングドロップ法により改質された。 EBを成功裏に2.0、2.5、および3.0日EBから調製した細胞懸濁液から改革された。しかし、EBは、一日4.0 EBから調製した細胞懸濁液から改革することができませんでした。感染および非感染細胞との間のEBのキメラ化は、分化の8日目（ 図2A、B）の蛍光顕微鏡で観察した。 EBの密度は、多くの場合、EBを100％のGFP陽性のように見せます。しかし、異なる焦点面上に焦点合わせたEB（ 図2B）にGFP陽性および陰性細胞の寄与を明らかにすることができる。
フォーHPC開発のr個の分析は、キメラのEBは、分化の8日後に単細胞懸濁液に解離した。 mirn.......
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ディスカッション
上述したように、誘導的に目的とする遺伝子を発現ESCクローンはドキシサイクリンシステムを使用して生成することができるが、これらの株の生成は、時間がかかり、労働集約的である。このプロトコールに記載されたEB由来ESCから調製単一細胞懸濁液中の目的の遺伝子を発現する方法である。これらの感染した細胞は、その後の分化を調べるために、ドロップを掛けてEBをに改質されている。実施例（ 図3）においては、分化の3日目に発現した場合mirn23aクラスターの発現は、造血発生を増強することが示されている。この時点で、初期の胚葉組織の発生は、血液前駆細胞を生じさせる初期中胚葉を含むが発生した。 2日目およびRW4 ESCの分化の3胚葉（Pax6の）を表す遺伝子の発現は、内胚葉（のFoxA2）、および中胚葉（T、ねじれ、およびTbx6）は、定量的逆転写酵素PCR（Q-RT-PCRによって検出され、データはない示されている）。 マイルのためにrn23aはHPC産生を増強するためには、初期中胚葉で発現される必要がある。この技術は、導入遺伝子が新規試薬を生成するために多くの労力を費やすことなく、.......
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開示事項
著者らは、開示することなく、競合する金融利害関係はありません。
謝辞
この作業は、インディアナ大学医学部センター（IUSM）のExcellence in Molecular Hematology（NIDDK, 5P30DK090948）からのパイロット助成金とフィージビリティ助成金によって支援されました。追加の資金は、IUSMからの生物医学強化助成金によって提供されました。原稿にコメントしてくださったKaren Cowden Dahl博士に感謝いたします。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-メルカプトエタノール | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS (ESスクリーニング済み) | ハイクロン | SH30070.03E | |
| FBS (定義済み) | ハイクロン | SH30070.03 | |
| 非必須アミノ酸 | ライフサイエンス テクノロジー | 11140 | |
| L-グルタミン | ライフテクノロジー | 35050 | |
| ペンシルベニア州/連鎖球菌 | ライフテクノロジー | 15070 | |
| トリプシン/EDTA | ライフテクノロジー | 25200 | |
| LIF ESGRO | ミリポア | ESG1107 | |
| ACCUMAX | ミリポア | SCR006 | |
| トリプシン/EDTA | ライフテクノロジー | 25200 | |
| ファルコン組織培養プレート 6-井戸 | フィッシャーサイエンティフィック | 08-772-1B | |
| ファルコン未処理プレート 6ウェル | フィッシャーサイエンティフィック | 08-772-49 | |
| ファルコンペトリ皿 10 cm | フィッシャーサイエンティフィック | 08-757-100D | |
| ファルコンペトリ皿 15 cm | フィッシャーサイエンティフィ | 08-757-148 | |
| ファルコンチューブ 5 ml | フィッシャーサイエンティフィ | 14-959-11A | |
| ファルコンチューブ 5ml セルストレーナーキャップ付き | フィッシャーサイエンティフィック | 08-771-23 | |
| ホワイト滅菌試薬 | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| ラット抗マウス CD41 PE標識 | バイオレジェンド | 133906 | |
| ラット抗マウス CD117 APC/CY7標識 | バイオレジェン | 105826 | |
| RW4 ESCs | ATCC | CRL-12418 |
参考文献
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of....
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再版と許可
