Entorhino海馬器官型スライス培養における神経血管リモデリングの解析

サマリー

虚血性脳損傷の多くの局面を再現することができentorhino海馬器官型切片培養のためのプロトコルは、提示される。神経細胞の変化に加えて、神経脈管構造の変化を研究することによって、このプロトコルは、損傷後の神経組織内のプラスチック製の変化を研究するための汎用性の高いツールです。

要約

虚血性脳損傷は、適切な脳機能を損なう最も一般的かつ破壊的な条件の中で、多くの場合、影響を受けた患者の機能欠損を永続化につながる。集中的な研究努力にもかかわらず、神経損傷を軽減し、遅延した二次死から虚血性の領域でニューロンを保護する利用できる有効な治療選択肢は、まだありません。この分野の研究は、典型的には、精巧で、問題の動物モデルの使用を含む。酸素およびグルコース欠乏（OGD）でチャレンジEntorhino海馬器官型切片培養物は、脳虚血を模倣するインビトロモデルにおいて確立されている。この研究の新規な態様は、脳血管の変化を比較し、相関させることができるニューロンの変化およびニューロンコンパートメント及び血管コンパートメントの両方の反応に加えて、研究されていることである。このプロトコルで提示される方法は、実質的にまたは潜在的用途を広げるganotypicスライス培養法。単独のOGDまたは低酸素症の誘導は、器官型スライス培養ではなく単純な手段によって適用され、神経組織における信頼性と再現性の損傷につながることができます。これは、生体内での脳卒中および虚血を誘導し、複雑で、問題の動物実験と全く対照的である。血管系の反応の研究を含めるように分析を広げることにより、脳の機能を維持し、復元する方法の新たな方法を提供することができます。ここで紹介するスライス培養法は、虚血性脳損傷の研究のための魅力的で重要なツールに発展する可能性があり、神経保護を目的とした潜在的な治療措置をテストするのに便利かもしれません。

概要

中枢神経系、血管系による酸素とグルコース供給の喪失または減少に特に敏感である。脳への血液供給のさえかなり短い中断は、一般的な脳卒中症候群につながる、関連する脳領域の機能が永久に失わを誘導することができる。原発被災地のニューロンの喪失に加えて、一般的に二次被害を通じて追加の遅延した神経細胞の損失がある。残念ながら、これまで、二次神経細胞死の低減のための神経保護治療は¹入手できなかった。二次的損傷のメカニズムを研究するための研究努力は、中大脳動脈閉塞および血栓性閉塞、さまざまな技法のような脳虚血の動物モデルの使用に依存している（最近のレビューのために^2を参照）。並行して、またにより制限および動物モデルの使用で倫理的な問題のために、さまざまなCNS組織の器官型切片培養は、STUを可能にするように使用されている負傷^3-5のさまざまなタイプに神経細胞の反応のDY。

虚血性脳損傷を模倣する条件下でニューロンの反応を研究するために、酸素グルコース欠乏（OGD）のモデルシステムが開発されている。このモデルでは、スライス培養物を一時的にグルコースを欠いており、酸素の非存在下で、窒素ガスで平衡化した培地に曝露される。このような治療では、 インビボ ^6,7 における虚血性傷害後に観察されたものとかなり類似している神経細胞の損傷および損失を誘導することが可能である。海 ​​馬では、このような治療はCA1ではなく、特異的に神経細胞の喪失を誘導するCA3領域または海馬の歯状回。対照的に、これまでのスライス培養における血管反応の研究が広く行われていない。明白な理由は、スライス培養モデルにおける循環および血管灌流の欠如である。しかし、それはbと維持することが可能であることが以前に示されている数日^8,9用のCNS ​​スライス培養における100dは血管。

この方法の全体的な目標は、OGD後の神経細胞の運命を監視するが、傷害応答の重要な部分である血管系の運命と改造のために研究を拡張することだけではありません。今までこのような研究は、動物実験（;カヴァグリアら、2001。デ·ヨングら 、1999）の使用を必要とした。プロトコルがここに提示、当社は、そのような研究は、低酸素症、または両方ニューロンの生存と血管反応の分析に続いて興奮毒性病変のいずれかによって攻撃さentorhino海馬器官型スライス培養で詳細に行うことができる方法を。このプロトコルは、この主題^10日に以前に発表された研究に基づいており、CNSにおける神経血管の相互作用に興味を持ってあらゆる研究室のために役立ちます。

プロトコル

動物実験は、2010年9月22日の欧州共同体理事会指令に準拠して実施した（63分の2010 / EU）、レビューとスイス当局によって許された。

1器官Entorhino海馬スライス培養を設定する

1. 静的インキュベーション法^4,11を使用して、生後4日目（P4）仔マウスからentorhino海馬器官型スライス培養（EHOSCs）を準備します。ここでは、のC57Bl6及びCB6F1マウスを使用しています。
   1. すなわちスライス培養の調製のためのマウスの仔あたり約30分、6仔マウスの同腹のための3時間を取る。滅菌手術器具との層流ベンチで滅菌条件下ですべての手順を実行します。
   2. septo時空軸に沿ったスライスの位置からの干渉の可能性を回避するためには、中隔の半分しか海馬スライスを使用しています。特に明記しない場合は、室温ですべてのステップを実行する。
2. トンカットオフ彼は外科ハサミでP4マウスの子犬の頭。無麻酔は、このステップは必要ありません。
   1. 脳の周りの頭蓋骨を外し、大脳半球と中脳の尾の端部との間に亀裂を識別します。慎重に頭蓋骨から脳への脳の吻側の一部を除去して、L-グルタミンの安定化された形を添加したMEMからなる氷のように冷たい準備培地に入れてください。
3. 氷冷準備媒体中に浸漬された脳を持つ実体顕微鏡下で解剖を続行します。皮質半球から残りの髄膜を除去します。半球の内側尾表面で海馬​​を特定し、脳の残りの部分から隣接嗅内皮質と一緒に分離する。
   1. 組織チョッパーに組織を移し、海馬のsepto - 時間軸に無菌状態の横方向の下で厚さ400μmのスライスをカット。
4. CE上のスライスを置きllの培養インサート（インサートあたり約6スライス）とインキュベーション培地のウェルあたり1mlで6ウェルプレートでそれらをインキュベートする（47ミリリットルMEMを25mlイーグル培地25mlのウマ血清1mlのグルタマックスIは、1mlの37℃、5％CO ₂を含む加湿雰囲気中の滅菌10％グルコース溶液、pH7.3）で。メディア翌日、その後1週間に一日おきにアップを変更します。

再灌流を用いたin vitro低酸素及び酸素グルコース欠乏で 2

1. 手順の正確な時刻表については、表1を参照してください。低酸素症またはOGDへの曝露の前に5日間（DIV5）の培養EHOSCs。 2％のB27サプリメント、1％のグルタマックス、追加の0.1％のグルコースを含むNeurobasal培地：この時点で、以下の組成を有する無血清培地、25％ウマ血清を含む培養培地から培地に切り替える。
2. 文献7でコンポーネントの.theの最終濃度を詳述したように、OGD媒体を準備すると、次のようになります。0.3のCaCl _2、70mMの塩化ナトリウム、5.25ミリモルのNaHCO _3、70mMのKClを、pH6.8の1.25ミリモルのNaH ₂ PO _4、2mMのMgSO ₄を、および10mMスクロース。 2個の6ウェル組織培養プレートの各ウェルにOGD培地1mlを加える。
   1. 低酸素チャンバ中で1時間N ₂でOGD培地を灌流した後、37℃のインキュベーター中でO / Nを密封し続ける。
   2. 低酸素指標として嫌気ストリップを使用してください。ストリップの色は白にピンク色に変化する際に酸素を含まないことがメディアを考えてみましょう。
   3. 低酸素症の誘導のために、グルコースの代わりにOGD培地と無血清培地を使用しています。使用前に、OGD媒体について上記で詳述したように、低酸素室でN ₂で培地を灌流。
3. スライスはOGDに曝露される前に、30分間N ₂で再度OGD培地を灌流する。 30分間のスライスに1 mg / mlのヨウ2μlのヨウ化物（PI）（2μg/ mlの最終濃度）ウェル当たりのソリューションを追加し、選択し実験のための唯一の健康なスライスは、PI陽性細胞の数が少ないことによって示されるように。
4. 図1に示したOGD曝露と再灌流のスケジュールを使用します。15分間のいずれかの酸素のみ（低酸素）または酸素とグルコース（OGD）のスライスを奪う。
   1. 低酸素症またはOGDの誘導のために、OGD培地にスライスを転送し、低酸素室で15分間保つ。培養物をOGD媒体とバックへの定期的な媒体から切り替えたとき、インサートの両側に残っている全ての流体が離れて吸引されていることを確認します。
   2. 低酸素症またはOGD後、含酸素無血清培地でOGD培地を交換し、培養液を5％CO _2、37℃での正規インキュベーター中で無血清培地中で3,24または48時間回復させる。細胞死の決定のために固定を再び前に、PIを追加します。

Entorhino海馬器官型スライス培養の3薬理学的治療

1. Cultur薬理学的治療への曝露の前に培養培地中で5日間（DIV5）の電子のEHOSCs。薬理学的治療OGD中または直後にスライスが無血清培地に移される際にOGD後のいずれかを起動します。
2. OGDから保護するための治療法。
   1. （15分間）OGD誘導中または直後に30分間のOGD誘導後培養培地に100μMの6-シアノ-7ニトロキノキサリン-2,3 - ジオン（CNQX）または1μMテトロドトキシン（TTX）を追加します。次に、固定の前48時間正常酸素無血清培地中でインキュベートする。
3. 興奮毒性死の誘導のための治療。
   1. インキュベーション培地スイッチ培養における5日後、30分間100μM（RS）-αアミノ-3 - ヒドロキシ-5 - メチル-4 - イソキサゾールカルボン酸（AMPA）を含む無血清培地である。
   2. 吸引によりAMPAを含む培地を取り外します（インサート上の任意の残留培地を除去するために注意してください）​​、通常の無血清培地で新鮮なプレートにスライスを転送し、固定されるまで48時間保管してください。

4の固定および免疫染色Entorhino海馬器官型スライス培養

1. ヨウ化プロピジウム（PI）染色。
   1. 2μg/ mlの濃度で生きているスライスの培養培地への30分間のPIを追加する。蛍光光学系を備えた倒立顕微鏡で生きた文化を表示し、さらなる処理のためのスライスを選択します。免疫組織化学と組み合わせたPI染色のために、前の文化の定着にPI溶液に30分を追加します。
2. スライスの固定。
   1. 6ウェルプレートから培地を除去し、各ウェルに、新たに調製した4％パラホルムアルデヒド（PFA）を3mlを加える。その後、冷蔵庫に6ウェルプレートを配置し、4℃でO / Nを修正。
   2. 次の日、PFA溶液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でスライス3-4回洗浄する。
3. 細胞培養i番目からスライスの除去フリーフローティングセクションの免疫組織化学のために手順をnsertブロッキング。
   1. 慎重に切り離し、サイズ0以下のアートペイントブラシを用いて培養インサートからスライスを削除します。 （10％正常ヤギ血清（NGS）および2％のTriton-X100を含むPBS）をブロッキング緩衝液で満たされた96ウェルプレートのウェルに各個別のスライスを転送する。オービタルシェーカーで一定の攪拌下、室温で2時間ブロッキングバッファー内のスライスにしてください。
4. スライス培養の免疫染色
   1. 標識のため血管は1の希釈でポリクローナル抗ラミニンを使用します。200をPBSで1％NGSおよび0.5％トリトン-X100を含有する。
   2. ラベリングニューロンのために1の希釈で抗微小管結合タンパク質2（MAP2）を使用する：PBS中500は、1％NGSおよび0.5％トリトン-X100を含む。
   3. 一定の攪拌しながら4℃で48時間、一次抗体とのスライスをインキュベートする。インキュベーション期間の後、3〜4回、0.5％トリトン-X100を含むPBS中でそれらを洗浄。
   4. 二次抗体を希釈1：500のPBS、1％NGSおよび0.5％トリトン-X100を含有する。 Alexaの蛍光団結合二次抗体を用いた暗闇の中で、室温で2時間のスライスをインキュベートする。アレクサ350または488に結合させ、適切なヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス二次抗体を使用してください。
   5. 二次抗体溶液を除去し、トリス緩衝生理食塩水（TBS）で切片を3回洗浄する;スライドガラス上にマウントし、モヴィオールでスライドをカバースリップ。
5. 染色されたスライスの顕微鏡観察
6. 落射蛍光装置と標準的な顕微鏡や共焦点顕微鏡のいずれかで染色されたスライスを表示します。適切なカメラを入れて撮影する。いくつかの画像では、明るい背景で暗く染色された血管を得るために、蛍光のコントラスト（ 図5および6）を反転させる。

培養における地域血管密度の5。決定

1. vesseを定量化文献8に記載されているように、血管の交差に基づいて、Lの密度。
2. これらの測定のためのラミニンのために染色したスライスを使用してください。各グリッドは、平方当たり100×100μmで、0.25ミリメートル²の全分野に等しく、6×6のグリッドで10倍の倍率の撮影した画像を重ね合わせる。
3. オーバーレイCA1、CA3、DG、およびEC地域の3つのこのようなグリッド（ 図2）。グリッドの線と交差血管をカウントします。
4. 良い統計的関連性を持つ結果を得るために、各マウスの仔あたり3スライスを持つ3仔マウスからのデータを含む、少なくとも3つの独立した実験で測定を行う。
5. 各地域のグリッドからの血管交差の平均値を決定し、適切な統計ソフトウェアを使用して事後検定（p <有意であると定義されている0.05）のようにボンフェローニ補正をANOVAにより統計分析を行う。

結果

酸素グルコース欠乏及び低酸素症は、海馬CA1領域において特異的に神経細胞死及び血管の減少を誘導する 。
以前⁷の記載と同様の海馬（ 図3）のCA1領域に特異的にヨウ化プロピジウム染色によって見られるようにOGDまたは酸素欠乏は、単独で15分間、細胞死の強力な誘導を誘導した。マーカーは、血管のネットワークを可視化すると、それは血管密度及び組織はCA1領域を除いた培養物の大部分でOGDチャレンジ後の制御と同様現れていることがわかった。そこ血管密度が減少し、血管網は、部分的に（ 図3、E及びF）破壊した。これらの変更は、ヨウ化プロピジウム染色が増加した領域で見られた。

血管の変化の時間的経過はneurのそれに匹敵する角項変性症。
私たちは、3時間、24時間および酸素欠乏（低酸素症）後48時間目の時点を使用して、CA1の両方でニューロン変性および血管損失の経時変化を調べた。 3時間後に低酸素症ではないヨウ化プロピ...

ディスカッション

ここに提示される方法で、海馬器官型切片培養は、損傷後の神経組織におけるプラスチックの変化を研究するための多目的ツールとして使用することができる。器官型スライス培養^7、虚血⁶の後のニューロンの反応を研究するために過去に使用されてきた血管の変化の同時研究の新たな局面が大幅この方法の潜在的な用途を高める。単独のOGDまたは低酸素症の誘導は、器官型スライス培養ではなく単純な手段によって適用され、神経組織における信頼性と再現性の損傷につながることができます。さらに、スライス培養のアプローチだけでなく、虚血性挑戦の影響を研究することができますだけでなく、神経保護を目的とした潜在的な治療策のテストを行うことができます。スライス培養は、したがって、虚血性脳損傷の研究のための魅力的で重要なツールです。

ここで紹介する方法は、ヘクタールすべての研究所のために実装するのは簡単です中枢神経系のスライス培養といくつかの経験をヴィング。 OGDまたは低酸素症を適用すると、再現性のある結果を達成するためにN ₂を含む培地を注意深く平衡化を必要とす...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
最小必須培地 MEM	Gibco	11012-044
Glutamax	Gibco	35050-061	L-グルタミンの安定化型
ミリセル細胞培養インサート	ミリポア	PICM03050
基礎培地 イーグル	Gibco	41010-026
馬血清	Gibco	26050-088
神経基礎培地	Gibco	21103-049
B27 サプリメント	Gibco	17504-044
嫌気性ストリップ	Sigma-Aldrich	59886
ヨウ化プロピジウム溶液	Sigma-Aldrich	P4864
AMPA	R&Dシステム	ズ0169-10
CNQX	R&Dシステム	0190/10
TTX	R&Dシステム	ズ1078/1
ポリクローナル抗ラミニン	Sigma-Aldrich	L9393
アンチMAP2	Abcam	ab11267
Alexa anti-mouse 350	Molecular Probes	A11045
Alexa anti-mouse 488	Molecular Probes	A11001
Alexa anti-rabbit 350	Molecular Probes	A11046
Alexa anti-rabbit 488	Molecular Probes	A11008
Statistics software	GraphPadソフトウェア	GraphPad Prism
McIlwain組織チョッパー	Ted Pella	10180
低酸素チャンバー	Billups-Rothenberg	MIC-101