筋ジストロフィー患者から人工多能性幹細胞の生成：尿由来細胞の効率的な統合·フリーリプログラミング

サマリー

このプロトコルは、筋ジストロフィー患者からの尿由来細胞の分離のための詳細な手順を伴います。それらは、センダイウイルスの形質導入を通じて効率的かつ迅速に再プログラミングされます。

要約

異栄養性心筋症は、筋ジストロフィーのあまり理解結果である。筋ジストロフィーの患者から誘導された多能性幹細胞（iPS細胞）を生成するインビトロ疾患モデル系のための貴重な細胞源であり、薬剤スクリーニング研究のために使用することができる。患者由来の尿細胞はジストロフィー性心筋^1をモデル化するために、誘導多能性幹細胞への成功した再プログラミングに使用されてきた。ベクター系を統合する安全性の問題に対処する、我々は、筋ジストロフィーの患者から採取した尿細胞に山中因子の形質導入のための非組み込み型センダイウイルスベクターを使用してプロトコルを提示する。このプロトコルは、2〜3週間以内に完全に再プログラムされたクローンを生成します。多能性細胞は、流路13によりベクターフリーです。これらの異栄養性IPSCは、心筋細胞に分化し、病気のメカニズムを研究または薬物スクリーニングするために使用することができる。

概要

心筋症は、デュシェンヌ型とベッカー型筋ジストロフィー（MD）患者の死亡原因の第2位である。 X連鎖ジストロフィン遺伝子の変異が1で発生するものの：3500男性の出生、非常に少ない、プログレッシブ心筋の損傷につながる分子や細胞のイベントについて知られている。筋ジストロフィー患者由来のヒト誘導多能性幹細胞は、基礎疾患の機構を研究するために、薬剤は^、1,2のスクリーニングに使用するための新規なツールとして浮上している。

皮膚生検または血液サンプルの予想不快感は、研究参加の同意を与えるために若い患者及び/またはその保護者を説得することができる。尿サンプルは、再プログラミング方法に修正可能である体細胞の非侵襲的な供給源である。我々は最近、筋ジストロフィー患者から採取した尿細胞は培養することができることを示しかつ効率的に山中因子とレトロウイルス形質導入を用いて、iPS細胞（に再プログラムしているあるOct3 / 4、Sox2の、Klf4及びc-Myc; ^OSKM）1。レトロウイルス遺伝子送達の欠点は、宿主染色体への初期化遺伝子のランダムな統合です。この制限を克服するために、我々は、尿細胞再プログラミングのための非組み込み型センダイウイルスを使用している。

このプロトコルは、さらなる研究のための心筋細胞または他の細胞型に分化させることができる筋ジストロフィー患者から単離された尿細胞のセンダイウイルス再プログラミングについて詳しく説明します。このプロトコルは、他の患者の特定の疾患に適合させることができる。

プロトコル

注：患者、および/またはその保護者は、研究を承認した治験審査委員会に参加するためにインフォームドコンセントを与える必要があります。

1.バッファとメディアの準備

1. 洗浄緩衝液：リン酸緩衝食塩水（PBS）の99 mlの100×ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を1ml（100 U / mlペニシリン+ストレプトマイシン100μg/ mlの）を追加し、洗浄緩衝液100mlを調製する。
2. 尿中前駆細胞（UPC）ミディアム：ケラチノサイト無血清（KSF）ミディアム+前駆細胞培地を等量混ぜ、UPC媒体を作製した。
   1. KSF中：上皮成長因子の5 ng / mlの（EGF）、ウシ下垂体抽出物の50 ng / mlの（BPE）、コレラ毒素の30 ng / mlの、およびペニシリン/ストレプトマイシン溶液（100 Uを追加し、ケラチノサイト培地を調製するために/ mlペニシリン、500ミリリットルKSF培地に100μg/ mlのストレプトマイシン）。
   2. 前駆細胞培地：10％FBSでハム-F12培地とサプリメントの四分の一を含むDMEMの4分の3の追加、0.4 / mlのヒドロコルチゾン、0.1nMのコレラ毒素、5 / mlのインスリン、1.8×10 ^-4 Mのアデニン/ mlのトランスフェリン、2をx 10 ^-9 Mのトリヨードサイロニン、10ng / mlのEGF、およびペニシリン/ストレプトマイシン溶液を5μg。
3. のhES培地：/ 20％KO血清代替（K-SR）を追加し1×MEM非必須アミノ酸、2mMのL-グルタミン、100μMのβメルカプトエタノール、20ng / mlのbFGFおよびペニシリン/ストレプトマイシン400 mlのDMEM F12培地。

2.尿サンプルコレクション

1. 尿の十分な量（〜30〜40ミリリットル）を収集することができることを保証するために採尿に30分前に流体を飲むように患者に指示します。
2. 患者および/またはその保護以下の項目を含む尿採取キットを与える：（1）滅菌またはクリーンキャッチ尿サンプルを入手する方法についての説明書、（2）湿った抗菌toilettes、及び（3）を100mlの滅菌標本コレクションカップ。サンプルを収集するために患者に指示します。
3. 直ちに氷上に尿サンプルを配置し、laboraに移転クーラーでトーリー。すぐに細胞単離のための尿を処理します。遅延が避けられない場合には、細胞の生存率の損失を最小限に抑えて、最大4時間氷上で試料を保存する。

3.単離と尿細胞の拡大

注：BSL2生物学的安全キャビネット内無菌条件下で、次の手順を実行します。

1. 滅菌ピペットを用いて、転送尿サンプルを50ml遠心管に無菌である。 RTで10分間、400×gで遠心分離する。
2. チューブ内の1ミリリットルを残して上清を吸引。細胞ペレットを乱さないように注意してください。
3. 再懸濁洗浄緩衝液7mlの中に複数の管からペレットを組み合わせて、RTで10分間、400×gで遠心分離を繰り返し。
4. 慎重に細胞ペレット及び上清〜0.2〜0.5ミリリットルを残して、上清を吸引除去する。尿中前駆細胞（UPC）培地2〜3mlの中で再懸濁し、国連の4〜6ウェルにサスペンションを転送コー​​トした24ウエルプレート。
5. 72時間後、ウェル当たり新鮮UPC培地の0.5ミリリットルと文化を補完し、2〜3日ごとに後の培地に変更します。プレートに付着していない赤血球と扁平上皮細胞を培地変更で削除されます。
6. 4-6日後の培養を監視します。
   注：小2-4細胞コロニーが現れ始めます。細胞は、それぞれタイプIまたは腎上皮のタイプII（RE）のセル^3を表す丸めまたは伸長される。
7. 細胞が表示されたら、彼らは急速な拡大期を受けることになるので、2〜3日毎に培地を変更します。
8. 細胞がプレーティング後9-15日を中心に、80〜90％のコンフルエンスに到達すると、さらなる拡大のために24ウェルプレートの2-4ウェル上に細胞（15,000-18,000細胞/ cm ^2）を解離して通過。細胞継代1（P1）としてこれをマークします。
9. フローサイトメトリー分析を介して系統仕様の尿細胞を特徴づける、immunohistochemiCalの染色または逆転写酵素 - ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を介し。
10. 長期間の凍結保存のために（DMEM、10％血清および10％DMSOを補った）孤立した尿細胞（セクション4）を再プログラムまたは凍結培地にそれらを凍結する。

センダイウイルスを使用する4.尿細胞リプログラミング

注：トランスフェクションエージェントを操作しながら適切な取り扱いとPPE（個人用保護具）の使用が推奨されます。 BSL2生物学的安全キャビネット内無菌状態で、次の手順を実行します。薬剤および/またはトランスフェクトされた細胞をトランスフェクトする適切な処分は、環境と健康の危険のリスクを回避することをお勧めします。以下に詳述するように、尿細胞の再プログラミングについては、メーカーのフィーダー依存プロトコルへの変更を加えて仙台リプログラミングキットを使用しています。

1. センダイウイルスを用いた高効率な再プログラミングを確保するために、使用が急速である尿細胞の1-5通路LYは分裂。細胞が十分に複製または老化にならない場合は、彼らが効率的に再プログラムしないので、それらを捨てる。
2. 6ウェルプレートの2つのウェルにおける種子ウェル当たり60,000個の細胞。マーク·デイ-2としてこの。細胞播種密度を調整し（5×10 ^4から 9×10 ^4個の細胞をウェルあたり）0日によって80〜90％コンフルエンスに到達するために必要である。
3. 0日目（細胞を播種後48時間）で、4 OSKM因子のそれぞれを含む仙台リプログラミングベクター（SeVの）を調製。予め温めUPC培地1mlにベクトルの各々を加える。尿細胞を再プログラミングするための十分である、1〜1.5のMOI（5〜7.5×10 ⁵ CIU）を使用します。メディアを吸引し、ゆっくりと尿細胞の1ウェルに1ミリリットルUPC +のSeVを追加します。形質導入ネガティブコントロールとして第2のウェルを使用してください。
4. 1日目に、新鮮なUPC媒体とUPC + SeVの媒体を交換してください。いくつかの細胞死は、ウイルス細胞毒性によるものでは24時間後に見られている。
5. 再プログラムCLONの効率に応じて、Eの形成とコンパクトな形態は、6日目または7まで毎日培地を変え続ける。
6. 前に形質導入した細胞（5日目または6）、マイトマイシンC（3時間、10μg/ ml）を0.1に5×10 ⁴細胞/ cm ²の密度で処理された、MEFのメッキをMEFフィーダープレートを準備の解離の一日％のゼラチンは100ミリメートル²培養皿をコーティングした。
7. 次の日（6日目または7）、0.25％トリプシンで細胞を解離UPC培地プレートに5×10 ⁴細胞を再懸濁する- 2×10 ⁵細胞/ 100のmm ²のMEFフィーダープレート。
8. 次の日は、hES培地に切り替えて、毎日培地を変更します。形質転換細胞を監視するために、顕微鏡下で細胞を観察します。
   注：細胞は、特徴的な敷石状形態を有するクローンの凝集体を形成し、細胞質の比率（12-18日後に形質導入​​）に高い核を有する。
9. 形質導入後2〜3週間以内に、コロニーをピックアップし、CLONのための新しいプレートに移すアル展開。
10. 37℃で1時間、TRA-1-81抗体で細胞をインキュベートすることによって、IPSCクローンを選択するための生細胞染色を行う CO _{2インキュベーター}中で37℃で1時間、特定の蛍光色素結合二次抗体との対比染色に続いてCO ₂インキュベーター内でC°。
11. 小さな等しい大きさの小片（クローンあたり4-6個）にクロスハッチ大きなTRA-1-81陽性のIPSCクローンに26 G 1.5インチの針を使用してください。
12. マトリゲル（10μgの/ cm ²程度）の各ウェルに複数のクローンから10-20クロスハッチング部分をピックアップし、転送するために滅菌ピペットチップを使用して、hES培地で24ウェルプレートをコーティングさ。
    注：単一のウェルに個々にメッキ単一のクローンからの小品が展開または多能性を維持していない。
13. 再プログラムされたクローンは、マトリゲル表面に取り付けられた後のIPSC媒体へのhESからの変化24〜48時間。
14. マトリ被覆プレート上のメンテナンス時に、手動でSCRAPE-オフあらゆる分化した細胞または完全に再プログラムし、多能性ジストロフィーIPSC（MD-IPSC）のクローンを濃縮するためにピペットチップを用いてMEFフィーダー細胞を汚染する。
15. 個々のクローンは、〜100μmのサイズに達した後、3分間の0.48 mMのEDTA（エチレンジアミン四酢酸）溶液を用いて解離および5μMY27632補充したIPSC培地に懸濁MD-iPS細胞の小細胞凝集体（、RhOなどキナーゼ阻害剤をめっきすることによってクローンを拡大する）新鮮なマトリゲル上で（を10μg/ cm ^2）をコーティングした12ウェルプレート。毎日のIPSC媒体を変更します。
16. 各クローンの完全な再プログラミングはOSKM遺伝子および多能性マーカー（のOct3 / 4、TRA-1-81）の免疫組織化学染色の両方の遺伝子発現解析によって決定することができる。多能性の可能性の厳格な評価は完全に再プログラムIPSC線が三胚葉に分化することができる確認するために用いられるべきである。これは、胚様体（EB）形成および分化アッセイによって、またはターどちら達成することができる血腫形成アッセイ。

結果

（それぞれ97.37パーセント、97.09パーセント、および97.3％; 図1Aおよび図1B）は、ヒト尿から単離されたほとんどの前駆細胞は、CD44、CD73、およびCD146などの尿路上皮前駆細胞および周皮細胞のマーカーに対して陽性である。これらの細胞は、α平滑筋アクチン、およびビメンチン（ 図1B）のような他の間葉系マーカーを発現した。サイトケラチン-7（CK-7）、ウロプラキン（UP）-Ia＆-IIIa、尿路上皮細胞系列のマーカー（ 図1C）の弱い発現が存在するようにRT-PCR分析は、培養物中の細胞の混合集団の証拠を与える。

再プログラミングステップは、図2Aに概略的に要約されている。代表的な画像は、プロトコル（ 図2B）を通じて異なる時点の間、細胞の形態を示す。尿細胞は、再プログラミング中に石畳のパターン（4日目）に細長い、II型細胞（0日目）から変換する。 BY 12...

ディスカッション

性IPSCを使用して、心血管疾患のモデリングは、遺伝的寄与^4-6を理解するための一般的なアプローチになってきている。患者から細胞サンプルを取得するいくつかの予期せぬ困難、特に幼い子供たちは、そのような尿収集などの非侵襲的アプローチのオプションを提供することによって回避することができる。この若い患者集団では、再プログラミングのための十分な尿細胞を得るのに十分な尿量を収集することはしばしば困難である。前採尿に流体30分を飲むように若い患者をコーチングすることは尿細胞単離の成功を向上させます。しかし、繰り返し尿コレクションがこの集団に必要な場合があります。我々は、合わせて、筋ジストロフィーを有する患者からのUCの単離および培養を最適化するために、2つの異なるプロトコル^3,7を適応している。

誘導多能性幹細胞は、筋ジストロフィーpatienから皮膚線維芽細胞または尿細胞のいずれかから生成されているTS ^1,2。しかし、両方の再プログラミングプロトコルは体細胞に再プログラミング因子を導入するレンチウイルスに依存した。導入遺伝子...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Materials
4オンス蓋付き標本カップ	STL尿サンプル収集用	医療用供給	M9AMSAS340
15 ml BD-ファルコンチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	352097
50 ml BD-ファルコンチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	352098
丸型ガラスカバースリップ	フィッシャーサイエンティフィック	12-545-81
CytoTune-iPS 仙台リプログラミングキット	ライフテクノロジー	ズ A1378-001
PBS, pH 7.4	ライフテクノロジー	ズ 10010-023
溶連菌ペン w/o グルタミン	Life Technologies	15140-122	37°で暖かい;使用前のCウォーターバス
RPMIミディアム1640	ライフテクノロジー	ズ11875-0933333333377	°Cで暖かい;使用前のCウォーターバス
B-27サプリメントw /インスリン(50x)	ライフテクノロジー	ズ17504-0443333	で暖かい;Cウォーターバス使用前の
B-27サプリメントw / oインスリン(50x)	Life Technologies	0050129SA37	°Cで暖かい;使用前のCウォーターバス
DMEM / F12(1:1)	Life Technologies	11330-032	37°Cで暖かい;使用前のCウォーターバス
Versene、1:5,000	Life Technologies	15040066	37°で暖かい。使用前のCウォーターバス
bFGF(10µg)	Life Technologies	13256-029	37°Cで暖かい。使用前のCウォーターバス
Cell Counter Cartridges	Life Technologies	C10228
Knockout Serum (500 ml Bottle)	Life Technologies	10828-028	37°Cで暖かい;Cウォーターバス使用前の
回復細胞培養凍結中	期生命技術	12648-010
ケラチノサイト-SFM(1x)、リキッド	ライフ技術	17005-042333	で暖かい。使用前のCウォーターバス
DMEM、高グルコース、Glutamax	Life Technologies	10566-016	37°Cで暖かい;
ハムのF-12栄養ミックス	Life Technologies	11765-054	37°Cで暖かい;EGF
組換えヒトタンパク質、液体形態	生命技術	PHG0311L	37°Cで暖かい前にCウォーターバス。Cウォーターバス使用前
インスリン、ヒト組換え体、亜鉛ソルン	ライフテクノロジー	ズ12585-014	37°Cで温めます。使用前のCウォーターバス
TeSR-E8	細胞技術	5940	37°Cで温めます。使用前のCウォーターバス
ROCK阻害剤(Y-27632)	Selleck	S1049	37°Cで温めます。使用前のCウォーターバス
マトリゲル	BDバイオサイエンス	354277	hESC認定マトリックス、LVED
フリーRNeasyミニキット	Qiagen	74104
iScript cDNA 合成キット	Bio-Rad	170-8890
DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)	Thermo-Scientific	K1081
FBS 認定	Sigma Aldrich	F6178	Warm in 37 °使用前のCウォーターバス
アデニンバイオ試薬	シグマアルドリッチ	A2786-5G	37°Cで温めます。Cウォーターバス使用前の
コレラ毒素ビブリオコレラ	Sigma Aldrich	C8052-.5MG	37°C;使用前のCウォーターバス
ヒドロコルチゾン	シグマアルドリッチ	H0888-1G37	°Cで暖かい;Cウォーターバス使用前の
Sigma Aldrich	T0665-50MG	からのホロトランスフェリン	37°Cで温めます。Cウォーターバス使用前
3,3',5-Triiodo-L-チロニンナトリウム塩	Sigma Aldrich	T6397-100MG	37°Cで温めます。Cウォーターバス使用前
DAPI	Santa Cruz Biotechnology	SC-3598
Fluoromount Aquous 封入剤	Sigma Aldrich	F4680
16% パラホルムアルデヒド	Alfa-Aesar	43368
Antibodies
strong>Mouse anti CD44 - 標識 FITC	BD Biosciences	560977
マウス抗CD146 - PEで標識	BD Biosciences	561013
マウス抗CD73 - PEで標識	BD Biosciences	561014
マウス抗アルファ - 平滑筋アクチン	Sigma Aldrich	A2547
マウス抗ビメンチン	Abcam	ab8978-100
マウス抗 - TRA-1-81	ライフテクノロジー	ズ411100
ウサギ反10月3/4	サンタクルーズ	バイオテクノロジーSC-9081
マウス抗ジストロフィン	ライカバイオシステム	ズNCL-DYSB