蛍光タンパク質の発現において Branchiostoma lanceolatum未受精卵へのmRNA注入による

サマリー

私たちは、Branchiostomaのlanceolatumの未受精卵母細胞へのmRNA注入後、ここで蛍光タンパク質の堅牢かつ効率的な発現を報告している。この基底脊索動物におけるマイクロインジェクション技術の開発は、in vivoイメージングと遺伝子特異的な操作に含めて、この新たなモデル系で遠大な技術革新のための道を開く。

要約

ここでは、頭脊索動物両生類、Branchiostoma lanceolatumの未受精卵子へのmRNA注入後の蛍光タンパク質の発現のための堅牢で効率的なプロトコルを報告します。私たちは、アンフィオクサスコドンの使用とコザックコンセンサス配列に対応するように修飾された膜および核標的mCherryおよびeGFP用のコンストラクトを使用しています。使用する注射針の種類、未受精卵子の固定化プロトコル、および全体的な注射設定について説明します。この技術により、蛍光標識された胚が生成され、発生初期における細胞の挙動のダイナミクスを最新のin vivoイメージング戦略を用いて解析することができます。この両生類におけるマイクロインジェクション技術の開発により、胚内の細胞挙動のライブイメージング解析や、遺伝子の過剰発現やノックダウンなどの遺伝子特異的な操作が可能になります。全体として、このプロトコルは、胚発生のメカニズム、そしてさらに重要なことに、その進化に関連する問題に対処するための動物モデルとして、基底脊索動物アンフィオクサスをさらに強化します。

概要

開発中は、単一の細胞は細胞分裂や動きの両方が関与非常に複雑なプロセスで、生物全体を生じさせる。優れた細胞の挙動の力学の基礎となる生物学的原理を理解するために、発生生物学者は、蛍光ベースのインビボイメージング技術を使用し始めている。特定のこのような細胞膜などの細胞の区画のいずれかの蛍光色素での処理により標識することができる、特異性および組織浸透¹の欠如によって妨げられアプローチ、または蛍光タンパク質^2をコードする外因性mRNAの胚に特異的な導入による。別の技術は、mRNAのような外因性化合物の効率的な送達のために用いることができる。これらには、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、微粒子、リポフェクションおよび形質導入^3,4との衝撃が、これらに限定されない。これらのアプローチの全ては、外来性化合物を導入するために使用することができるが胚を開発し、唯一のマイクロインジェクションは、各セル³内にあらかじめ定義されたと正確な量の適用を可能にする。マイクロインジェクション技術は、すべての主要な発達のモデル系^4（ 例えば 、ショウジョウバエ、線虫、ゼブラフィッシュ、カエル、マウス）のためだけでなく、発達のメカニズムの進化を理解することを目的とした比較研究のために使用されるものを含むいくつかの代替モデル^4、のために記載されている（ 例えば 、イソギンチャク、環形動物ワーム、ウニ、ホヤホヤ、ナメクジウオのナメクジウオ）。

一緒にホヤと脊椎動物で脊索動物門を確立Cephalochordatesは、特に、脊索動物の進化と無脊椎動物の祖先^5-8から脊椎動物の多様化を研究するために非常に適したモデルです。ナメクジウオ系統は、脊索動物の進化の過程で非常に初期の発散。 3属（ ブランに細分され、現存cephalochordates、chiostoma、AsymmetronとEpigonichthys）、全体的な解剖学とゲノムアーキテクチャ^5-8の両面脊椎動物に似ている。これまでに記載されているcephalochordatesの約30種のうち、5人は発生学的と発達研究の^6,9のために用意されていますAsymmetronのlucayanum（バハマのナメクジウオ）、Branchiostoma floridae（フロリダナメクジウオ）、Branchiostomaのlanceolatum（欧州ナメクジウオ）、 Branchiostoma belcheri（中国語ナメクジウオ）とBranchiostoma吸虫 （日本ナメクジウオ）。これらの種の3（B.のlanceolatum、B. belcheriおよびB. japonicumの ）の熟した大人の繁殖期^10,11の間にオンデマンド産卵するように誘導することができる。さらに、少なくともBのlanceolatum、効率的な産卵も、それによって研究所のために、この特定のナメクジウオ種がアクセスできるように、人工海水¹²に誘導することができる自然海水へのアクセス権を持っていないIES。 Bの組み合わせ、 lanceolatum、そのようなマイクロインジェクションなどの効率的な配信方法で胚に便利で信頼性の高いアクセスのため、これまでに^{13〜15、（B。floridae}およびB. belcheriの両方で）ナメクジウオで開発された唯一の送達技術は、の開発を可能にします系統tracing-と動的な細胞の挙動に基づくアプローチを含む整体技術の新規スイート。

B.蛍光タンパク質を発現するmRNAの効率的なマイクロインジェクションのためのプロトコルlanceolatum胚 、したがって開発されました。さらに、Bのライブイメージングのための基本的なツールキットを提供するためにlanceolatum胚 、ベクター系は、膜結合および蛍光タンパク質の核発現を可能にするように開発された。膜標的化するための、強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）はmCherryをとeGFPの人間HRAS CAAXボックスと核局在化したこと融合させたゼブラフィッシュヒストン2B（H2B）エクソン（ 図1、補足ファイル1）への融合によって得られる。また、Bのタンパク質翻訳を最適化することを目標に、構築物のコザック配列及びコドンは改変されていると使用に適応lanceolatum。まとめると、ここで提示注入法および発現ベクターは、特に、最新の蛍光ベースの生体内イメージング技術を用いて分析し、cephalochordatesための新たな実験的アプローチを生成するための基礎として役立つ。

プロトコル

機器·試薬の調製

1. 転送パスツールピペット
   1. 異なる速度で炎の上に230ミリメートル長いパスツールピペットを引いて、異なる先端径の転送パスツールピペットのシリーズを生成します。テーパーは、吸引の円滑かつ微調整のために、できるだけ長くであることを確認してください。
   2. ダイヤモンドスクライブでは、ピペットの長さに垂直な線に沿ってピペットを傷つける。両手で、ブラントカットを生成するために、その長さにピペット平行に引く。迅速に難ポリッシュ先端を密封することなく、ピペット。
   3. ピペットでする卵母細胞/胚の段階で先端の直径が異なります（直径150μmの周りに）未受精卵のために300〜400ミクロン、受精卵（直径500ミクロン程度）のために600ミクロン、200〜400ミクロンハッチングneurulaeため。 1皿から卵母細胞/胚を転送するための口に監視吸引管で使用するピペット別。
2. 注射針
   1. RNaseフリーの条件を確実にするために手袋で毛細血管を操作する。 OD 1.20ミリメートル、ID 0.94ミリメートル、長さ10ミリメートルの寸法のフィラメント毛細血管にホウケイ酸ガラスを使用してください。
   2. 毛細血管が物質一覧に記載の加熱フィラメント針プラーの種類に引っ張られた場合は、次の設定を使用します：熱600は、ある形状を、確実に、それ以外の場合は50、速度80、時間60、圧力200または300を引いて成功した注射用の重要な、以下の特性を図2に示すように、4-8ミクロンの外側先端の直径、2cmのテーパー長を。
      注：針は産卵期の前に引き出され、シーズンを通して使用することができます。
3. 5％フェノールレッド原液（4X）
   1. 各産卵期の前に新鮮な準備をします。
   2. 0.22μmの濾過チューブでは、フェノールレッド粉末25mgを秤量。
   3. DNase-とRNaseフリー水0.5mlを追加粉末を含有するチューブ。
   4. 溶液を濾過滅菌し、注射針を詰まらせる可能性の結晶を除去し、室温で18000×gで3-5分間スピン。
   5. 4℃で保存または-20℃で250μlのアリコートを保存する。
4. 0.25 mg / mlのポリ - リジンソリューション
   1. 各産卵期の前に新鮮な準備をします。
   2. 蒸留水20ml中のポリ-L-リジン5mgを溶解する。店舗-20℃で5ミリリットルのアリコート。
   3. ポリ - リジンコートディッシュに卵母細胞の再現可能と強固な密着性を確保するために、すぐに一度だけ解凍アリコートを使用してください。
5. mRNA合成
   1. 各産卵期の前に新鮮な準備をします。
   2. （37℃で、通常は2時間、）適切な酵素で目的のDNA5μgのを線形化。消化の完全性をチェックするには、20分間150 WでTBE緩衝液中の1％アガロース - TBEゲル上で消化ミックスの容量で2％を実行します。
   3. LINEAを抽出24：1フェノール（pHは8.0）：クロロホルム：イソアミルアルコール25と、有DNA。 20秒、遠心18000×gで10分間、そして水（上）相を集めるための渦。
   4. 1：クロロホルム：イソアミルアルコール24に再び水相を抽出します。 20秒間ボルテックス、18000×gで遠心分離10分、水相を収集します。
   5. 10：300線状化DNA：3 M酢酸ナトリウム（pH5.2）：-20℃で一晩、100％エタノール100と線状化DNAを沈殿させる。
   6. 4℃、18000×gで20分間遠心分離。 70％エタノールですすぎます。
   7. 4℃で18000×gで遠心し、10分。 RNaseフリー水ドライで再懸濁0.5μgの/μlの最終濃度でみましょう。
   8. 製造業者の説明書に従って、適切なポリメラーゼによるmRNA合成キットを用いて線状化DNAを1μgを転写する。
   9. 1フェノール（pHは4.7）：5でmRNAを抽出しキットで提供さクロロホルム及び酢酸アンモニウム停止液。
   10. 20秒間ボルテックス、CEntrifuge 18000×gで10分間、水相を収集します。
   11. 1：クロロホルム：イソアミルアルコール24に再び水相を抽出します。 20秒間ボルテックス、18000×gで遠心分離10分、水相を収集します。
   12. -20℃で一晩、100％イソプロパノールでmRNAを沈殿させる。
   13. 4℃、18000×gで20分間遠心分離。 80％エタノールですすぎます。
   14. 4℃で18000×gで遠心し、10分。それはその後再懸濁することは困難であるように、もはやより5〜10分間室温でペレットを乾燥してみましょう。少なくともを2μg/μlの最終濃度にDNase- RNaseフリー水に再懸濁し、注入混合物中のまともな最終のmRNA濃度を確保する。
   15. 転写産物の品質とサイズを確認するには、20分間150 WでのTBE緩衝液中のRNaseフリーの1％アガロース - TBEゲル上のmRNAの0.5μLを実行します。ストア-80℃で2μlを。
6. ポリリシン被覆ディッシュ
   注：ポリ - リジンCOAテッド皿を注入中に卵母細胞を固定化するために使用される。
   1. 各35ミリメートル細胞培養シャーレ（合計5）については、解凍した0.25 mg / mlのポリL-リジン溶液1mlをペトリ皿の底を覆う。 5分間室温でインキュベートする。
   2. 各35ミリメートル細胞培養シャーレ（合計5）については、別の35ミリメートル細胞培養シャーレに0.25 mg / mlのポリ - リジンソリューションを転送する。 5分間室温でインキュベートする。
   3. 0.25 mg / mlのポリ - リジンソリューションを捨てる。
   4. 2時間室温でペトリ皿を乾燥、逆さまましょう。
   5. 1週間の最大のための汚染を回避するために、4℃でプラスチックラップに包まれたポリ - リジンでコーティングされた料理を保管してください。
7. アガロース被覆ディッシュ
   注：彼らは文化注入した胚に使用されている。アガロースを注入した胚のためのクッションを提供し、皿の底に付着するからそれらを防ぐことができます。
   1. 人工海水（ASW）37〜38グラム/ LのCOMMを使用してください逆浸透水でercial塩+ 0.25mMのNaHCO _3で 。
   2. 電子レンジで溶液を加熱することにより、0.22μmの濾過されたASWアガロース1％の濃度に溶解させる。
   3. 迅速皿の非常に薄いアガロースコーティングを確実にするために、別の1つに35ミリメートルのペトリ皿からの温かいアガロース溶液を注ぐ。
   4. サランラップに包まれたアガロースでコーティングされた料理は1週間の最大のための汚染を回避するために、4℃でラップ保管してください。
8. 注射針の注入ミックスとロード
   1. 注射を開始する前に約2時間、mRNAの1から1.8μgの/μlの最終濃度のRNaseおよびDNaseフリー水で2μL注入ミックスを作る、15％グリセロール、1.25％フェノールレッド。
      注：フェノールレッドの色注入効率と成功して注入された胚の識別の監視を可能にするソリューション、。グリセロールは卵母細胞内のmRNAの拡散に有利に働く。
   2. 18,000×gで遠心分離し4分ペレットの結晶。使用するまで氷上に保管してください。
   3. 10μlのピペットを用いて、結晶がペレット化されたチューブの底を避け、注入ミックス0.5μlのを集める。
   4. 針の大開口の噴射ミックス0.5μlの低下をピペッティングして（注入中の場合で1休憩）は、少なくとも2つの注射針のバックフィル。
   5. 注射ミックスの蒸発を防ぐために4℃で底部に液体と保存瓶に針を取り付ける。注入混合物はゆっくりと気泡の発生を最小限にするために、少なくとも1時間、注射針の先端に移動してみましょう。
   6. mRNAの品質が劣化した後、3つの追加の用途は最大-80℃で保存追加噴射ミックス（データは示さず）。

2.生物材料、マイクロインジェクションの収集と胚培養

1. 卵母細胞と精子コレクション
   注：·セオドショーを参照してくださいら産卵を誘導するため、および配偶子の収集のための詳細なプロトコール^12。
   1. 24時間23℃でASWで衝撃オスとメス。
   2. ほとんどの大人は日没後1〜2時間を起動しますので、日没前に1〜2時間は、19℃でASW内の個々のカップに大人を転送する。
   3. フィルタリングASWに35ミリメートルペトリ皿をすすぎ、それらに皿の底に付着するの卵母細胞を防止するために、ドライ逆さまにしましょう​​。
   4. 産卵時には、すぐに千μlのピペットを用いて精子と卵母細胞を収集する。
      1. 精子を維持し、接点が配偶子の健康に有害であるため、卵母細胞は、成体ナメクジウオから分離した（データは示さず）。
      2. 更に、精子及び卵母細胞の両方を消散動きにつながる、成人驚くべき避けるため、希釈する。可能な限り、アクティブな精子を維持すると、受精率の最適化をできるだけ濃縮精子を収集する。
   5. キープ1.5ミリリットルチューブ内の氷の上で精子。
   6. 前すすぎ、35ミリメートルペトリ皿に濾過ASWに卵母細胞を転送します。
   7. 転送前に注射を実行するための別の35ミリメートルのペトリ皿に300〜400μmの転送パスツールピペットを引っ張った。と100〜500卵母細胞
   8. 精子と卵母細胞の質のために、または他の実験のための対照としてのクラッチの残りを肥やす。
2. 卵母細胞注入
   1. 水平面に対して50°の角度でマイクロマニピュレーターに注射針を取り付けます。
      注：以上の50度の角度は卵母細胞に比べて針位置の適切な監視を許可しませんしながら、50°未満の角度は、皿の上の周りの卵母細胞をプッシュします。
   2. 25X接眼レンズを有する蛍光解剖スコープの下では、フィルタリングさASWを含むポリリジンコートディッシュに300〜400μmの転送パスツールピペットを用いて30卵母細胞を移す。
   3. 運ぶためにラインに沿って卵母細胞を付着させる注文した方法で、注射外と非注入した卵母細胞から注入区別するために。発生中の胚を変形する傾向があるポリ - リジン、卵母細胞の曝露時間を最小限にするために少数（30卵母細胞）を注入した（データは示さず）。
   4. 可能な限り半透明の卵母細胞をレンダリングする暗視野照明を使用してください。
   5. マイクロマニピュレータの粗動ノブで、卵母細胞に近い注射針をもたらす。
   6. 細かい鉗子で、先端が湾曲し始めるレベルで針を切り開く。インジェクターでパルスすることにより、赤注入ミックスは、実際に針から流出していることを確認。
   7. 200Xの倍率でとマイクロマニピュレータの微動ノブで、優しく卵母細胞の核内部に注射針を動かす。
      注：あまりにも表面的に挿入した場合、注入されたソリューションは、卵母細胞内部に残ることはありません。あまりにも遠く挿入した場合、卵母細胞が破壊されます。
   8. 120ミリ秒duratの1-3パルスで注入イオンと1-10 PSI圧力。針が十分に微細であれば、一定の圧力で連続流で注入する。注入量は、単一の卵母細胞の容積の1/3に1/5に対応していることを確認してください。
   9. 注入後、卵母細胞の漏れを回避するために迅速に針を抜く。
   10. 注入されたソリューションは、卵母細胞内で、数秒後に、注入されたソリューションは、卵母細胞全体に広がることに変わりはないことを確認します。
   11. 行の次の卵母細胞へと移動します。
   12. 注入した胚のためにスキャンするときにバックグラウンド蛍光を推定するために、陰性対照として各シリーズのいくつかの非注入胚を保管してください。
3. 注入した胚及び胚培養の受精、選択
   1. とすぐに一連の注入されたように卵母細胞を受精。卵母細胞の品質が時間とともに低下したように^、12を産卵した後1時間以内に卵母細胞を注入して受精さ。
   2. 精子濃度に応じて、卵母細胞への精子の1-5滴を追加し、料理を旋回。
      注：受精エンベロープは、約1分後の胚で明らかになる必要があります。
   3. 卵母細胞の別の一連を注入しながら、胚はポリリジンでコーティングされた皿から切り離しできるようにする。
   4. アガロースでコーティングされたペトリ皿に600μmの転送パスツールピペットで胚を転送します。可能な限り2細胞期の前にあれば、できるだけ早くポリ - リジンコートディッシュから胚を削除します。
      NOTE：ポリリジンへの長期曝露の場合、胚は皿の底に触れる側に平坦化稠密胞胚、​​になる傾向がある。
   5. 4細胞期に、2セルでは、DSRフィルター付き蛍光解剖スコープで正常に注入胚、 すなわち、フェノールレッド由来の赤色蛍光シグナルを示す正常な形態を有するものを選択する。
   6. 所望の段階のためになるまで19℃でアガロースでコーティングされたペトリ皿中で濾過ASW中で培養中の胚を保つin vivoイメージングで。

結果

上記の詳細なプロトコールは、Bのマイクロインジェクションのための基礎を提供するlanceolatum卵母細胞、したがって、Bの開発に導入するためin vivoイメージングのための蛍光タンパク質をコードするmRNAのlanceolatum胚 。技術は、確かに堅牢で信頼性があるが、このプロトコルを使用して成功した注射の速度は可変（ 表1）のままである。この魅力的な事実のために非常に可能性のある説明は、卵母細胞のクラッチの極端な変動性である：射出圧力を受けたときに別の卵のバッチは、確かに、非常に異なる挙動を示すん。いくつかの卵母細胞ではなく、弾性であり、他はかなり堅いであり、注入時にラウンドをしたまま、皿の底に平らにする傾向がある。さらに、いくつかの卵母細胞のバッチは、他の人が簡単に溶解する（データは示さず）が、注射の際、絨毛膜を膨張させる傾向がある。明らかな相関関係は、注入および胚の際卵母細胞の挙動との間に確立することができなかった受精後開発。これは、マイクロインジェクションのために最も適した卵母細胞のカテゴリ予測する...

ディスカッション

この記事では、Bの注入のために、初めて、詳細かつ再現可能なプロトコルを提示lanceolatum卵母細胞、その、後にB. floridae ^13,14及びB. belcheri ^15は 、このようにしてそのような技術が記載されている第3ナメクジウオ種である。重要なことに、ここで説明するプロトコルは、Bの蛍光タンパク質の生産に適したベクター系の記述を含むインビトロで生成注射されたmRNAからlanceolatum（後述）。一緒に、これらの新しいツールは、ナメクジウオの早期開発とそのような切断や腸形成などの胚における最も初期の形態形成のイベントの根底にある動的な細胞の挙動の分析のin vivoイメージングで許可。

一般的には、マイクロインジェクション技術は、特定の化合物の予め定義された容積の標的細胞への送達を可能にするという利点を有する。このさsの助剤は、この技術の一つの主要な制限は...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
消耗品
35 mm シャー	Falcon	353001	Culture-treated
Filtration unit (Stericup 1 L)	Fisher	W21719	0.22 μm
Spin-Xチューブ	Costar	8160	0.22 μm
直径1.2mmの毛細血管用針収納ジャー	WPI	E212
パスツールピペット			長さ230mm
吸引チューブ	ダッチャー	75056
注射針用毛細血管	サッターBF	120-94-10	フィラメント付きホウケイ酸ガラス、外径 1.20 mm、内径 0.94 mm、長さ 10 mm
Reagents
低融点アガロース	Σ	A9414
フェノールレッド	シグマ	114537
グリセロール		Σ G2025
ポリ-L-リジン臭化水素酸		Σ P9155
H2O, DNase/RNase-free	Gibco	10977-035
mMessage mMachine SP6 転写キット	Ambion	AM1340	mRNA 合成キット
フェノール pH 8	Sigma	P4557
24:1 クロロホルム:イソアミル酸アルコール	Sigma	C0549
5:1 フェノール pH 4.7:クロロホルム	Σ	P1944
リーフ クリスタル塩 (200 kg)	Europrix		市販の塩
NaHCO3	Sigma	S6014
Equipment
Fluorescent 解剖スコープ、倍率200倍	ライカ	MZ16F	25X接眼レンズ、DSRおよびGFP2フィルター
マイクロマニピュレーター	マルザウ	ザーM-33
インジェクター	ピコスプリッツァー	モデルIIIII
ニードルプー	ラーSutter	P97	Heating-filamentニードルプーラー
ファイン鉗子Fine	Science Tools GmbH	11252-30	Dumont #5

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