ラット頸動脈における血管バルーン傷害と管腔内投与

サマリー

このプロトコルは、ラット頚動脈上の管腔内損傷を引き起こすと今後新生内膜過形成を誘発するためにバルーンカテーテルを使用しています。これは、傷害に応答する脈管リモデリングのメカニズムを研究するための十分に確立されたモデルである。また、広く、潜在的な治療的アプローチの有効性を決定するために使用される。

要約

ラットでの頸動脈バルーン傷害モデルは、よく20年以上のために確立されている。それは、血管平滑筋分化、新生内膜形成および血管リモデリングに関与する分子や細胞メカニズムを研究するための重要な方法のまま。雄Sprague-Dawleyラットをこのモデルのために最も頻繁に用いられる動物である。女性ホルモンは血管疾患に対して保護的であり、したがって、このプロシージャにバリエーションを導入として雌ラットは好ましくない。左頸動脈は、一般的に、陰性対照として右の頸動脈に怪我をされている。左頸動損傷は、内皮をdenudesとs血管壁を膨張させる膨張したバルーンによって引き起こされる。損傷後、そのような薬理学的化合物および遺伝子またはshRNA転送のいずれかの使用のような潜在的な治療戦略を評価することができる。典型的には遺伝子またはshRNA転送のため、血管内腔の負傷した部分が局所的にvで30分間形質導入され損傷した血管壁の送達および発現のためのタンパク質またはshRNAのいずれかをコードするIRAL粒子。増殖性血管平滑筋細胞を表す新生内膜肥厚は、通常、損傷後2週間でピーク。容器は、主に細胞および分子細胞シグナル伝達経路の解析、並びに遺伝子及びタンパク質発現のために、この時点で収穫される。容器はまた、意図された実験の目的に応じて、特定のタンパク質または経路の発現及び/又は活性化の開始を決定するために、以前の時点で収穫することができる。容器は、組織学的染色、免疫組織化学、タンパク質/ mRNAのアッセイ、および活性アッセイを用いて特徴付けし、評価することができる。同じ動物からの無傷の右頸動脈は理想内部対照である。分子および細胞パラメータにおける傷害誘導変化は、内部右側対照動脈に損傷動脈を比較することによって評価することができる。同様に、治療法は傷を負う比較することによって評価することができますコントロールにDと治療動脈は唯一の動脈を負傷した。

概要

バルーンカテーテルは、血管内のアテロームまたは血栓閉塞部位を広げる目的で、血管形成術の手順で使用する医療機器である。狭め血管内腔は、膨張バルーンによって開くように強制され、血液供給は、狭心症、心筋梗塞、および下肢痛のような下流の虚血症状を緩和するために連続的に復元される。それにもかかわらず、血管形成術の大成功は、そのような血管内腔（再狭窄^）1の再狭小血管気圧外傷（バルーン損傷）、すなわち血管壁リモデリングを引き起こす力の結果として、多くの場合、術後の合併症によって減少されました。

多くの動物モデルは、研究者は、バルーン損傷に関連する血管壁リモデリング^2のメカニズムを理解するための血管形成術を模倣開発されてきた。モデリングのために利用されるすべての動物種の中では、ラットは、最も頻繁にものを用いられる。 ℃ウサギ、イヌおよびブタにompared、ラットの利点は、その低コスト、使用が比較的容易とラットの生理学の現在の知識である。マウスは、遺伝子操作株の広い範囲で追加の利点を有するが、マウスの血管は、バルーンカテーテルを挿入するには小さすぎる。過去30年間にわたり、実験ラットは、研究者が^3-6を改造新生内膜形成と血管を支える分子·細胞メカニズムのより良い理解を得ることができました。バルーン傷害を越え、血管リモデリングはまた、アテローム性動脈硬化症^7,8、高血圧^9、及び動脈瘤¹⁰などのほとんどの主要な血管疾患に関与している。このように、知識は、バルーン傷害モデルを通して得、一般に、全体的な血管壁の疾患の研究に有益である。

ラットバルーン傷害モデルの全体的な目標は、だけでなく、さらに血管疾患を理解するだけでなく、のための新規薬剤の効力を試験することである疾病コントロール^11,12。再狭窄の現在の臨床薬物治療は、右血管形成術後の血管内腔を介して配置された薬剤溶出ステントにより適用される。動物モデルでは、新しいエージェント·テストのための効率がさらに経済的な方法は十分に開発されたローカル腔内灌流法である。候補このメソッドを使ってテストされている薬剤の小分子薬を含んで^13,14、サイトカインまたは成長は^15,16因子 、薬剤を操作する遺伝子（cDNAクローンは、siRNA など ） を ^17-20、及び新規な医薬製剤^21,22。

これまでに、ラットバルーン傷害モデルは、血管疾患/障害を研究するための最も有用なモデルの一つである。それは、最初のステップは、in vivoでのin vitroでの移動は、通常のように、ベンチからベッドサイドへの基本的なステップですが、それは最後の1であってはならない。ラットの実験の結果は、審議し、さらに人間への変換の前に特徴付けされる必要があるによる血管床および血管の解剖学的構造ならびにヒトおよびラットの^23〜26との間の本質的な種差の差に臨床使用。それにもかかわらず、それはまだ翻訳医学研究に不可欠なツールである。このような研究は、遺伝的に改変されたラットの欠如によって制限されるために使用されるが、このようなジンクフィンガーとしての新規なゲノムアプローチは^{29ノックアウト}ラットを簡単にアクセスできるようにしている^、27ヌクレアーゼTALENs ²⁸およびCRISPR-Casのため、それはもはや問題ではなかった。

プロトコル

注：以下の実験のための動物の使用を見直し、施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。

1.術前手続き

1. 使用前に手術器具を滅菌する。
   1. すべての手術器具を手術前24時間以下オートクレーブ。複数の手術が同日に行われている場合は、手術の間の乾燥ビーズ滅菌器によって楽器を殺菌。
2. フィルター滅菌し、使用前に生理食塩水を。
3. ラットを秤量し、麻酔薬（ケタミン80 mg / kgをとキシラジン7 mg / kgを）の投与量を計算する。
4. 腹腔内（IP）麻酔薬を管理します。
   1. 5〜10分で足指のピンチによる鎮静の妥当性を確認してください。鎮静が完了していない場合は、薬（ケタミン7ミリグラム/ kgおよびキシラジンは0.6mg / kg）を追加の小さな用量を投与。
   2. 針が配信薬、イントラあたりに十分な深さであることを確認してくださいitoneally腹腔内に全体の薬液を提供する失敗は不十分な鎮静の原因になりますので。
      注：注射部位の皮膚の潰瘍及び脱毛は、数日手術後不注意皮下（sc）薬液注入による表示されます。
5. 3ミリリットルの無菌食塩水を皮下（s。c。）注射する。滅菌綿棒を用いて、乾燥から角膜を防ぐために、両眼に眼軟膏を少量適用する。
6. 加熱装置を準備します。マイクロ波または水浴によって事前温熱パッド。
7. 外科プラットフォーム上で仰向け動物を置く。
   1. 腹側頸部領域で毛を削除します。 30秒待ってからガーゼで完全に拭き取って、綿棒で毛リムーバーを適用します。
   2. ポビドンヨードスクラブと70％エタノールで首を綿棒。
8. ガウン、ヘアカバー、外科マスク、眼鏡を含め、個人保護具を使用すること。 STERに置く無菌手術器具や消耗品を取り扱う前に最後に手術用手袋をILE。
9. 暴露だけ首領域との無菌手術用シートでラットをドレープ。

2.外科的処置

1. 外科手術中に、15分毎でつま先のピンチによって、動物の鎮静深度を確認してください。動物はつま先のピンチに応答する場合、ケタミンとキシラジンの追加の小さな用量（初期投与量の10％）を追加します。
2. 左総頚動脈（CCA）を解剖
   1. 首の真ん中にまっすぐ縦切開を作るためにメスを使用してください。皮膚切開のおおよその長さは、動脈1.5-2センチ部分を単離する目的のために1.5〜2センチ。長さは変更される場合があります研究の目的に依存します。
   2. 露骨に皮膚から結合組織を解剖。鉗子のヒントを維持し、皮膚やその下の組織を穿刺しないように注意してください。
   3. 長手方向にalon筋肉層を分析グラム気管の左側。
   4. 筋層を開放すると、密着迷走神経と左CCAを視覚化する。ぶっきらぼうにストレッチ最小限に迷走神経を分離するために細心の注意を払って左頸動脈と一緒に解剖する。
   5. 分岐点まで遠位にCCAを解剖。内頸動脈（ICA）と外頚動脈（ECA） - 慎重に分岐し、2つのブランチ解剖。
   6. 動脈1.5-2センチ約部分が周囲の組織から分離されるまで、CCAの周りに解剖してください。
3. バルーン障害
   1. 恒久的には約5ミリメートル離れて分岐からECA上の合字を作る。永久にECAとICAの分岐に近いECAの後頭部枝を連結。どんな場合にも恒久的に分岐し、ECAの合字の間場所、他の枝を結紮 - 例えば、上甲状腺ブランチを。すべての合字のために使用される縫合糸は4-0黒ですシルク。 CCAの近位端とICAの先端にクリップ。
      注：ここで、血流が（CCAとICAに）クリッピングのいずれかを介して恒久的に（ECA上の）ライゲーションを介して、または一時的に停止されました。分岐部領域内の管腔内容物は、全身循環から単離されている。
   2. 小マイクロはさみによってECA上の動脈切開切開を行います。切開は、遠位縫合糸の結び目の近くにあることを確認してください。生理食塩水と綿棒で清掃して血。
   3. ECA内腔に膨張していない2Fバルーンカテーテルを挿入します。 CCA内腔の近位にバルーンカテーテルを進める。クリップは留まるところ、その先端が到達するまで、近位にカテーテルを前進してください。
   4. 3方活栓のメスルアーロックにバルーン膨張デバイスを接続し、バルーンカテーテルに3方活栓の雄ルアーロックを接続します。
   5. 徐々に直径の1.5倍に頸動脈を拡張させるために、約1.5気圧の圧力でバルーンを膨張させる。
   6. ゆっくりと回転戻って分岐部にバルーンを引っ張る。
   7. バルーンを収縮し、近位端に戻ってそれを進める。再びそれを膨らませると引き戻し手順をさらに2回繰り返します。
   8. 動脈内腔からバルーンカテーテルを引き出す。
4. 試薬の管腔内投与（ 例えば、siRNAは、薬）
   注記：ここでは、使用される試薬のいずれかをコードするのshRNAは、間質相互作用分子1（STIM1）または非標的shRNAを制御ターゲッティングレンチウイルス粒子を含有する溶液であった。 STIM1は、原形質膜のCa ²⁺チャネルの活性化を制御するERのCa ²⁺センサであり、増殖、遊走表現型^12,30-33に血管平滑筋分化の間にアップレギュレートされる単一の膜貫通小胞体（ER）タンパク質である。
   1. 注射器（24 G 1.6センチ）に血管内オーバーザニードルカテーテルを取り付けます。テストREAGの吸引除去30μlのソリューションエント。 ECAの同じ切開にカテーテルを挿入します。
   2. CCAにカテーテル先端を進め、カテーテルを固定し、一時的に切開を閉じるためにECA上の単一結び目と縫合糸の部分を結ぶ。
   3. CCAの内腔に検査試薬溶液を注入する。 30分間の血管内腔内の溶液にしてください。生理食塩水で湿った露出した組織を維持し、湿ったガーゼでそれをカバーしています。
   4. インキュベーション後、残りの溶液を吸引する。その単一の結び目を緩め、カテーテルを撤回。
   5. 動脈切開切開に対して近位縫合糸の切れ端でECAを結ぶ。分岐部にできるだけ近い結び目を作る。
5. 傷をクローズアップ。
   1. バルーン傷害とカテーテル導入は、血管の漏れやパンクの原因となりますので、ICA上のクリップを削除し、すべての漏れがあるかどうかを確認します。出血が観察される場合、ガーゼを適用し、出血を止めるために穏やかな圧力を加える。
   2. 削除するCCA上の他のクリップ。
   3. 出血の兆候がないことを確認し、すべてのクランプや他の手術器具を取り外します。余分な縫合糸を切り取ります。
   4. 閉じる傷用いた皮膚縫合糸（4-0黒絹）。 Povidon-ヨウ素または他の抗敗血症性/殺菌/殺ウイルス剤を用いて、閉じた傷口のすべての側面に綿棒。滅菌生理食塩水の皮下を3mlを注入する

3.術後の手順

1. 手術後の熱パッドの上にラットを保管してください。ラットに筋肉内注射（IM）を介して0.05​​ mg / kgをブプレノルフィンの1用量を投与。復旧手順の間、湿った動物の目と口を保つ。それは目を覚ましや通院になるまで動物を監視します。
2. それが完全に回復するまで、すべての寝具なしできれいなケージに動物を置きます。回復後、動物を動物室に戻し、個別に収容される。

結果

二週間損傷後、頸動脈を採取し、切片化し、形態学的分析に付す。動脈は、クロス切断し、H＆Eで染色している（ 図1、図2B、Cおよび3）。ラット頸動脈の壁はピンク色の線として表示され弾性板の4層が含まれています。最外部薄層、外弾性板（EEL）と最も内側の薄層、内弾性板（IEL）の間の領域は、メディア平滑筋層（ 図1）である。 IELの内側の面積は内膜、無傷の血管の内皮細胞の単層である。または負傷した容器内の新生内膜過形成。負傷した頸動脈において、培地は、平滑筋細胞の増殖のための制御血管におけるよりも厚い。新生内膜の厚さは、類似または同一の動脈媒体の厚さよりも大きい。外膜はまた、強固なコラーゲン沈着（ 図1B、D）で増粘される。 REAで処理された動脈のために紳士は、新生内膜形成を阻害する能力について試験した（この場合は、STIM1のshRNA）、断面の新生内膜面積を小さく制御負傷した動脈（ 図2）と比較される。 STIM1の発現量が大きく制御負傷した容器に比べて、損傷した血管の新生内膜やメディアで減少したよ...

ディスカッション

ラット頸動脈バルーン損傷はよく2007 ³⁴ Tulisによって記載されている。それは、包括的に博士Tulisこの手順のすべての詳細を説明してきた。この手順を実行するに興味がある読者は非常にTulis 'プロトコルを読むことをお勧めします。しかし、我々は博士Tulisに同意していない一つのことがあります：代わりに生理食塩水または液体のいずれかの種類でバルーンを膨張させるのが、私たちは空気でそれを膨張させるために提案した。私たちの個人的な経験によると、液体が膨張することはほとんど気泡を避けることはできません。また、柔軟傷害手順中に圧力を調整し、動脈に余分な応力や損傷を引き起こすことがより困難である。別の技術的先端が手術中に動物の首をサポートするために、（ペーパータオルやガーゼで作られた）小さな "枕"を使用することです。

これまでの報告とラットバルーン傷害手続きの経験の数年に基づいて、著者らは、わずかに変更されたとsimplifieを生成したdのプロトコル^35。また、右側の損傷後の治療薬の管腔内注入が実証されている。これはおおよそこの生存手術手順の時間を倍増し、したがって、追加の実務経験を必要と...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
フォガティバルーン塞栓切除カテーテル、2フランス語	Edwards Lifesciences, ドイツ	120602F
Deltaphase 操作ボード - 2 パッドと 2 つの絶縁体を含む	Braintree Scientific, Inc.	39OP
LED光源	フィッシャーサイエンティフィック	12-563-501
Hartmann 蚊の鉗子 4" 湾曲	した Apiary Medical, Inc. サンディエゴ, CA	gS 22.1670
Crile Retractor 4" ダブルエンド	Apiary Medical, Inc.	gS 34.1934
その他の手術器具	Roboz Surgical Instrument Company、Inc.、ゲーサーズバーグ、MD
梢静脈内(I.V.)カニューレ、24 G	BD	381312
ケタミンHCl、100 mg / ml、10 ml	Ketaset-Patterson Vet	07-803-6637
キシラジン(AnaSed)、20 mg / ml、20 ml	Ketaset-Patterson Vet	07-808-1947
Buprenex、0.3 mg / 1 ml(5アンプル/箱)	Ketaset-Patterson Vet	07-850-2280
Nairベビーオイル脱毛ローション-9オン	Amazon/Walmart / CVS	N / A
インフレーションデバイス	Demaxメディカル	DID30
D300 3ウェイストップコック	B.Braun Medical株式 会社。
人工涙液軟膏	ラグビーラボラトリーズ、ジョージア州ダルース	N / A

末ス4599543