マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

サマリー

我々は、高解像度の顕微鏡検査のために雲母支持された脂質二重層を調製する方法を提供する。マイカは、原子スケールで透明で平坦であるが、まれに、取り扱いの困難の撮影で使用されていません。我々の調製マイカシートの偶数堆積をもたらし、二層の調製に使用される材料を減少させる。

要約

サポートされている脂質二重層（のSLB）が広く膜特性（相分離、クラスタリング、ダイナミクス）およびこのような薬物またはペプチドなどの他の化合物との相互作用を研究するためのモデルとして使用される。しかしSLB特性は使用される支持によって異なります。

SLB画像化および測定のための一般的に使用される技術は、単一分子蛍光顕微鏡法、FCSおよび原子間力顕微鏡（AFM）である。 AFMは極めて平坦面（一般に雲母）を必要とするほとんどの光イメージング研究は、ガラス支持体上で実施されるため、これらの材料の電荷と平滑特性が強く拡散に影響を与えるので、これらの技術からの結果は、直接比較することはできない。残念ながら、スライドガラスに切断し、雲母の薄いスライスを接着するために必要な手先の器用さの高レベルは、SLBの準備のためのマイカの日常的な使用にハードルを提示します。これは選択の方法、そのような準備マイカになりますが表面は、多くの場合、特に小さなワーキングディスタンス、高開口数レンズを、凹凸（波線）と画像が困難になってしまう。ここでは、脂質小胞沈着およびSLBの準備のために、薄く平らな雲母表面を調製するためのシンプルかつ再現可能な方法を提示する。さらに、当社のカスタムメイドのチャンバーは、SLBの形成のための小胞の非常に小さなボリュームを必要とします。 AFM研究において使用されるものと直接比較され、高品質の脂質二重層表面の、効率的な簡単で安価な製造の全体的な手順をもたらす。

概要

本プロトコルの全体的な目標は、また原子間力と組み合わせることができる光全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）または共焦点顕微鏡を用いて雲母支持された脂質二重層（のSLB）の高分解能イメージングのために雲母表面を調製する方法を示すことである顕微鏡（AFM）。

のSLBは、脂質クラスタリング、相分離、ペプチド、タンパク質または他の化合物^1-5との二重層成分またはそれらの相互作用の動力学の多くの研究のために広く使用されるモデルである。異なる基質は、研究^4,6-8の性質に応じてSLB形成（ すなわち 、ガラス、雲母、二酸化ケイ素、ポリマー）のために使用され得る。典型的な膜の研究では、このようなTIRFMおよびAFMなどの顕微鏡ベースのイメージング技術に依存している。ガラスは透明であるので、従って、TIRFMイメージングのために、ガラス表面は、典型的な選択である。ガラスの製造は比較的容易であり、結果の質は、主に前脂質小胞の沈着に清掃の徹底面で決定。その高距離分解能によるAFMは、雲母表面を必要とします。マイカは完璧な基礎の切断に近いと、ケイ酸塩鉱物である。これにより、新たに切断された雲母が偶数サブナノメートルスケールで膜⁹の高さの差の観察を可能にする、原子的に平坦である。

（FRAP）の光退色後の、蛍光相関分光法（FCS）、（SMT）を追跡する単一分子、および蛍光回復などの方法を用いて拡散研究は、それによって、ガラス、脂質膜のダイナミクスは、それらが堆積される表面の種類に大きく依存することが示されたマイカは、広くさまざまな結果を^10,11を与えることができます。これらの違いは、膜プローブの拡散係数でなく、異なる速度で拡散粒子の別個の集団の検出、およびおそらく異なる状態間の切り替えのみならず挙げられる。

このように、同じ表面（この場合マイカで）使用されない限り、TIRFMおよびAFM技術を用いて得られた結果の直接比較は、しばしば問題となる。 TIRFMおよびAFM二層イメージングは同じ雲母表面^12,13上で実施されたいくつかの研究がありますが、マイカはほとんど主な原因の取り扱いの問題により、光学顕微鏡のために使用されていません。マイカの準備をして、光学接着剤^12を使用してカバースリップに接着された薄いリーフレットの中に手で切断する必要があります。しかしながら、この方法は満足な結果を達成するために、いくつかの練習を必要とする。また、得られた表面は、それらが困難な低ワーキングディスタンス、高開口数レンズを使用すること、およびしばしば波状の厚さである。

このプロトコルに記載のように調製した雲母表面が成功した高分解能イメージングのため重要となる、「うねり」を避け、非常に薄い（〜220ミクロン、170ミクロンのカバーガラスの厚さを含む）と、非常に平坦である。それらを使用することができるTIRFMまたは共焦点セットアップ用。さらに、同じサンプルを、AFMに転送することができ、さらにはTIRFM /共焦点及びAFMと同時に画像化した。これら2つの手法を組み合わせることにより、二分子膜構造¹⁴との拡散挙動の直接的な相関関係が可能になります。雲母表面が新たに切断されるので、清潔で、（ガラス洗浄プロトコルは、通常、ピラニア溶液、硫酸ナトリウム/水酸化カリウムなどの化学物質を含む）時間がかかり、再現性に乏しい、潜在的に危険な清掃手順を必要としない。また、プロトコルに記載小室、の装着未満、50μlに効果的な二重層形成に必要な小胞の体積を減少させる。最後に、表面アセンブリの全体のプロセスは時間がかかるでない（調製物は、30分未満を要する）、および従来の、雲母切断および接着が行うように、操作の熟練度が高い必要としない。

プロトコル

1。マイカやスライドの準備

1. 場所番号1.5（0.17ミリメートル）は、染色ラックにカバースリップ。
2. 60℃で2％の洗剤中の30分間の超音波処理
3. 脱イオン水で20回洗浄する。
4. ピンセットを用いてスライドを削除して、圧縮空気や窒素を用いたドライ吹く。
5. マイカシートをハサミやカミソリの刃を使用して10×10ミリメートル角に切る。
6. カミソリの刃を使用して、2月3日より薄いリーフレットに各マイカピースをカット。
   注：このステップでは、鋭い刃を使用する必要があります。

2。マイカ組み立てと装着室

1. エタノールで、顕微鏡ガラススライドを清掃してください。
2. 光学接着剤を用いてガラススライドに、ステップ1.6に切断した雲母の接着剤リーフレット。低粘度の接着剤は、より良いドロップを広げて、雲母を接着することをお勧めします。
3. 、UVランプ下で10分間硬化させる。
   NOTE：接着剤は、380nmから350の範囲の最大吸収とのrequ推奨されるエネルギーでUV光によって硬化される完全硬化のための赤外発光ダイオードは、4.5 J / cm ²である。しかしながら、異なる光源は、（接着剤供給業者によって提供される資料を参照）は、この工程のために使用することができる。
4. スコッチテープで最初の数層を除去することにより、クリーンな雲母表面を露出。
5. 雲母表面上に光学接着剤の小滴（〜20μm）を配置します。
   注：このステップでは、低自家蛍光のレベルの高粘度の接着剤をお勧めします。我々の経験は、低（ステップ2.2）の組み合わせを用いて、高粘度の接着剤は著しくマイカ分割（ステップ2.7）の有効性を増加させることを示した。
6. ゆっくりと1分間沈降させ、気泡を避けて、接着剤のドロップにしたばかりのきれいにカバースリップを配置。
7. 、UVランプ下で10分間硬化させる。
   注：このステップの後、スライドガラス、マイカ、カバースリップのサンドイッチは、（数週間まで）比較的長期間保存することができる。雲母表面が新鮮であることを確認するために、単に実際のSLBの準備の前に次のステップに進みます。
   注：接着剤は、380nmから350の範囲の最大吸収をUV光で硬化させ、完全な硬化に必要なエネルギーが推奨さ4.5J/cm ²である。しかしながら、異なる光源は、（接着剤供給業者によって提供される資料を参照）は、この工程のために使用することができる。
8. exactoナイフを使用して、ビデオのように優しく側のガラススライドからカバースリップをマウント解除。ほとんどの場合、マイカの薄くて平らな層がカバーガラスに付着したままになります。スライドガラスに付着雲母（ステップ2.4​​から繰り返す）再利用することができる。
9. マイカ層がまだカバーグラスに接着され、ステップ2.8での分裂の際に、完全に除去されなかったことを確認するために、肉眼で、または解剖顕微鏡で表面品質を確認してください。ピンセットで細かい傷を作ったり、針を解剖すると、マイカとは検出異なる一貫性を持っている接着剤を区別するのに役立ちます。
10. 1.5ミリリットルからゴム製のシールを取り外しバイアルキャップと光を用いて表面に逆さまにキャップを接着接着剤やマニキュア、UVランプで硬化、または空気が、それぞれ、10分を乾燥させます。
    注：サンプルはAFMイメージングとの同時光学（TIRFMまたは共焦点）のために準備されている場合は、1.5ミリリットルバイアルキャップは、顕微鏡のステージ上でのAFMヘッドをマウントするには小さすぎる可能性があります。その場合、キャップは、AFMヘッドを取り付けるのに適した大きい直径を有する任意のプラスチック製のO-リングによって置換され得る。実験は、雲母表面を損傷することなく、キャップを除去する必要が場合には、シリコーングリースではなく、接着剤またはマニキュアを用いることもできる。

3。支持された脂質二重層（SLB）の形成

1. 表面室に新たに調製したリポソーム溶液を配置します。 SLBの形成に必要な最小量は、約30μlのである。
   注：リポソームおよびSLBの形成の詳細については、このようなバッグらなどのような公開されたプロトコルを参照してください、2014 ^15。
2. 目的のプロトコルを使用して、SLBの形成を進める。インキュベーション中とイメージングは​​、チャンバは、熱ブロックまたはそれらの溶融温度以上使用されている脂質を維持するために必要な温度を維持するために加熱された顕微鏡ステージに配置することができる。

結果

のSLBにおける蛍光脂質プローブの拡散挙動は、基質に応じて異なる。 SMT技術と組み合わせたTIRFMは、粒子の動きを可視化し、それらの拡散係数を抽出するための有益な方法である。ガラスと雲母上に支持DOPC（1,2 -ジオレオイル-sn-グリセロ-3 -ホスホコリン）二重層中に拡散するスフィンゴ-Atto647Nからプローブの単一分子信号が取り付けアニメーションの図に示されている。雲母表面は、ここに提示プロトコールに従って調製した。光学収差を推定するために、半値全幅（FWHM）を測定し、モザイク2D PSFサイズImageJのプラグ^16,17を用いて20点広がり関数（PSF）にわたって平均した。ガラスと雲母のため、測定FWHMはそれぞれ441nmと464nm（ 図1）であった。ガラスと雲母上での結像の間の解像度の22nmノードの違いは重要ではありません。どちらの場合も、各単一蛍光分子のPSFの重心はLOCAすることができます連続したフレームにlized、モザイク粒子トラッカーImageJのプラグイン^16,17と時間をかけて粒子軌道にリンク。 ...

ディスカッション

このプロトコルは、脂質二重層の沈着及び高分解能イメージングのための滑らかで薄い雲母表面を調製するための方法が記載されている。技術は、主に高品質の雲母表面を得るために重要であるガラスマイカ - ガラスのサンドイッチ（ステップ2.8）、慎重に解体に限定最小限の手動スキルを必要とします。マイカは、切断せずに光学接着剤から剥離することが可能であるので、新たに切断された雲母の検査は、常に光学接着剤の露出領域を残して、この時点で必要とされる。つまり、接着剤ではなく、マイカに二重層の不要な堆積が発生する場合があります。雲母表面は、いくつかの例外を除き、我々が得一様に高い光学イメージング品質から判断すると、カバーグラスの表面に平行して説明した方法で使用して製造。したがって、我々は追加の検証の必要性を見ていない。

チャンバーの取り付けの最後のステップは、カスタマイズすることができます。ビデオチュートリアルを示し室として使用されている1.5ミリリットルガラスバイアルのプラスチックキャップが、しかしながら、これは任意の同様の形状の物体と所望の寸法で置換でき、そのホルダーを含むサンプルをAFMヘッドに適合...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バスソニケーター	フィッシャーサイエンティフィック	FB15051
カバースリップ24 x 50 mm - いいえH1.5	マリエンフェルド	102222
DOPC	Avanti極性脂質	850357 Hellmanex
III(洗剤)	Hellma Analytics	320.003
カV-1グレード	SPI	サプライヤー1872-CA
光学接着剤(高粘度)	ノーランドプロダクツ	NOA63
光学接着剤(低粘度)	ノーランドプロダクツ	NOA60
スフィンゴミエリンATTO647N	アトテック	AD 647N-171
UVランプ	シノプティクス(株)	GelVue GVM20	ランプは 100% の電力に設定されました

マイ