細胞内細菌によって遠藤-リソソームシステムの再構築を検討するために、蛍光ナノ粒子の応用

サマリー

この記事では、合成とナノ粒子（NPS）の蛍光標識するための方法を説明します。 NPは、真核細胞のエンドリソソーム系を標識するために、パルスチェイス実験に適用した。細胞内病原体サルモネラ·エンテリカの活動によって、エンド-リソソームシステムの操作は、ライブセルイメージングが続き、定量化した。

要約

望ましい化学的、光学的および機械的特性を有する蛍光ナノ粒子（NPが）、細胞内小器官を標識するための有望なツールである。ここでは、真核細胞のエンド-リソソームシステムにラベルを付け、細胞内病原体サルモネラ·エンテリカによりホスト細胞経路の操作を監視するために金-BSA-ローダミンNPSを使用する方法を紹介します。 NPは容易に後期エンドソーム/リソソームにHeLa細胞によって内在して局在していた。 サルモネラ感染症はSalmonella-誘起膜構造における小胞およびNPの蓄積の再配置を誘導した。我々は、共焦点顕微鏡画像の定量分析のためのIMARISソフトウェアパッケージを展開。非感染細胞内のオブジェクトの数とそれらのサイズ分布は、WT サルモネラによってエンドリソソーム系の非常にリモデリングを示す、 サルモネラ感染細胞におけるものとは異なっていた。

概要

金属などのNP、量子ドット、ポリマーのNP、シリカNPは、カーボンドットを含む、蛍光ナノ粒子（NPは）、過去数十年の間^、1,2-かなりの注目を集めている。従来の有機染料に比べて、蛍光性NPは、このような強力な信号強度、光退色に対する抵抗性及び生体適合性の高い^3,4のような望ましい化学的、光学的および機械的特性を示す。これらの利点は、それらの細胞内のセンシングと生細胞イメージングのための選択の方法にする。さらに、電子密度の高いNPの様々な生細胞の組み合わせは、光学顕微鏡（LM）とEM ⁵と超微細構造レベルでのより高い分解能でトラッキングすることができ、相関顕微鏡分析のためのそれらの使用を容易にする、電子顕微鏡（EM）から見える。例えば、金NPは、効率的に感受性の診断のための生細胞におけるバイオセンサーとして、ならびに免疫標識⁶の分野で使用される長い時間であった。最近のStudiesは、異なるサイズおよび形状を有する金NPが容易に大きな電位が細胞内小胞輸送の追跡およびエンドリソソーム系標識^7,8を申請しているため、細胞株の大様々な取り込みおよび日常エンドソーム経路を介して輸送され得ることを示す。

そのようなサルモネラ·エンテリカ 、 赤痢菌およびリステリアなどの微生物病原体は、非食宿主細胞^9に侵入するために異なるメカニズムを開発しました。内在化された後に、病原体のいずれかのサイトゾルに局在または膜結合区画に隔離は、それらのホスト環境で広範囲に相互作用して、自分の生存^10を優先するように、これらを調節する。例えば、 サルモネラ·エンテリカは、細胞内ファゴソーム区画内に存在し、複製し、感染¹¹上にサルモネラ含有液胞（SCV）と呼ばれる。成熟SCVエンドサイトーシス経路で連続的相互作用を受けてゴルジ装置に向かうトラフィック、およびサルモネラ誘発フィラメント（SIF）などの大規模な管状構造の形成を誘導するが、ネキシン細管ソート、 サルモネラ、分泌キャリア膜タンパク質3（SCAMP3）細管など誘発^。12-14。これらの細菌性病原体が宿主細胞の経路を操作する方法勉強する感染症を理解するために不可欠です。

ここで、金BSA-ローダミンNPは、宿主細胞のエンドリソソーム系を標識するために流体トレーサーとして使用し、ヒトの胃腸病原体サルモネラ·エンテリカ血清型ネズミチフス菌（ サルモネラ ）と病原体の相互作用を研究するためのモデル菌として使用したエンドサイトーシス経路をホストします。 WT サルモネラまたは突然変異株を感染させた非感染細胞と細胞の細胞内の金BSA-ローダミンNPを、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）で画像化した。その後IMARISソフトウェアはサルモネラ感染がエンドソーム/リソソームの極端な再配列を誘導したことを示す、NPの分布を定量した。この方法の説明に続いて、類似の実験は、内在化NPの長期の運命を追跡し、真核細胞のエンドサイトーシス経路上の様々な外因性物質または内因性因子の影響を調査するために設計することができる。

プロトコル

10nmの金ナノ粒子（ゴールド^NPS）15の1の合成

1. 溶液Aを準備します160ミリリットルミリQ、または再蒸留水に2ミリリットル1％水溶液塩化金を追加します。
2. 溶液Bを準備します32ミリリットルミリQ、または再蒸留水に8ミリリットル、1％のトリクエン酸ナトリウム×2、H ₂ Oおよび160μlの1％タンニン酸を追加します。
3. 60℃に溶液A及びBをウォームアップし、攪拌しながら、それらを混合する。すぐに濃い青色を観察します。約15分後に赤色を観察します。その後、95℃まで加熱し5分間保持し、RTに溶液を冷却する。
4. カーボンコーティングされたグリッド上にNP懸濁液のドロップを追加し、空気中で乾燥させる。透過型電子顕微鏡によってNPの大きさや形態を確認してください。

ローダミンN-ヒドロキシエステル（NHS）とBSAとラベリングゴールドNPの2コーティング¹⁶

1. 、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに900μlの30分間15000×gで遠心機を金NPSを追加します。オペアンプtionally月一度に複数のチューブを準備します。
2. 、900μlのペレットに滅菌ミリQ水を再懸濁し、100μlの2mg / mlのBSA / PBSを追加し、上清を捨て、30分間、800rpmでボルテックスに混ぜる。
3. 過剰のBSAを除去するために、60分間15000×gで準備を遠心する。
4. 上清を捨て、そして125μlのPBS中の金-BSA NPSを再サスペンド、1M重炭酸塩の12.5μlを添加する。
5. 使用直前に、金-BSA NPの懸濁液1ミリリットルするローダミンNHS / DMSO溶液30μlを添加、ローダミンNHS / DMSOの10 mg / mlの溶液を調製。光への暴露を避け、800rpmで混合中に室温で2時間（またはO / N）のための反応をインキュベートします。
6. 48時間 - 36の期間にわたって5バッファ変更で4ºCでPBSに対して透析41612-BSA-ローダミンNPSを精製する。
7. NPSを安定させるために、各1ミリリットル金-BSA-ローダミンのNPに200 mg / mlのBSA / PBSの10μlを添加する。 15で、無料またはBSA-ローダミンリリース遠心分離機を削除するには、60分間、000×gで。光への暴露を避け、4℃でOD _520、およびストアを測定する、2 mg / mlのBSA / PBSにペレットを再懸濁する。
8. 、ミリQまたは二重蒸留水でNPを10倍に希釈炭素被覆グリッド上にドロップを追加し、空気中で乾燥させる。透過型電子顕微鏡（TEM）によるNPのサイズ及び形態を確認する。
   NOTE：NPの調製のために使用されるすべての材料は、滅菌した操作は、細胞培養フード内または火炎横ベンチを行った。

ヒーラ細胞の3文化

1. 永久LAMP1-GFPを発現するHeLa細胞を、10％ウシ胎児血清（FCS）を含むDMEM中で培養し、5％CO _2を含む雰囲気中で37℃で増殖させている。
2. 8ウェルチャンバースライド（Ibidi）においても50,000の密度で細胞を播種し、O / Nインキュベートする。

細菌の4。文化

1. 使用サルモネラ·エンテリカ血清型TyphimuriumのNCTC 12023ウィルd軸型（WT）株。比較のために、SIFのキーエフェクターSIFAを欠いSPI2-T3SSとΔSIFAにおける欠損変異株のΔssaVを使用しています。強化されたGFPの構成的発現のためのプラスミドpFPV25.1を保有する菌株を使用してください。
   注：細菌株は、50μg/ mlのカルベニシリンおよび/ ​​または50μg/ mlのカナマイシン（ΔssaV、ΔSIFAを追加してルリア-ベルターニの50μg/ mlのカルベニシリン（WT）を添加した培養液（LB）とLB中で日常的に培養され、 ）プラスミドを維持するために必要である。
2. 適切な抗生物質で3ミリリットルのLB中の細菌の単一コロニーを接種し、新鮮なLBで1：31に希釈し、3.5時間のために成長を続ける、その後、通気のための条件をとうしながら37ºCでO / Nを育てる。この時点で、培養物を後期対数期に達し、細菌は非常に侵襲的である。 「ローラードラムは「通気試験管培養物をインキュベートするのが便利である。

によるHeLa細胞の感染5。サルモネラとゴールド-BSA-ローダミンNPは、チェース·ラベリングパルス（スキームについては図1を参照）

1. 継代培養した細菌のOD _600を測定し、OD ₆₀₀に希釈= 0.2mlの1 PBS（〜3×10 ⁸ cfu / mlで）、多数のを達成するために、8ウェルチャンバースライド中のHeLa細胞への細菌の適切な量を追加100の感染（MOI）。
2. （この時点を0時間感染後、0時間のπとした）の非内在化細菌を除去するためにPBSで3回洗浄し、細胞インキュベーター中で30分間インキュベートする。 100μg/ mlのゲンタマイシンを含有する新鮮な培養液の300μl添加し、1時間維持する。その後、インキュベーション時間の残りのための10μg/ mlのゲンタマイシンを含有する新鮮な培地で培地を交換してください。
3. 1時間、100μg/ mlのゲンタマイシンを含有する培地とのインキュベーション後、培地を同時（30mMのHEPES、pH7.4で、FCS、L-グルタミン、フェノールレッド、および炭酸水素ナトリウムなしイーグルMEM）培地を撮像して置換されている10μg/ mlのゲンタマイシンをntaining。金BSA-ローダミンNPはOD ₅₂₀ = 0.1の最終濃度を得るために、HeLa細胞に添加される。
   NOTE：金BSA-ローダミンNPはまた、感染の前に、または種々の時点のπで細胞に添加してもよい
4. 1時間のインキュベーション後、培地を除去し、PBSで3回洗浄し、インキュベーション時間の残りの10％のFCSおよび10μg/ mlのゲンタマイシンを含有する新鮮な画像形成媒体の300μlを添加する。
   注意：インキュベーションの時間は、使用のNPおよび細胞株の濃度に依存して変化し得る。 RAW264.7マクロファージに関しては、十分な内在許可OD ₅₂₀ = 0.05の濃度のNPとその30分のインキュベーションを観察した。

6.イメージング

1. 共焦点レーザー走査（CLSM）またはスピニングディスク共焦点イメージングシステムの異なる時点での高分解能イメージングのための加湿環境チャンバーと（SD）顕微鏡を使用する。
2. 温度Cに切り替えontrolシステム、それが安定するまで待ちます。そのような倍率、スキャン速度、分解能、ZスタックなどGFPのために適切な励起/発光の設定を使用し、金-BSA-ローダミンNPのような画像の設定を最適化します。このプロトコルのために、512×512ピクセルの400 Hzのスキャン速度、分解能および0.25μmのZ-ステップサイズを使用。それぞれ、Arレーザ（488 nm）をHeNeレーザー（543 nm）を用いて、GFPと金-BSA-ローダミンエキサイト。セルの形状を観察するための明視野（BF）のチャンネルを含める。他の顕微鏡システムおよび感染条件については、設定に応じて調整されなければならない。
   NOTE：BFチャネル信号の光源がフォトマルチプライヤ（PMT）検出器で検出されたのと同じArレーザを使用する。
3. 指示された時点のPIでは、顕微鏡ステージと記録画像に感染した細胞を含む8ウェルチャンバースライドをマウントします。

画像の7.分析

1. 顕微鏡画像解析ソフトウェアを使用して（参照サルモネラによるエンド-リソソームシステムの再構築を分析する。 「開く」をクリックし、ファイルを選択してデータを開きます。
   注：あるいは、このようなImageJのかFIJIなどのオープンソース·ソフトウェア·パッケージは、定量的画像解析に使用することができる。
2. アイコンにビューを突破クリックのオブジェクトツールバーで新しい表面アイテムを追加します。上をクリック （次）。
3. 関心領域（ROI）を選択し、セグメントROIを分析する。表示エリアには、画像に重ね矩形ボーダー部にROIを表している。対応するX軸、Y軸、Z-フィールドに値を入力するか、直接ROIのサイズと位置を変更するために、プレビューの長方形の矢印をクリックしてください。クリック = "/ファイル/ ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" />（次へ）。
4. ソースチャネルとして、セレクトチャンネル3（ゴールド-BSA-ローダミンNPのための信号）。結果の面積の滑らかさを設定するには、円滑なオプションをチェックします。手動で値を定義するか、自動的に生成された値を受け入れます。しきい値の、絶対強度オプションを選択します。
5. 閾値調整のために、手動オプションを選択して、値を設定します。視域では、表面閾値プレビューは灰色で表示されている。
6. タブ分類表面に得られた表面は、様々な基準によってフィルタリングすることができます。デフォルトのフィルタは「> 10ボクセルの数」、および他のフィルタは、「追加」をクリックして含めることができている。フィルタリングが必要でない場合は、[削除]ボタンをクリックして、すべてのフィルタを削除します。クリック （次）。
7. サーフェス作成を完了するには、上をクリック/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/>（仕上げ）を。オブジェクトのリストで、現在、アイテム·ボリュームと新しい作成表面について、未チェックボックスが表示領域に表示されます。
8. 統計情報をエクスポートします。さて、突破ビューで被験者の色は、その面積に応じて紫から赤に変わる。そして、「プロット番号エリア」テーブルには、統計情報（ 例えば、ID番号とオブジェクトの面積）を示している。クリックでExcelファイルに面1のすべての統計情報をエクスポート （保存）。

結果

金NPは、クエン酸、タンニン酸による塩化金酸の還元を介して、十分に確立された方法により作製した。 図2Aに示すように、合成された金NPは、約10nmのサイズを有する形状に準球形であった。 BSA-コーティングおよびローダミン標識は、それらの形態や大きさ（ 図2B）に影響しませんでした。

これは、金NPは容易に種々の哺乳動物細胞により取り込まれ、エンドサイトーシスシステム⁷で終わったことが報告されている。以前の研究によれば、明るい赤色の蛍光シグナルは、細胞によるNPの効果的な内部移行を示す、金BSA-NPはローダミン（ 図3、WT 5時間のπ）で1時間のインキュベーション後にHeLa細胞において観察された。赤の信号のほとんどは、NPのが後期エンドソームまたはリソソーム中に閉じ込められたことを示し、緑のシグナルと共局在が認められた。しかし、後期エンドソーム/リソソームにおけるNPの一様分布とは異なり、非感染細胞（ 図3、モック）で...

ディスカッション

哺乳動物細胞のエンドリソソーム系は、栄養吸収、ホルモン媒介性シグナル伝達、免疫監視、および抗原提示¹⁷を含む重要な生理的過程を制御する。これまで、種々のマーカーは、エンドサイトーシス経路および追跡調査を標識するために使用されてきた。例えば、リソトラッカープローブは、選択的に低い内部pHの細胞区画に蓄積し、効果的にナノモル濃度¹⁸に住んで細胞を標識することができリソソーム標識に分子プローブ（ライフテクノロジーズ、米国）が開発した蛍光acidotropicプローブ、である。しかしながら、細胞とリソトラッカープローブの長時間のインキュベーションは、リソソームpHの上昇を誘導し、リソソーム¹⁹の潜在的な生理学的変化をもたらし得る。フルオロフォアで標識されたデキストランのようないくつかの大きな生体分子は、また、しばしば、エンドソーム/リソソームの標識に使用される。しかし、低光安定性、短い循環寿命、およびp定着時OOR保持が長期の生細胞イメージングでアプリケーションを妨げると相関顕微鏡は^16,19を研究。ここで、金BSA-ローダミンNPは、宿主細胞のエンドリソソ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化金	Sigma-Aldrich	520918
タンニン酸	Sigma-Aldrich	403040
クエン酸三ナトリウム		Σ C8532
ウシ血清アルブミン	Σ	A2153
NHS-ローダミン	ピアス	46406
DMSO		Σ D8418
HEPES	シグマ	H3375
ゲンタマイシン	Applichem	A1492
Kanamcyin	Roth	T832
カルベニシリン	ロス	6344
8 ウェル チャンバー スライド	イビディ	80826	組織培養処理済み、滅菌
イマリス ソフトウェア	ビットプレーン	バージョン 7.6	さまざまな構成が利用可能