スライスこれホット：生理的温度における急性成人の脳スライス

サマリー

この論文では、切断のための特別な変更(例えば、スクロースの追加)やスライス調製前の動物の心内灌流を伴わない従来の生理学的溶液を使用して、生理学的温度で急性脳スライスを調製する方法を示します。

要約

ここでは、急性脳スライスを調製するためのプロトコルを提示する。この手順は、主に、結果の品質を決定する電気生理学的パッチクランプ実験のための重要な要素である。これは、成熟した動物からの高度髄脳構造を扱う場合は特に、手順を切削中に冷却工程を省略すると、健康なスライスおよび細胞を得るのに有益であることが示されている。上昇した温度のみに依存推測することができ、神経の健康をサポートすることにより、正確なメカニズムは、それはそれを理にかなっていても、可能な限り、スライシングが行われる温度は、温度関連のアーティファクトを防止するために、生理学的条件に近づけるべきである。この方法の別の重要な利点は、手順の単純さと、したがって、短い準備時間である。実証の方法では、成体マウスが使用されているが、同じ手順が若いマウスならびにラットに適用することができる。また、以下のパッチCLアンプ実験は、水平小脳切片上で実行されるが、同じ手順は、他の面と同様に、脳の他の後方の領域で使用することができる。

概要

提示された方法の目的は、特に大人や古い動物を使用した場合、 インビトロ電気生理学的実験のために高品質の急性脳スライスを得ることである。

2エレガントな文章にSkredeとWestgaard ¹に記載されているように急性脳スライス方法は、現代の神経科学研究の基礎となっており、世界中の無数のバリエーションで使用される。スライスの品質は、スライス当たりの生きているニューロンの数、細胞は電気生理学的および形態学的特性を保持し、ならびに組織の完全でない期間に反映される。また、安定した録画の最大の持続時間は、スライスの品質に依存します。このように、数十年に沿って、元のスライス方法は、さらに多くの場合、Oの切断物の複雑な修飾により^、2-10切断後のスライスの回復を強化するために、個々の研究グループによって開発された同様に冷却された生理的なソリューションと動物の心臓内プレ灌流（例えばアスコルビン酸、チオ尿素あるいはH ₂ O _2の追加など）ここで、rリカバリソリューション。

最近^11が示されているように、スライス時の生理的温度は、ニューロンの健康への冷却よりも有益であると思われる。大人（2-8月）げっ歯類で作業する場合の改善が最も顕著である。劇的な温度変化を回避することにより、そのような可塑¹³

プロトコル

このプロトコルで説明されているすべての実験手順はヘブライ大学の動物実験委員会によって承認された。

1.スライスのためのソリューションとツールの準備

1. 表1に記載のイオンを含有する標準生理溶液（SPS）の1リットルを準備します。
   1. 脱イオン水（0.055μS/ cmのコンダクタンス）1000mlので満たされた貯蔵ガラス瓶に予め10倍の最終濃度の塩を含むストック溶液を調製する。塩（塩化ナトリウム、塩化カリウム、KH ₂ PO _4、そしてMgSO _4）を追加し、完全に溶解するまで撹拌する。 4℃での原液を保管してください。
   2. 実験日の最終のSPS溶液を作る。磁気撹拌棒を用いて、グルコース（3.6 g）および_炭酸水素ナトリウム（2.18グラム）を溶解し、精製水700ml中にストック溶液100mlを追加し、1 Lに精製水を上に追加
   3. solutiを平衡〜20分間、95％O _{2/5％CO 2}でそれをガス処理することによってオン。この後、1MのCaCl ₂溶液2mlを加える。
2. 以下のツール（ 図1）を構築。
   1. スライスするための脳と操作するための小さなへらの所望の部分を解剖する....

結果

記載の方法で調製したスライスは、様々な電気および光遺伝学的実験のために使用することができる。 図3A及び図3Cでは、微分干渉（DIC）光学系の下で見、それぞれ水平小脳スライス冠状大脳皮質切片の代表的な例を示している。小脳スライスでは、小脳ニューロンのいくつかのタイプを容易に目標と電気生理学的記録を可能にする、それらの位置及び細胞体形状によって認識することができる。 図3Bおよび3Dにおいては、例えば、自発的にアクティブ小脳ゴルジ細胞および皮質錐体細胞からの電流クランプモードで全細胞パッチクランプ記録からのトレースが示されている。ホットスライスした脳から得られた電気生理学的および光遺伝学的録音の品質の更なる例は、黄とUusisaari ¹¹とレフラーらで見つけることができます^。16。

ディスカッション

氷のように冷たい温度ではなく生理学的温度でマウスから急性脳スライスを調製する方法を実証します。

スライサーブレードの垂直振動が最小限であれば、暖かい条件で得られたスライスの品質は、低温条件で調製されたスライスと比較して優れていることが示されています¹¹ 。生理学的温度でのスライスは、単一細胞やネットワークの挙動の異常に現れる可能性のある代謝プロセス^{の変化17〜19} に関連するものなど、低温によって引き起こされる生理学的アーティファクトを防ぐことができます。さらに、スライス手順は明らかに不必要な遅延なく完了する必要がありますが、スライスを急ぐ必要はありません(氷のように冷たい状態でスライスする場合のように、溶液が温まりすぎる前に切断を終了し、組織の長期凍結による損傷を防ぎます)。したがって、より遅い切削速度を使用できます。これは、非常にデリケートな構造をスライスする場合に有益です。最後に、溶液と脳の両方の冷却ステップを省略することで、手順に必要な時間とその複雑さが大幅に削減されます。溶液を氷のように冷たい温度に冷却するには、溶液を生理学的温.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ペントバルビタール	CTS	170066	濃度: 生理食塩水中で 60 mg/ml。
大きなハサミ	FST	14001-16	斬首には、十分に鋭い刃を持つ大きなハサミまたはギロチンを使用できます
虹彩はさみ	プレステージメディカル	48,148	の刃が1.5–より長くない限り、任意の細い先端はさみを使用することができます。2cm
細先端鉗子	FST	11254-20
メス	FST	91003-12
ブレード#11	FST	10011-00
小さなヘラ	フィッシャー	2350
濾紙			任意の実験室のブランドを使用できます。
ペトリ皿	デュロプラン	Z231509-1
ガラスビーカー	ショット	10022846
パスツールピペット	メープルリーフブランド	14672-029
瞬間接着剤	LOCTITE	4091361/1
スライサー	Campden	7000-smz
セラミックスライシングブレード	Campden	7550-1-C
マグネティックヒーター/スターラー			手続きのためのSPSの加熱用
電気ケトル			温度制御のための水の加熱用
スライス回収チャンバー+加熱ユニット	ワーナー楽器	BSC-HTの+ BSC-BUW	自作モデルも使用できます。
温度計			解剖およびスライス中のSPS温度の監視用

はさみメス