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全ての動物作業はアルバート·アインシュタイン医科大学の動物研究所の規制やガイドラインに従って行われた。
Cの 1。成長条件ネオホルマンス H99（血清型A）
- 個別のC.を育てるサブロー寒天プレート上ネオフォルマンス （CN）コロニー。
- ある日、実験前に1つのコロニーを選択し、サブローブロス10mlを接種。
- 文化は速度250rpmで振盪し、37℃で一晩成長させる。
C57BL / 6マウスから2離と初代骨マクロファージの調製
- もはや呼吸するまでCO 2チャンバー内に動物を配置することによってマウスを安楽死させる。第二の対策として、cervically解剖を開始する前に、首を脱臼。 70％エチルアルコールで身体全体を滅菌する。
- 大腿骨と脛骨の両方を削除し、滅菌DMEM中で骨を置く。
- ドを使用して余分な組織や筋肉を削除する骨が完全にきれいになるまでlicateワイプ。
- 70％のエチルアルコールを含むペトリ皿にだけ無傷の骨を置き、関連する微生物を殺すために3分間インキュベートする。骨を削除し、滅菌したDMEMでペトリ皿に配置します。
- 慎重に骨の端をカット。各骨を25 Gの針を用いて氷上に置い空の50mlコニカルチューブと冷たいDMEMを慎重にフラッシュ10ミリリットル以上の骨を持ってください。
注：各マウスは4骨（大腿骨2、2脛骨）が得られます。したがって1マウスの細胞懸濁液を約40ミリリットルが得られるはずです。 - 650のx gで10分間、室温で遠心細胞懸濁液。
- この遠心分離の間、準備し、フィルタ骨髄マクロファージは20％L929、10％ウシ胎児血清、10％NCTC-109、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、1％HEPES、1％L-グルタミンを補充したDMEMで構成されて媒体を供給する殺菌、非必須アミノ酸、1％、0.1％2 - メルカプトエタノール。
- メディアを送り、10 mlの再懸濁し、得られたペレット。セルsuspensを渡す細胞塊を破壊し、大きな破片を除去するために70μmのセルストレーナーを通してイオン。
- プレート（10プレートの合計）組織培養用に指定されているペトリ皿にメディアを供給する10mlの中に細胞懸濁液1ml。
- 細胞を10％のCO 2、37℃で接着させる。完全にメディアやマクロファージが使用される準備ができている給餌を交換し、7日目、3日目に新鮮な給餌メディアの5ミリリットルを追加します。
- 実験前の日は、給餌培地を除去することによってプレートからマクロファージを外し、プレートに試薬をリッピング優しい電池の5ミリリットルを追加します。
- 37℃で5〜10分間インキュベートし、穏やかにピペッティングしてマクロファージを削除します。
- 10分間650×gでの遠心分離によって細胞をペレット化。
- 給餌培地1mlに再懸濁ペレット。 1:20希釈を使用して、血球計数器上に細胞懸濁液10μlをピペッティングすることにより、マクロファージの濃度を算出。
- 14ミリメートルのガラスを使用すると、ペトリ皿、プレートaを底直接200μlの最大を保持している内側のウェルに1×10 5マクロファージの濃度は、そのように、図4に示すように、このボリュームを超えないように十分注意してください。
- 細胞は1時間37℃のインキュベーター中に皿を置くことによって、ガラスシャーレに付着させる。
- 500 U / mlで1 mg / mlのとのIFNgにLPSを添加した培地を供給する1-2 mlを加え、細胞を一晩インキュベートすることができます。
3プライマリマウスマクロファージおよびCの同時インキュベーションネオフォルマンス
- 実験の日に、420×gで5分間遠心分離することにより、一晩接種し、培養し、ペレット酵母細胞の1ミリリットルを削除します。
- 上記の速度と同時にメディアや多糖類glucuronoxylomannan（GXM）様細胞外クリプトコッカス生成物を除去する滅菌PBSで細胞を3回洗浄する。
- 100希釈：滅菌PBS 1ml中に再懸濁細胞ペレットとは、1を加えます。 tはピペット10μlの彼は血球計数器上に希釈し、細胞をカウントします。 5：1のMOIで酵母細胞を追加します。例えば、1×10 5マクロファージが存在する場合、/ウェル、CNの5×10 6 / mlの細胞懸濁液を作製し、5×10 5 Cnの総額については、この溶液100μlを加える。
- 10μg/ mlの濃度でのmAb 18B7抗体による給餌培地1mlにクリプトコッカス細胞懸濁液の計算されたボリュームを追加する。 5分間室温で細胞懸濁液をインキュベートする。
- ガラスからの給電メディアを取り出し、ペトリ皿底し、滅菌PBSで1倍を洗う。ウェルに直接オプソニンCnの100μlのを追加します。
- 細胞を10％CO 2で37℃で2時間インキュベートすることを許可する。
- 同時インキュベーションの後、マクロファージはCnとを内在化していることを顕微鏡で確認してください。内在化とみなされるには、クリプトコッカス細胞は明らかにマクロファージの範囲内で見られるべきである。
- 任意およびすべてのextracellulaを除去するための無菌のPBSで洗浄するシャーレ3倍R Cnは。
- モノクローナル抗体18B7を添加せずにメディアを供給する1〜2mlのを追加し、顕微鏡を設定します。
4。デジタル光学顕微鏡を利用したリアルタイムでの非溶解性エキソサイトーシスの可視化
注：これらの実験を実行するには、CO 2の配信と加熱ユニットを含む添付インキュベートするチャンバーが付属して顕微鏡が必要となります。
- 実験の前に、37℃で少なくとも30分間インキュベートするチャンバをあらかじめ温め。 CO 2ユニットは実験開始時に5％を読み取っていることを確認してください。
- 置きガラスは、CO 2を蓋でカバーし、全く熱逃げないことを保証するために、すべてのドアを閉じて、顕微鏡プラットフォーム上でペトリ皿底。
- 位相差顕微鏡で10×対物レンズを用いて、感染したマクロファージのクリアフィールドに焦点を当てる。実験に基づいて、研究する必要がどのように多くのマクロファージが使用する目的を決定する。
- TAに顕微鏡ソフトウェアをセットアップします24時間の期間のために、画像ごとに4分KE。
- 24時間後、実験が完了に達しているし、361画像の総数が収集されているであろう。 5％の圧縮で.jpegsとしてこれらの画像をエクスポートします。画像Jソフトウェアを使用して、毎秒5フレームでビジュアル·スタックとして画像を表示します。映画は出版物またはプレゼンテーションのために表示する必要がある場合は、.AVIまたはフォーマットは、視聴者に最も適したかに応じてのMOVファイルのどちらとして保存します。