の非溶解性エキソサイトーシスの可視化クリプトコッカス·ネオフォルマンスデジタル光学顕微鏡を使用したマクロファージから

サマリー

私たちは、マクロファージCを可視化する方法を説明しますネオフォルマンス （CN）デジタル光学顕微鏡を用いて非溶解性エキソサイトーシスの過程で特定の重点を置いて、リアルタイムで相互作用。この技術を用いて個別に感染したマクロファージは、この現象のさまざまな側面を確認するために研究することができる。

要約

クリプトコッカス·ネオフォルマンスによるマクロファージの感染の多くの側面が広く研究と明確に定義されています。しかし、明確に理解されていない一つの特定の相互作用は、非溶解性エキソサイトーシスである。このプロセスでは、酵母細胞は、マクロファージ及びCnの生存の両方を残すあまり理解機構によって細胞外空間に放出される。ここでは、時間の経過顕微​​鏡による24時間の感染期間ごとに個別に感染したマクロファージを大量に従う方法について説明します。感染したマクロファージは、細胞培養インキュベーター中と同じ条件を提供し、顕微鏡に取り付けられたCO ₂雰囲気で加熱室に収納されている。ライブデジタル顕微鏡は、静止画像からは使用できませんホストと病原体との間の動的相互作用に関する情報を提供することができる。各感染細胞を可視化することができれば、マクロファージは真菌感染、およびその逆を処理する方法の手がかりを提供することができます。この技術iは複雑な現象の背後にある力学を研究する上でのsa強力なツール。

概要

クリプトコッカス細胞とマクロファージ間の真菌感染症のステージはよく^1-3文書化されています。酵母細胞は、マクロファージによって摂取された後、相互作用の多様が発生することがあります。マクロファージは、細胞外空間に、その真菌負荷を解放する溶解もあれば、その細胞膜⁴の範囲内で酵母細胞を維持することによって感染を制御することができる。非溶解性エキソサイトーシス、マクロファージは、周囲の環境や隣接セルへクリプトコッカス細胞の一部またはすべてを抹消し、ホストおよび病原体の両方が⁵生存し続けるするプロセス：しかし、数年前に新しい結果が二つのグループによって独立して記述された^-8。いくつかの研究は、この相互作用の背後にある分子メカニズムを理解しようとしましたが、私たちはまだこの現象をドライブかについての完全な理解していません。

リアルタイムで画像をキャプチャし、その後、複数の未感染を分析する能力マクロファージ編は、1つのタイミング、空間的な能力、真菌感染中のマクロファージの形態の変化、さらにはストレスに関して、非溶解性エキソサイトーシスを取り巻く物理的特性についての多くの質問に答えることができます。細胞がインキュベーターに匹敵する環境内に収容されるようにすることによって、私たちはマクロファージ真菌細胞相互作用の動的性質を垣間見ることができる。研究者は、このプロセスのさまざまなコンポーネントを研究するためにこの技術を使用している。別のグループは非溶解性エキソサイトーシスは、タンパク質ドメインの核WASH ^10を削除し^て持っていた細胞内でブロックされたことを示すために、このメソッドを使用しながら、このプロセスにおけるファゴソームの役割は、蛍光染色およびアクチンブロッキング剤^9を使用して明らかにされました。サイトカインシグナル伝達の効果もリアルタイム顕微鏡^11を用いて確認された。このプロセスは、C.に限定されるものではないそれはまた、 カンジダ·アルビカンス、anotheで観察されたようネオフォルマンスマクロファージ^12に感染する能力を有する真菌病原体rを。 これらの知見は、この方法は私達がそんなに少し知っ領域に豊富な情報を提供する方法の例です。

プロトコル

全ての動物作業はアルバート·アインシュタイン医科大学の動物研究所の規制やガイドラインに従って行われた。

Cの 1。成長条件ネオホルマンス H99（血清型A）

1. 個別のC.を育てるサブロー寒天プレート上ネオフォルマンス （CN）コロニー。
2. ある日、実験前に1つのコロニーを選択し、サブローブロス10mlを接種。
3. 文化は速度250rpmで振盪し、37℃で一晩成長させる。

C57BL / 6マウスから2離と初代骨マクロファージの調製

1. もはや呼吸するまでCO ₂チャンバー内に動物を配置することによってマウスを安楽死させる。第二の対策として、cervically解剖を開始する前に、首を脱臼。 70％エチルアルコールで身体全体を滅菌する。
2. 大腿骨と脛骨の両方を削除し、滅菌DMEM中で骨を置く。
3. ドを使用して余分な組織や筋肉を削除する骨が完全にきれいになるまでlicateワイプ。
4. 70％のエチルアルコールを含むペトリ皿にだけ無傷の骨を置き、関連する微生物を殺すために3分間インキュベートする。骨を削除し、滅菌したDMEMでペトリ皿に配置します。
5. 慎重に骨の端をカット。各骨を25 Gの針を用いて氷上に置い空の50mlコニカルチューブと冷たいDMEMを慎重にフラッシュ10ミリリットル以上の骨を持ってください。
   注：各マウスは4骨（大腿骨2、2脛骨）が得られます。したがって1マウスの細胞懸濁液を約40ミリリットルが得られるはずです。
6. 650のx gで10分間、室温で遠心細胞懸濁​​液。
7. この遠心分離の間、準備し、フィルタ骨髄マクロファージは20％L929、10％ウシ胎児血清、10％NCTC-109、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、1％HEPES、1％L-グルタミンを補充したDMEMで構成されて媒体を供給する殺菌、非必須アミノ酸、1％、0.1％2 - メルカプトエタノール。
8. メディアを送り、10 mlの再懸濁し、得られたペレット。セルsuspensを渡す細胞塊を破壊し、大きな破片を除去するために70μmのセルストレーナーを通してイオン。
9. プレート（10プレートの合計）組織培養用に指定されているペトリ皿にメディアを供給する10mlの中に細胞懸濁液1ml。
10. 細胞を10％のCO _2、37℃で接着させる。完全にメディアやマクロファージが使用される準備ができている給餌を交換し、7日目、3日目に新鮮な給餌メディアの5ミリリットルを追加します。
11. 実験前の日は、給餌培地を除去することによってプレートからマクロファージを外し、プレートに試薬をリッピング優しい電池の5ミリリットルを追加します。
12. 37℃で5〜10分間インキュベートし、穏やかにピペッティングしてマクロファージを削除します。
13. 10分間650×gでの遠心分離によって細胞をペレット化。
14. 給餌培地1mlに再懸濁ペレット。 1:20希釈を使用して、血球計数器上に細胞懸濁液10μlをピペッティングすることにより、マクロファージの濃度を算出。
15. 14ミリメートルのガラスを使用すると、ペトリ皿、プレートaを底直接200μlの最大を保持している内側のウェルに1×10 ⁵マクロファージの濃度は、そのように、図4に示すように、このボリュームを超えないように十分注意してください。
16. 細胞は1時間37℃のインキュベーター中に皿を置くことによって、ガラスシャーレに付着させる。
17. 500 U / mlで1 mg / mlのとのIFNgにLPSを添加した培地を供給する1-2 mlを加え、細胞を一晩インキュベートすることができます。

3プライマリマウスマクロファージおよびCの同時インキュベーションネオフォルマンス

1. 実験の日に、420×gで5分間遠心分離することにより、一晩接種し、培養し、ペレット酵母細胞の1ミリリットルを削除します。
2. 上記の速度と同時にメディアや多糖類glucuronoxylomannan（GXM）様細胞外クリプトコッカス生成物を除去する滅菌PBSで細胞を3回洗浄する。
3. 100希釈：滅菌PBS 1ml中に再懸濁細胞ペレットとは、1を加えます。 tはピペット10μlの彼は血球計数器上に希釈し、細胞をカウントします。 5：1のMOIで酵母細胞を追加します。例えば、1×10 ⁵マクロファージが存在する場合、/ウェル、CNの5×10 ⁶ / mlの細胞懸濁液を作製し、5×10 ⁵ Cnの総額については、この溶液100μlを加える。
4. 10μg/ mlの濃度でのmAb 18B7抗体による給餌培地1mlにクリプトコッカス細胞懸濁液の計算されたボリュームを追加する。 5分間室温で細胞懸濁液をインキュベートする。
5. ガラスからの給電メディアを取り出し、ペトリ皿底し、滅菌PBSで1倍を洗う。ウェルに直接オプソニンCnの100μlのを追加します。
6. 細胞を10％CO ₂で37℃で2時間インキュベートすることを許可する。
7. 同時インキュベーションの後、マクロファージはCnとを内在化していることを顕微​​鏡で確認してください。内在化とみなされるには、クリプトコッカス細胞は明らかにマクロファージの範囲内で見られるべきである。
8. 任意およびすべてのextracellulaを除去するための無菌のPBSで洗浄するシャーレ3倍R Cnは。
9. モノクローナル抗体18B7を添​​加せずにメディアを供給する1〜2mlのを追加し、顕微鏡を設定します。

4。デジタル光学顕微鏡を利用したリアルタイムでの非溶解性エキソサイトーシスの可視化

注：これらの実験を実行するには、CO ₂の配信と加熱ユニットを含む添付インキュベートするチャンバーが付属して顕微鏡が必要となります。

1. 実験の前に、37℃で少なくとも30分間インキュベートするチャンバをあらかじめ温め。 CO ₂ユニットは実験開始時に5％を読み取っていることを確認してください。
2. 置きガラスは、CO ₂を蓋でカバーし、全く熱逃げないことを保証するために、すべてのドアを閉じて、顕微鏡プラットフォーム上でペトリ皿底。
3. 位相差顕微鏡で10×対物レンズを用いて、感染したマクロファージのクリアフィールドに焦点を当てる。実験に基づいて、研究する必要がどのように多くのマクロファージが使用する目的を決定する。
4. TAに顕微鏡ソフトウェアをセットアップします24時間の期間のために、画像ごとに4分KE。
5. 24時間後、実験が完了に達しているし、361画像の総数が収集されているであろう。 5％の圧縮で.jpegsとしてこれらの画像をエクスポートします。画像Jソフトウェアを使用して、毎秒5フレームでビジュアル·スタックとして画像を表示します。映画は出版物またはプレゼンテーションのために表示する必要がある場合は、.AVIまたはフォーマットは、視聴者に最も適したかに応じてのMOVファイルのどちらとして保存します。

結果

この技術は、生成した画像は、細胞がC.貪食された後に何が起こるか、周囲の情報を収集するためのさまざまな方法で分析することができるネオフォルマンスは、 図1に見られるように、感染したまたは感染していないのいずれかである約100マクロファージである。これらのマクロファージのそれぞれは、視聴者に非常にミクロなレベルでの宿主 - 病原体相互作用を研究する機会を与えてくれます。 図2及び図3のように、マクロファージおよび酵母細胞の間で、さらにはマクロファージマクロファージとの間で発生する可能性が異なる結果があります。マクロファージは、非溶解性エキソサイトーシス、細胞 - 細胞伝達、または発生する可能性のある他の細胞過程を経るとしてスコアすることができます。感染の間のこのようなイベントのタイミングは、映画が記録されているときに設定されたパラメータに基づいて確認することができる。

ディスカッション

ここでは、真菌 - マクロファージ相互作用が24時間の期間にわたってリアルタイムで記録し、分析することができる方法を記載している。私たちの研究室では、非溶解性エキソサイトーシスの時間的な側面の多くを研究するために、このプロトコルを使用しており、このプロセスを囲む形態学的要素を確認するために、リアルタイムの顕微鏡を使用し続けます。

この技術は理想的な結果をもたらすために、特別な注意がプロトコルにおける特定のステップに与えられるべきである。個別のセルの動きとの相互作用の視聴が妨げられるようにあまりにも少数の細胞が重要ではないデータを生成するかもしれない非常に多くの細胞が、使用できないムービーを作成することができますので、前の晩にメッキされているセル密度が重要です。目標は、個別のマクロファージが感染期間の間、続くことができるように、マクロファージの等間隔のフィールドを達成することである。その同じ静脈では、細胞外Cnを離れて洗浄して元のような重要なステップであるtracellular Cnは、フィールドを不明瞭にし、マクロファージの可視性の損失につながる可能性が時間をかけて分割します。映画...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Sabouraud Dextrose Agar	BD	DF0109-17-1
Sabouraud Dextrose Broth	BD	DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal Calf Serum (FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
ペニシリン-ストレプトマイシン	Gibco	15140-122
HEPES バッファー	Corning Cellgro	25-060-CL
Glutamax	Invitrogen	35050-061
非必須アミノ酸	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-メルカプトエタノール	Invitrogen	21985-023	有毒
な 3003 組織培養ペトリ皿	フィッシャーサイエンティフィック	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-Tek ガラス底培養皿	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
マウス IFN-g	ロシュ	NC 9222016
mAb 18B7	当研究室
Axiovert 200Mインキュベーティングチャンバー付き顕微鏡	Zeiss

で生産した非商業抗体