現在の適正製造基準（c）ガイドラインに従って、動物製品を含まない試薬を使用してヒト羊膜上皮細胞（hAECs）を単離し培養するプロトコルを記述します。
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この記事について
サマリー
要約
ヒト羊膜上皮細胞（hAECs)は、再生医療のための細胞の潜在的な供給源として研究者や臨床医から注目を集めています。この関心の理由は、これらの細胞が高度に多能性の分化能力、低い免疫原性、および抗炎症機能を持っているという証拠です。これらの特性により、研究者は前臨床動物実験でさまざまな疾患や障害の治療に使用できるhAECの可能性を調査するようになり、大きな成功を収めています。
hAECは、さまざまな病気や障害の治療に広く適用されています。hAECの潜在的な臨床応用には、脳卒中、多発性硬化症、肝疾患、糖尿病、慢性および急性肺疾患の治療が含まれます。前臨床試験から臨床試験へと進むためには、細胞治療製品の品質管理と安全性の高水準が求められています。安全性および品質管理の考慮事項として、細胞単離プロトコルでは動物製品を含まない試薬を使用することが好ましい。
私たちは、研究者が動物性食品を含まない試薬を使用してhAECを分離、凍結保存、培養するためのプロトコルを開発しました。この方法の利点は、これらの細胞を単離、特性評価、凍結保存、培養することができ、有害な動物病原体をヒトに送達するリスクなしに、適切な細胞収量、生存能力、増殖能力を維持できることです。動物前研究から臨床試験に移行する研究者にとって、これらの方法論は規制当局の承認を大幅に加速し、リスクを減らし、治療用細胞集団の品質を向上させるでしょう。
概要
そのような胎盤などの周産期の供給源に由来する細胞は、胎盤膜、臍帯および羊水は再生医療1,2のための細胞の潜在的な供給源として研究者や臨床医から注目を集めている。この関心の理由は、これらの細胞型すべてが可塑性および免疫調節機能3、彼らの潜在的な治療への応用の基礎となる性質をある程度持っていることである。
HAECを回生細胞物質の豊富な潜在的な源を提供する、用語または早産羊膜4に由来することができる不均一な上皮細胞集団である。細胞療法として魅力HAECをを作る特性は、それらの多能、低い免疫原性、および抗炎症性を含む。 HAECをはcardiom（中胚葉系統に分化する能力、in vitroおよびin vivoの両方で非常に多能性であることが判明しているyocytes、筋細胞、骨細胞、脂肪細胞）、内胚葉系統（膵臓細胞、肝細胞、肺細胞）および外胚葉系統（毛髪、皮膚、神経細胞とアストロサイト）5-10。
安心させる、彼らの多分化のHAECをもかかわらず、腫瘍を形成またはin vivoで腫瘍の発達を促進するためのいずれか表示されません。さらに、HAECを、クラスIIヒト白血球抗原（HLAは）8の低いレベルで発現する、特権免疫がある。このプロパティは、おそらく免疫適格サル、ウサギ、モルモット、ラット、およびブタ11-13を用いた研究において実証されるように、同種および異種移植後の免疫拒絶を回避する能力の基礎となる。 HAECを、強力な免疫調節および免疫抑制のプロパティを表示し、したがって、自己免疫疾患の治療における潜在的な臨床応用のための重要な実用的な利点を提供する。 HAECをは、先天性および適応免疫システムの両方に免疫調節機能を発揮すると考えられている。上のメカニズムのeは、免疫調節因子の14の分泌を介して行われ、提案した。
前臨床動物疾患モデルでHAECを、現在のアプリケーションは、脳卒中、多発性硬化症、肝疾患、糖尿病、慢性及び急性の肺疾患の治療が含まれる。研究者は、彼らの独特の特性に起因する脳卒中後の脳の炎症を処置するためにHAECをを使用することに関心を示している。 HAECを、彼らは、生着までの60日間生存、ニューロンへの分化、炎症を減少させ、神経疾患15の動物モデルにおいて、損傷した中枢神経系組織の再生を促進することができ、血液脳関門を通過することができるという証拠がある。
HAECを、多発性硬化症の発症および進行に寄与する複数の病理学的経路を標的とし、逆転する機能を提供します。例えば、前臨床動物試験からの結果は、HAECを強く免疫抑制性であることを示唆していると潜在的に末梢免疫寛容を誘導し、継続的な炎症反応を逆にすることができます。 HAECをまた、インビボで神経細胞に分化し、神経栄養因子16の広大な配列の分泌を介して内因性の神経再生を増強する能力を有することが示されている。
ヒト及びげっ歯類羊膜上皮細胞は、既に、動物モデルにおける肝疾患の治療のためのそれらの治療有効性を実証している。縮小肝細胞アポトーシスに伴う肝臓中の生存HAECを生着に肝疾患、HAEC移植リードの四塩化炭素による損傷誘発モデルにおいて、肝線維症、炎症および17を減少させた。
HAECを、インスリンとグルコーストランスポーターなどの表現膵臓の要因に刺激することができる。いくつかの研究は、糖尿病マウス18で血中グルコースレベルを復元するHAECをする可能性を検討した。投与したマウスでは、HAECをは、両方の動物の体重および血中グルコースレベルは、細胞の注射後に正常レベルに低下した。これらの研究は、糖尿病の治療のためのHAECを使用するための強力なケースを提示する。
HAECを、成人および新生児モデル19の両方で実験的な急性および慢性の肺損傷の防止と修復において実績のある役割を担っている。これらの研究は、HAECをが嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレータ（CFTR）、嚢胞性線維症を有する患者20に変異しているイオンチャネルを含む複数の肺癌関連タンパク質を発現する機能的な肺上皮細胞にin vitroで分化することがわかった。 HAECを負傷が成人および新生児の肺に送達された場合も、それらは、好中球、マクロファージおよびリンパ球21-23を含む肺白血球補充を、還元、宿主免疫細胞の調節を介して、それらの修復効果を発揮する。
彼らの豊富を考えると、安全記録、および複数の疾患のための実証済みの臨床応用、HAECをを使用した臨床試験は避けられない。臨床治験にHAEC療法の翻訳を加速させることを目標に、私たちは現在の適正製造基準（cGMPの）ガイドラインに従って動物製品の無試薬を用いて、臨床試験のための適当な方法で培養HAECをし、分離し凍結保存とする方法を開発。
私たちは、このプロトコルを私たちは動物由来の試薬6を使用してHAECをを分離することに成功し使用していた以前に公開されたプロトコルをベース。我々は、動物製品を含まない試薬で動物由来の製品を置き換えるために、元のプロトコルを変更し、その後の最適化は、細胞収量、生存率および純度を最適化するために行った。私たちの目標は、ヒト臨床試験用電池製造のための規制基準に準拠したいプロトコルを開発することであった。
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プロトコル
注：胎盤用語選択科目帝王切開の設定に合わせて、シングルトン健康妊娠から収集する必要があります。書かれ、インフォームドコンセントは、胎盤の収集のために与えられるべきである。あなたの関連する人間の研究倫理委員会の承認のヒト組織のすべての収集と利用をする必要があります。
羊膜上皮細胞の単離
- クラスII生物学的安全キャビネット内で無菌の表面に胎盤を置きます。
- 無菌ハンクスの平衡塩類溶液（HBSS）を用いて、胎盤の表面及び膜からできるだけ多くの血液を洗浄する。
- 臍帯を上にして置かれ、胎盤では、機械的に羊膜と絨毛膜の膜の外縁を分離する。
- 分離後は、手動で臍帯に向けて、膜のエッジの周りの作業、胎盤の絨毛膜膜から羊膜を取り除く。
注：carefこと羊膜から絨毛膜を汚染する任意の部分を削除するには、UL。 - 無菌のハサミを使用して、250ミリリットルHBSSを含有する容器を密封された500ミリリットル中に臍帯と場所のベースから約2cmの羊膜をカット。
- 羊膜膜を含む密閉ボトルを振ることにより徹底的に洗ってください。
- 滅菌ピンセットを使用して収集容器から羊膜膜を外し、15センチメートルペトリ皿に置く。
- 流血や破れの部分を破棄し、（ピンセットで垂直に保持時）約5cm、長片に羊膜をカット。
- 500ミリリットル内の場所は、コンテナを密封し、250ミリリットルHBSS約3〜5倍または羊膜膜が無汚染血液と半透明になるまで洗浄した。
注：任意に存在する血液の酵素消化溶液の効率を低下させることができる。 - に注意しながら、溶液を消化する酵素を50 mlを入れた容器に羊膜のすべての部分を転送するHBSSのキャリーオーバーを最小限に抑える。
- 残りの血液を除去するために穏やかに攪拌しながら15分間37℃の水浴または暖かい部屋でソリューションを消化酵素の中で羊膜断片をインキュベートする。
- 新しい滅菌容器内の溶液と場所を消化酵素のから羊膜片を除去します。
- 羊膜膜へのソリューションを消化し、水浴または穏やかに振盪（最初の消化）と暖かい部屋で60分間37℃でインキュベート新鮮な酵素の100ミリリットルを追加します。
- 羊膜膜片を取り出し、酵素による、膜の各部分から排水するソリューションを消化できるように、新しいコンテナ世話に入れる。
注：これは、容器の内側縁に沿って羊膜片をドラッグすることによって達成することができる。 - 羊膜膜片に対する解決策を消化し、穏やかに振盪（第二の消化）を用いて37℃の水浴または暖かい部屋で60分間インキュベートする新鮮な酵素の100ミリリットルを追加します。
- セルを渡しsuspensiステップ1.14から10分間千×gで70μmのフィルターと遠心分離機を経て上に。
- 削除し、上清を捨て、および1mg / mlの大豆ベースの酵素阻害剤を含む4ミリリットルHBSSで細胞ペレットを再懸濁します。穏やかに単一細胞懸濁液を得た1mlピペットで繰り返しピペット。
注：第消化物からの細胞は、同様の処理段階になるまで、この段階で、細胞を氷上に放置することができる。 - 羊膜膜片を取り出し、酵素による、膜の各部分から排水するソリューションを消化できるように、新しいコンテナ世話に入れる。
注：これは、容器の内側縁に沿って羊膜片をドラッグすることによって達成することができる。 - 10分間の千×gで70μmのフィルターと遠心分離機を通してステップ1.18から細胞懸濁液を渡します。
- 削除し、上清を捨て、および1mg / mlの大豆ベースの酵素阻害剤を含む4ミリリットルHBSSで細胞ペレットを再懸濁します。静かに1ミリリットルpで繰り返しピペット単一細胞懸濁液を得るipette。
- 2つのダイジェストまたは代わりのプール細胞は、細胞数の後まで分離した細胞ダイジェストを保つ。
注：これは高い生存細胞と、潜在的に低い生存性細胞の混合を防ぐことができます。 - 10〜20ミリリットルの最終容量にHBSSを追加し、生存能力を測定するためにトリパンブルーを用いて細胞数を行う。
- フローサイトメトリーによる上皮細胞表現型を確認してください。抗EpCAM-PEを用いて適切な抗体カクテルを作る（1：2希釈）抗CD90-PeCy5（1：250）および抗CD105-APC（1：100）HBSS中。
- 25×10 6細胞/ mlの濃度で一つまたは抗体カクテルの両方の消化物からの細胞のサブセットを再懸濁する。
- フローサイトメトリー、ステインアイソタイプコントロールを含む抗体カクテルと1×10 6細胞（例えば。のIgG 1アイソタイプコントロール-PE +抗CD90-PeCy5 +抗CD105-APC）。セットアップフローサイトメーター用の染色されていない〜1×10 6細胞を保管してください。
- 抗体で細胞をインキュベート60分間4℃でカクテルをお楽しみいただけます。
- 洗浄細胞は、フローサイトメトリーのために、1ml当たり5から10000000個の細胞でHBSS再懸濁で3倍。
- フローサイトメトリーとノート結果を実行します。細胞分離株（のEpCAM陽性およびCD90 / CD105陰性細胞の割合）の純度は、それぞれ90〜95％と<1％であることが期待される。
- 最終的なアプリケーションによって決定されるよう、適切な品質管理やリリース基準のテストのために取って細胞の適切な数を設定します。
注：これは、疾患/ウイルスのスクリーニング、または他の安全性又は生物学的基準を含むことができる。 - 残りの細胞では、低温保存プロトコールに従うか、あるいは（培養工程3.6への直接）文化に直接配置します。
HAECを2.凍結保存
- トリパンブルー排除を使用してデータまたは手動カウント、フローサイトメトリーを用いて細胞数および生存率を決定します。
- 5分間700×gで遠心分離する。
- 再懸濁細胞動物性製品の無凍結保存培地1ml当たり1から10000000細胞間の秒。
- O-環状凍結保存バイアルに細胞の適切な量をピペット冷却℃/分まで-80°C〜が達成され、およそ1を発生する装置を凍結し、制御された速度に入れる。
- 長期保存のために液体窒素中にバイアルを移す。
凍結保存HAECを3.解凍と文化
- 液体窒素から凍結保存バイアルを取り出し、氷上に置きます。
注：転送の場合のみ - 次のステップに急速に進んでください。 - 氷が残る唯一の小片（〜5mm角）になるまで37℃で急速に凍結バイアルを解凍する。
注：細胞溶液は、凍結保存培地中のDMSOの毒性効果を減少させるために加温しないことが重要である。 - 冷（1~4℃）で無血清培地に凍結保存培地を10倍に希釈し、適当な大きさに滴下D管やコンテナ。
- RTで5分間700×gで遠心分離する。
- 1mlあたり100万個の細胞のおよその濃度を、無血清培地中で再懸濁し、。トリパンブルー排除で自動化または手動の計数を用いて細胞数および生存率を決定します。予想される生存解凍後は、事前に凍結保存の生存率よりも5〜10％減となります。
- 代わりにプレート標準的な細胞培養処理プラスチックウェア上の細胞、または、私はコート培養表面に型コラーゲンを使用しています。
- I型コラーゲンコーティングについては、以下のプロトコルに従う
- ヒト胎盤（25ミリリットル脱イオン水と50μlの氷酢酸と15 mgのコラーゲン）から酸可溶性I型コラーゲンを準備します。
- パラフィルムでビーカーを覆い、コラーゲン鎖が溶解するまで37℃で適度に撹拌した。
- 0.22μmのフィルターを用いて無菌濾過コラーゲン溶液。
- 脱イオン水でろ過したコラーゲン株式1:10に希釈する。この希釈された株式は、作業conceですプラスチックと膜表面をコーティングするためのntrationソリューション。
- 2〜8℃、37℃、またはO / NでのコラーゲンRTで2時間コートプラスチック、ガラス、膜の表面を。
- コーティングされた表面から余分な流体を除去し、それがO / Nを乾燥させます。
- 細胞および培地を導入する前に無菌の組織培養グレードの水またはHBSSで洗い流してください。
- プレート無血清培地中で25000細胞/ cm 2の密度でHAECを、そして、添付ファイルが72〜96時間起こさせる。
- 添付ファイルの後、慎重に吸引し、無血清培地の適切な音量2〜3日ごとに交換することによってメディアを変更。
- 以下のプロトコルを使用して継代細胞
- 吸引し、細胞培養培地および滅菌HBSSの1倍容量で洗浄
- 細胞は、細胞培養表面から離脱観察されるまで、酵素の1倍体積を加える溶液を消化し、5〜15分間インキュベートし、または。
- CEのを確実にする、細胞を含む酵素消化液の収集LLSを繰り返し、細胞培養表面に対する酵素消化物溶液をピペッティングすることにより細胞培養表面から剥がれた
- 5分間700×gで遠心分離する。
- 1mg / mlの大豆ベースの酵素阻害剤を含有するHBSSの適切な体積で細胞ペレットを再懸濁する。穏やかに単一細胞懸濁液を得るために、1ミリリットルピペットで繰り返しピペット。
- 100万個の細胞/ mlのおおよその濃度になるように無血清培地を加える。トリパンブルー排除で自動化または手動の計数を用いて細胞数および生存率を決定します。
- プレート無血清培地中で25000細胞/ cm 2の密度でHAECを、そして、標準的な培養方法を続行。
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結果
この手順が正しく実行されると、1.2億HAECを、平均収量は80から160000000セルの典型的な範囲で、期待されるべき。これらの収率で、83±4％の平均生存率が期待できる。臨床的方法で増加し、平均収率およびわずかに低い生存率に起因血清タンパク質の欠如のために、おそらく、動物由来の製品よりも高いトリプシン活性に起因する、とすることができる。単離されたHAECをは<1％CD90、CD105間葉マーカー陽性細胞と92％のEpCAM陽性細胞の平均細胞表面プロファイルを有する。これらのマーカーは、それぞれ、上皮24,25および間葉26系統のために、それらの特異性に選択した。このプロセスは、（ 図1）を完了するのに約4~5時間を取ることができる。
凍結保存は、バイアルと最終細胞収量の数に応じて20〜60分を必要とします。我々は以前凍結保存培地の範囲をテストし、発見した多くの動物製品を含まない培地は、適切に実行することは、しかし、最適なDMSO濃度は約5~10％である。通常、1は、生存能力の解凍後は、プレ凍結...
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ディスカッション
この方法の成功に重要な影響を与えることができるいくつかの重要なパラメータがある。 HAECを単離する前に、最大3時間胎盤または羊膜の貯蔵はロジスティックまたはスケジューリングの目的のために望ましいことがある、しかしそれは、組織ができるだけ早く処理されることをお勧めします。組織を保存する場合は、ストレージが羊膜膜の解剖と洗浄後に実施することをお勧めします。羊膜は、4℃で抗生物質を含有する滅菌HBSSに格納することができるが、細胞生存率が延長貯蔵時間と共に減少することができる。我々は、その他の細胞収率および生存率の変動を発見し、それは、好ましくは、帝王切開により送達健康用語出生から収集される胎盤を推奨され、この可変性を最小限にする。
我々は、血液細胞と羊膜膜の汚染は、酵素活性の阻害および細胞収率の低下をもたらすことを見出した。従ってプロトコルにおける重要なステップは、胎盤と羊膜膜の徹底的な洗浄が推奨されている。それが下流の酵素阻害を回避するために、明確な/白表示されるまで、羊膜組織を洗浄することをお勧めします。上皮細胞の比較的均質な集団の単離は、特徴付けおよび品質管理試験のために重要で...
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
著者は、ビクトリア州政府の運用インフラストラクチャ支援プログラムからの財政的支援を認めています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| コレクションキット | |||
| ストリッピングトレイ | フィッシャーサイエンティフィック | 13-361B | |
| リバティドレッシング鉗子、ポインテッド 13 cm | フィッシャーサイエンティフィック | S17329 | |
| はさみ - シャープ/ブラントストレート | フィッシャーサイエンティフィック | NC0562592 | |
| 滅菌ラテックス手袋 | フィッシャーサイエンティフィック | 19-014-643 | |
| 保護服 | |||
| 保護服(ガウン) | Uライン | S-15374-M | |
| アイソレーションガウン | Uライン | S-15374-M | |
| 滅菌ラテックス手袋 | フィッシャーサイエンティフィック | 19-014-643 | |
| 汎用フェイスマスク | カーディナルヘルス | AT7511 | |
| ボンネット | メドライン | CRI1001 | |
| シュー カバー | Uライン | S-7873W | |
| メディアおよび試薬 | |||
| ハンクスバランス塩溶液(HBSS) | Life Technologies | 14175095 | カルシウムまたはマグネシウムを含まない |
| TrypZean (動物製品–遊離組換えトリプシン) | シグマAldrich | T3449 | |
| 大豆トリプシン阻害剤 1g / 50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLifeソリューション | 205102 | |
| トリパンブルー試薬 | ライフテクノロジー | ズ15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PEアイソタイプ制御 | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| 抗CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotypeコントロール | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APCアイソタイプコントロール | BD Pharmingen | 340754 | |
| 型 | Sigma Aldrich | C7521 | |
| 消耗品 | |||
| 50ml目盛り付きピペット | BD/Falcon | 356550 | |
| 10ml目盛り付きピペット | BD/Falcon | 356551 | |
| 5ml目盛り付きピペット | BD/Falcon | 356543 | |
| 50mlファルコンチューブ | BD/Falcon | 352070 | |
| 15mlファルコンチューブ | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cmシャー | コーニング | 351058 | |
| 70 μm | フィルターBD /ファルコン | 352350 | |
| 0.22 μm フィルター | ミリポア | SLGV033RS | |
| 1 ml ピペットチップ | フィッシャーブランド | 02-707-401 | |
| 200 μl ピペットチップ | フィッシャーブランド | 02-707-409 | |
| 20 ml シリンジ | BD/メディカル | 309661 | |
| プラスチックヘラ | フィッシャー・サイエンティフィック | 14-245-97 | |
| プラスチック計量ボート | フィッシャー・サイエンティフィック | 02-202-102 | |
| クライオバイアルNunc | 377267 | ||
| 機器 | |||
| 氏フロスティ | フィッシャーサイエンティフィック | A451-4 | |
| バイオハザードキャビネット |
参考文献
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