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方法論記事

Immunotargeted磁気プラズモニックナノクラスターの合成

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DOI:

10.3791/52090

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2014年8月22日

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin, 2Department of Imaging Physics, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center

この記事について

サマリー

ここでは、強力な磁気モーメントと強い近赤外（NIR）吸光度磁気プラズモニックナノ粒子の合成のためのプロトコルを記述します。このプロトコルはまた、分子特異的な標的化を必要とするさまざまな生物医学アプリケーションのためのFc部分を介してナノ粒子への抗体結合が含まれています。

要約

単一ナノ粒子に複合磁気とプラズモニック特性は、コントラスト小説磁力の画像診断法の向上、同時キャプチャと（のCTC）循環腫瘍細胞の検出、および光熱療法と併用マルチモーダル分子イメージングなど、生物医学アプリケーションの数で有利である相乗効果を提供癌細胞の。これらのアプリケーションは、近赤外（NIR）領域での光吸収率と強い磁気モーメントを持つ磁気プラズモニックナノ粒子の合成のためのプロトコルの開発に大きな関心を刺激してきた。ここでは、水中油型マイクロエマルション法に基づいているようなハイブリッドナノ粒子の合成のための新規なプロトコルを提示する。ここに記載されたプロトコルのユニークな特徴は、磁気プラズモニック特性があり、一次ブロックからさまざまなサイズの磁気プラズモニックナノ粒子の合成である。このアプローチは、高いデンを有するナノ粒子が得られ均一にナノ粒子の体積全体に分散されている磁気およびプラズモニック機能のsity。ハイブリッドナノ粒子は、容易に標的とするための利用可能な抗原結合を担うFab部分を残して、Fc部分を介して抗体を結合することによって官能化することができる。

概要

個別の物理化学的特性を有する異なる材料からなるハイブリッドナノ粒子は、マルチモーダル分子イメージング、治療送達およびモニタリング、新たなスクリーニングおよび診断アッセイ1-3を含む生物医学的応用に新たな機会を開くことができます。それはプラズモン共鳴磁場に対する応答に関連付けられた非常に強い光散乱および吸収断面積を提供するので、単一ナノ粒子における表面プラズモンと磁気特性との組み合わせは、特に興味深い。例えば、磁気プラズモニックナノ粒子は、外部電磁石3-5を経由して時間信号の変調を適用することにより、標識された細胞の暗視野イメージングでのコントラストを高めるために使用した。磁気光音響イメージング、磁気プラズモニックナノ粒子は、コントラストと信号対バックグラウンドラットに大きな改善を可能にする - 最近では、同様の原理は、新しいイメージングモダリティの開発に適用されたioは6,7。また、ハイブリッドナノ粒子は、全血およびインビボ 8,9 中の循環腫瘍細胞の同時捕捉および検出のために使用できることが示された。さらに、磁気プラズモニックナノ粒子は、癌細胞10の光熱療法と組み合わせた分子の特定の光学的及びMRイメージングのために使用することができるセラノスティック剤が有望である。

いくつかのアプローチが磁気プラズモニックナノ粒子の合成のために調査した。例えば、Yu らダンベル状の二官能性のAuのFe 3 O 4ナノ粒子11を形成するために、金ナノ粒子上のFe（CO）5の分解や酸化を利用した。 Wang らは、熱分解法12を用いて、金被覆酸化鉄ナノ粒子を合成した。いくつかの他のアプローチは、Agを堆積する磁気コアナノ粒子​​上にコーティングポリマーまたはアミン機能性分子に依存しているハイブリッド粒子7,13を作成するために、ポリマー表面上に古いシェル。また、酸化鉄ナノ粒子は、静電的相互作用または化学反応14,15を介して金ナノロッドに結合させた。これらのアプローチは、磁気プラズモニックナノ構造をもたらすが、それらはそのような生物医学的用途において非常に望ましい両方とも、近赤外（NIR）ウィンドウ内の光吸収や強い磁気モーメントとして磁気プラズモニック組み合わせのある程度特性に妥協。例えば、ダンベルのAuのFe 3 O 4ナノ粒子に起因このスペクトル範囲において高い組織濁度インビボにおけるそれらの有用性を制限する520nmでのプラズモン共鳴ピークを有する。さらに、現在のプロトコルによって生成される磁気プラズモニックナノ粒子は、ACHかもしれないよりもはるかに少ないつだけ11または数（10未満）14,15超常磁性部分（ 例えば 、酸化鉄ナノ粒子）に制限されています高密度に充填されたナノ構造にieved。例えば、高密度に充填された直径60nmの球状ナノ粒子は、千6 nmの超常磁性ナノ粒子のオーダーに含めることができます。そのため、ハイブリッドナノ粒子の磁気特性を向上させるための大きな余地がある。また、前述のプロトコルのいくつかは、比較的複雑であり、合成14,15の間に粒子の凝集を回避するために慎重な最適化を必要とする。

ここでは、強力な磁気モーメントと現在の技術の主要な制限に対処する強力な近赤外吸光度磁気プラズモニックナノ粒子の合成のためのプロトコルを記述します。合成は、水中油型マイクロエマルション法16においてその起源を持っています。それは、はるかに小さい一次粒子​​から所望の大きさのナノ粒子のアセンブリに基づいています。このアプローチは成功し、金、酸化鉄、及び半導体PRIのような単一の材料からナノ構造を生成するために使用されているメアリーは16粒子 。私たちは、最終的な球状のナノ構造体への一次ハイブリッド粒子を組み立て、その後、6 nmの直径の金のシェル/酸化鉄コア粒子を製造し、第による磁気プラズモニックナノ粒子の合成に拡張する。ナノクラスターに一次粒子の組み立ては、このような超常磁性の特性を維持しながら、より強力な磁気モーメントを達成する等の構成ナノ粒子の特性を高めることができますが、またこうしてこのような強力等の構成のナノ粒子、欠席新しい特性を作成し、個別のナノ粒子間の相互作用を利用しているだけでなく、 NIRウィンドウ内の光吸収。このプロトコルは、磁気およびプラズモニック機能の高密度ハイブリッドナノ粒子が得られます。一次粒子が合成された後、本手法は、基本的に単純なワンポット反応である。全体的なプラズモン共鳴強度および磁気モーメントが一次粒子と、THERの数によって決定されるお使いになる前に、容易にアプリケーションに応じて最適化することができる。さらに、私たちはまた、分子特異的な標的化を必要とするさまざまな生物医学的用途のためのハイブリッドナノ粒子に抗体結合のための手順を開発しました。抗体は、抗原が標的化するための利用可能な結合を担うFab部分を残して、Fc部分を介して結合されている。

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プロトコル

1計装ガラス製品の準備

  1. すなわち 、実験着と使い捨て手袋、目の保護を適切な保護具を着用してください。
  2. 凝縮器に丸底フラスコを接続し、温度計による温度監視とシリコーン油浴でそれを浸す。オイルバス（ 図1）の下での熱の供給源（ 例えば、ホットプレート）を配置します。 260℃以上の温度を測定できる温度計を使用してください。

初代ハイブリッド磁気プラズモニックナノ粒子の合成2。

  1. 磁性芯ナノ粒子を作る
    1. ラウンド353.2（1ミリモル）の鉄（III）アセチルアセトネート、1ミリリットル（2ミリモル）のオレイン酸を1ml（2ミリモル）オレイルアミン、1.292グラム（5mmol）の1,2 - ヘキサデカン、および10mlのフェニルエーテルを追加-bottomフラスコ。
    2. 還流下で1時間250〜260℃に磁気攪拌棒および熱を用いて混合物を激しく撹拌する。その後、冷却するために解決策を待つRTまで。温度がフェニルエーテルの沸騰を防止し、凝縮器の丸底フラスコから反応混合物の爆発を防止するために、260℃以下であることを確認してください。
      注意：反応混合物は、非常に高温であり、化学物質が、炎症を引き起こす場合がある。ヒュームフードの下で動作し、適切な個人用保護具を着用しなければならない。油浴のための十分な換気を確保してください。
      NOTE：油浴磁性ナノ粒子の合成中、1時間250〜260ºC温度に維持される。原理的には、パイレックスガラス皿は、この目的のために使用することができる。しかし、パイレックスガラスの最大連続温度はベンダーの情報に従ってºC〜260である。そのため、金属容器は、それがより高い温度に耐え、複数の実行中に長く続くことができるように、反応のためのより安全なオプションを提供します。
  2. 磁気コアナノ粒子​​上に金のシェルを堆積
    1. 411.5ミリグラム（1.1ミリモル）の金のACEを追加テート0.25ミリリットル（0.75ミリモル）のオレイン酸を1.5ml（3.0ミリモル）オレイルアミン、丸底フラスコに775.3ミリグラム（3mmol）の1,2 - ヘキサデカン、そして15mlのフェニルエーテル。
    2. ステップ2.1から磁性ナノ粒子を5mlの懸濁液を追加します。 180°Cまで反応混合物を加熱し、1時間加熱還流続ける。 RTに冷却するソリューションを待ちます。
    3. 15分間3,250×gで遠心分離したハイブリッドの一次ナノ粒子を析出させ50ミリリットルのエタノールを加える。
    4. 風呂ソニケーターを使用して25ミリリットルのヘキサン中の沈殿物を再懸濁します。プライマリーハイブリッドナノ粒子を析出させ25ミリリットルのエタノールを加える。 15分間3,250×gで遠心分離し、ヘキサンで沈殿物を懸濁します。この手順を3回繰り返します。
    5. 真空デシケーター、O / Nが析出した主なハイブリッドナノ粒子を乾燥させます。粒子が完全に乾燥していることを確認します。

3ハイブリッド磁気プラズモニックナノクラスターの合成とサイズ分離

  1. 入浴ソニケーターを使用して、1ミリリットルのヘキサン中の乾燥原発ハイブリッドナノ粒子を再懸濁5mgの。目に見える沈殿物が存在しなくなるまで、ナノ粒子懸濁液を超音波処理する。
  2. 添付のキャップ付き20mlのガラスバイアル中に3.1〜10ミリリットルのステップからのドデシル硫酸ナトリウム（2.8 mg / mlで）の水溶液を溶液を加える。次のステップの前に二つの相の混合を避けるために、ドロップすることによって、プライマリハイブリッドナノドロップの懸濁液を追加します。
  3. 10分間80℃の水浴中で加熱し2時間、浴超音波処理器内の二相溶液を、超音波処理する。 RTに冷却するソリューションを待ちます。
    1. 超音波処理浴の動作レベルラインまで水を入れます。超音波処理浴中にガラスバイアルをセンタリング。直ちに二相間のエマルジョンが形成される。超音波処理の開始後、手で2相溶液を振る。これは、プライマリハイブリッドナノ粒子を含む相と下部の水相間の混合が容易になります。
      注：THAに注意してくださいソニケータートン作業の2時間後に発熱します。
  4. 遠心分離し、30分間100×gでハイブリッドナノクラスターサスペンション。沈殿物と上澄みの両方を収集します。 10分間の超音波処理下で0.1 mMクエン酸ナトリウムでの沈殿物を再懸濁する。ナノクラスターの予想されるサイズは直径〜180nmである。
  5. 新しいコニカルチューブにステップ3.3から上清を移し。
  6. 30分間400×gでステップ3.4からサスペンションを遠心。沈殿物と上澄みの両方を収集します。 10分間の超音波処理下で0.1 mMクエン酸ナトリウムでの沈殿物を再懸濁する。ナノクラスターの予想されるサイズは直径〜130nmである。
  7. 新しいコニカルチューブにステップ3.5から上清を移し。
  8. 30分間1500×gでステップ3.6からサスペンションを遠心。 10分間の超音波処理下で0.1 mMクエン酸ナトリウムでの沈殿物を再懸濁を収集します。ナノクラスターの予想されるサイズは直径〜90nmである。
  9. 300の追加_6、UV-可視-NIR吸収スペクトルを測定するための96ウェルマイクロプレートリーダーへリットルナノクラスターの懸濁液。 TEM画像化のための炭素被覆銅グリッド上に10μlのナノクラスターサスペンションをドロップします。

ナノクラスターへのモノクローナル抗体の4抱合

  1. PBS、pH7.2中100μlのモノクローナル抗体液（1 mg / mlで）を調製し、 例えば 、抗上皮成長因子受容体2（HER2）抗体または抗上皮成長因子受容体1（EGFR）抗体。
  2. 3.9 mlの4のHEPES、pH7.2にステップ4.1からの抗体溶液を加える。遠心し、8℃で20分間3,250×gで10 K MWCO遠心フィルターを通して溶液。 100μlの最終容積に、4のHEPES、pH7.2中の抗体を懸濁します。
    注：このステップはHEPESで抗体溶液に元のメディアを交換するために行われる。
  3. 抗体溶液100μlに100 mMののNaIO 4を10μlを追加します。アルとの反応バイアルをカバーRTでuminum箔とオービタルシェーカーを用いて30分間混ぜる。
  4. 1×500μlのPBSを加えることによって反応をクエンチ。
  5. ステップ4.4から抗体溶液に46.5 mMのリンカー溶液2μl（dithiolaromatic PEG6-CONHNH 2）を追加し、室温で1時間振とうする。
  6. 8℃で20分間3,250×gで10 K MWCO遠心フィルターを用いて溶液をフィルタリングします。 〜1 mg / mlの抗体濃度をもたらす100μlの最終容積に1×PBS中の抗体を再懸濁する。
  7. RTで120分間のステップ4.6（1 mg / ml）での抗体を改変された1μlのOD〜1.0で100μlのナノクラスターの懸濁液を混ぜる。
  8. 10 -3 M 5 kDaのチオールPEGの10μLを加え、室温で15分間振とうする。
  9. 3分間830×gでソリューションを遠心。上澄みを捨て、100μlの2％PBS、pH7.2の中で重量/体積5kDaのPEGで沈殿物を懸濁します。
  10. 抗体結合ナノクラスターの吸光度スペクトルを測定し、tに比較彼は裸のナノクラスターのスペクトルを吸光度です。抱合後にナノメートルの赤色偏移のカップルを期待しています。
  11. 赤NIR領域におけるODの増加に伴って大きな変化によって示されるように、ナノ粒子が凝集した場合、5×10 -3 Mに、チオールPEGの濃度を増加させるまた、30分にチオールPEGとのインキュベーション時間を増大させ、200×gの単位での遠心速度を低下させる。
  12. 癌細胞ラベリング試験のために、いずれかの培地または1×PBS中の癌細胞懸濁液（1ミリリットル〜10 6細胞）を、ステップ4.9からの抗体コンジュゲートナノ粒子を追加し、60分間混合する。

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結果

immunotargeted磁気プラズモニックナノクラスターの合成のためのスキームを図2に示す。まず、磁性のFe 3 O 4の酸化鉄ナノ粒子は、熱分解法によって合成されている。その後、薄い約 1 nm金シェルは、熱分解によって酸化鉄コア粒子上に堆積される。プライマリ約 6nmのハイブリッドナノ粒子は、水中油型マイクロエマルション法を利用して磁気プラズモニックナノクラスターを作成するためのシードとしての役割を果たす。ナノクラスターは、分子特異的標的化のためのモノクローナル抗体を用いて官能化される。

合成された鉄酸化物コア粒子の大きさは、直径が〜5nmである。磁気コア上に金のシェル蒸着の後、一次酸化鉄コア/金のシェルナノ粒子のサイズは直径〜6nm程度まで増加する。金のシェルとを堆積した後に赤紫色の酸化鉄ナノ粒子の褐色のコロイド色の変化、最終的には、〜180 nmの直径の球状ナノクラスター（ 図3）への一次粒子の組み立て後の紫色の灰色に。 ...

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ディスカッション

磁気プラズモニックナノクラスターの合成に成功における重要なステップは、高度に単分散し、一次ゴールドシェル/鉄酸化物コア粒子を作製し、ナノクラスターに一次粒子の自己組織化を指示することを含む。一次粒子と界面活性剤とのモル比は、ナノクラスターのサイズ分布を決定する際に重要な役割を果たしている。一次粒子の不均一なサイズ分布は、磁気プラズモニックナノクラスターの組み立て中に大きな凝集体の形成を引き起こすことがある。加えて、ナノクラスター形成のマイクロエマルジョン法は、両親媒性界面活性剤に依存して、疎水性尾部基は一緒になって、一次ナノ粒子を保持し、親水性の頭部基は、水溶液中でナノクラスターを安定化させる。界面活性剤の濃度は、ナノクラスターのアセンブリを決定する：高濃度は、より小さなナノクラスターまたは個別の一次粒子の形成につながると低濃度は、粒子の凝集をもたらすであろう。

ナノクラスターは、追加の分離工程を必要と300nmとを約する約 50nmのより広いサイズ分布を有するように合成された。次第に増加速度と遠心分離は上記のプロトコルに記...

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開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

謝辞

この作品は、NIHの助成金R01 EB008101とR01 CA103830によって部分的にサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
PYREX 50 ml 丸底沸騰フラスコ、ショートネック & 24/40 [ST] ジョイントコーニング4320A-50熱分解反応
PYREX 41 x 300 mm 5 電球 Allihn コンデンサー、24/40 [ST] アウター/インナージョイントコーニング2480-300熱分解反応
シリコーンオイルフィッシャーS159-500オイルバス
ホットプレートスターラーコーニングPC-351攪拌機能付き反応子の加熱
温度計ThermoWorks221-092温度測定
アセチルアセトン酸鉄(III) フィッシャーAC11913-0250一次ハイブリッドナノ粒子合成材料
オレイン酸 99%フィッシャーA195-500一次ハイブリッドナノ粒子合成材料
金(III) アセテートフィッシャーAA3974206一次ハイブリッドナノ粒子合成用材料
ヘキサンフィッシャーH292-1一次ハイブリッドナノ粒子合成用材料
フェニルエーテル99%フィッシャーAC13060-0025一次ハイブリッドナノ粒子合成用材料
1,2-ヘキサデカンジオール90%シグマ213748-50G一次ハイブリッドナノ粒子合成
用材料オレイラミン70%シグマO7805-100G一次ハイブリッドナノ粒子合成用材料
ドデシル硫酸ナトリウムフィッシャーBP166-100クラスター合成
クエン酸ナトリウム二水和物シグマW302600クラスター合成
モノクローナル抗EGF受容体抗体シグマE2156細胞標識特異性試験
モノクローナル抗HER2抗体SigmaAMAB90627細胞標識特異性試験
過ヨウ素酸ナトリウムSigma311448抗体の酸化 Fc 領域
ジチオール芳香族 PEG6-CONHNH2SensoPath TechnologiesSPT-0014Bナノクラスターへの抗体結合のためのヘテロファンクショナルリンカー
メトキシ-PEG-チオール、5 kCreative PEGworksPLS-604抗体標識後の残りの金表面を不動態化します
Amicon Ultra-4 遠心フィルターユニット Ultracel-10 メンブレンミリポアUFC801008タンパク質精製
HEPESSigmaH3375バッファー
PBS, 1x 溶液フィッシャーBP2438-20
バッファー UV-Vis 分光法BioTek シナジーHTスペクトルを取得
遠心分離機エッペンドルフ5810R分離
透過型電子顕微鏡FEITECNAI G2 F20 X-TWINナノ構造の形態を取得
正立顕微鏡ライカDM6000暗視野画像を取得
ソニケーターブランソン1510超音波処理
カーボンフィルム 300メッシュグリッドEMSCF300-CuTEM イメージング
96 ウェルプレートCorning09-761-145UV-Vis reading plate

参考文献

  1. Bigall, N. C., Parak, W. J., Dorfs, D. Fluorescent, magnetic and plasmonic—Hybrid multifunctional colloidal nano objects. Nano Today. 7, 282-296 (2012).
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  16. Bai, F., et al. A Versatile Bottom‐up Assembly Approach to Colloidal Spheres from Nanocrystals. Angewandte Chemie International Edition. 46, 6650-6653 (2007).

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