方法論記事

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

DOI：

10.3791/52095

⸱

2014年11月18日

 , 
1Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder, 2Linda Crnic Institute for Down Syndrome, University of Colorado, Denver

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNA(miRNA)は、広く保存された調節分子のクラスです。ここでは、2つの強力なライゲーションステップとそれに続くハイスループットシーケンシングに依存するmiRNAクローニング法について説明します。私たちの方法は、miRNAの正確なゲノムワイド定量を可能にします。

要約

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のmiRNAのクローニングおよびハイスループットシークエンシング、のmiR-配列と呼ばれるが、一塩基分解能でmiRNAを定量化するためにトランスクリプトーム全体のアプローチとして単独で立っている。この技術は、miRNA分子の3 'および5'オリゴヌクレオチドアダプターを取り付けることによりmiRNAを捕捉し、 デノボ miRNAの検出を可能にする。強力な次世代シーケンシング·プラットフォームとのカップリング、のmiR-配列は、miRNA生物学の研究に尽力してきました。しかし、オリゴヌクレオチドライゲーション手順によって導入の重要なバイアスが正確な定量ツールとして採用されてからは、miR-配列を妨げてきた。これまでの研究では、現在のmiR-のSeq法におけるバイアスはしばしばいくつかのmiRNA 1,2- 1,000倍までのエラーで不正確なmiRNA定量化につながることを実証している。 RNAライゲーションによって与えられるこれらのバイアスを解決するために、我々は両方の3 'および5'ライゲーションステップのため95％以上のライゲーション効率が得られる低分子RNAライゲーション法を開発した。このIMのベンチマーク一貫して期待値から2倍未満偏差の数値を読み取って得られ、等モルまたは差動で混合合成miRNAを使用してライブラリー構築法を証明した。さらに、この高効率のmiR-配列法は、 インビボでの総RNA試料2からの正確なゲノムワイドなmiRNAプロファイリングを可能にする。

概要

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ハイスループットシークエンシングに基づく方法は、広く大きく、生物系3,4の分子の複雑さの理解を拡大近年、多くの生物学的サンプルに適用されている。しかし、ハイスループット配列決定のためのRNA試料の調製は、多くの場合、これらの強力な技術の潜在的な有用性を制限し、採用手法に固有の固有のバイアスを与える。これらの方法は、特定のバイアスは十分にライゲーションベースの、小RNAライブラリ調製物を1,2,5,6-ために文書化されている。これらのバイアスはがち乱暴変数と誤差シーケンシングデータからのmiRNAの存在量の推定を行う、等モル合成miRNAの番号を読み込み中1000倍のばらつきが生じる。

ファージ由来のT4 RNAリガーゼの特性に焦点を当てた研究では、酵素は、ハイスループットシークエンシング実験においてバイアスされたライブラリとして現れるヌクレオチドベースのプリファレンス7を示すことを報告しているまで。 RNAリガーゼによって与えられるバイアスを最小にするために、多数の戦略が採用されてきた。高分子、9混雑ライゲーション部位6の近位にあるアダプタのヌクレオチド配列をランダム化し、ライゲーションアダプタ2の高濃度を用いる。これら三つのアプローチの組み合わせを通して、私たちは、ハイスループットシークエンシング（ 図1）のための互換性の低分子RNA図書館に関する調製するためのワークフローを開発しました。現在のプロトコルと私たちの最適化された方法との間の直接の比較のために、私たちの最近の報告書2を参照してください。この最適化された方法は、両方の3 'および5'のステップで95％より高いライゲーション効率が得られ、合成および生物学的試料2からの小RNA分子の公正な連結を可能にする。

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プロトコル

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注：それは全体の手順の際にRNaseフリーの条件を維持するために重要である。

3 'リンカーの1アデニル化

  1. ヌクレアーゼフリーのH 2 O中に100μMまでの3 'ライゲーション反応のために設計されたDNAオリゴヌクレオチドを希釈
    注：オリゴヌクレオチドは、5 'リン酸基、5位の​​無作為化ジヌクレオチド'末端および3 'デオキシシトシンを持つ必要があります。 5アデニル10 'リン酸基は、効率的な5 M番目の酵素の要件である」。リン酸塩は、ポリヌクレオチドキナーゼを有するオリゴヌクレオチドの前処理によって追加された、または直接変更して注文することができる。 5 '末端にランダム化されたヌクレオチドは、特定の最終端が他の6を介して反応を接合するためのRNAリガーゼは、展示順序設定を最小にするために重要である。 3オリゴtの '末端ジデオキシシトシン3にブロッキング要素を配置'Oその後の連結工程の間のリンカー-リンカーコンカテマーの形成を阻害し、ライゲーション反応を11 3 'の端部に形成されたmiRNAのリンカー分子の末端を「ブロックする働きをする。次のように公平なのmiR-配列方法のために選択されたオリゴヌクレオチドリンカー配列は、次のとおりです。5'PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3」。
  2. 200 pmolの3 'リンカーオリゴヌクレオチド、4μlの10倍の5'のDNAアデニル化バッファー、4μlの1mMのATP、4μlのM番目の RNAリガーゼ、ヌクレアーゼフリーのH 2 O を 40μlの最終体積に次のアデニル化反応を組み立てます。
  3. 1時間65℃で反応をインキュベートする。 5分間85℃に加熱して反応を停止。
  4. 残留ATPを除去し、将来の反応において予期せぬライゲーションを防ぐために、100％エタノールおよび10 M酢酸アンモニウム1/3容積の2.5倍量を添加することによってアデニル化リンカーを沈殿させる。
    1. 簡単に言えば、アルを混ぜるcohol、塩、および20分間、4℃で微量フルスピードで回転して均一にオリゴ溶液（〜15000×gで）。アデニル化オリゴの50〜100μMを得るためにヌクレアーゼフリーのH 2 O を適切な容量の70％エタノール、空気乾燥、および再懸濁でペレットを洗浄。
  5. 18％ポリアクリルアミドゲルを実行することにより、アデニル化を確認します。
    1. 6.3グラムの尿素、40％のアクリルアミドの6.75ミリリットル、および10倍TBEの1.5ミリリットル：一緒に以下を混合することによりゲルを準備します。 H 2 O 15ミリリットルを追加します。
    2. 尿素が完全に溶解するまで混合し、過硫酸アンモニウム（APS）および15μlのtetramethlyethylenediamine（TEMED）（w / v）の150μlの10％を加える。
    3. ゲルを1×TBEを室温でランニング緩衝液でゲル幅の24 V / cm 2で30分間、予備泳動を設定した後。ランニング緩衝液で30分間が起動したらフラッシュ井戸。
    4. とアデニル化オリゴヌクレオチドおよびRNAローディングバッファー（95％（v / v）のホルムアミドを、変性2倍の等容積の5ピコモルを混ぜる0.02％SDS、0.02％ブロモフェノールブルー（w / vの）、0.01％（w / vの）（w / v）のキシレンシアノール、1.0mMのEDTA）、熱簡単に75℃、そして氷上で冷却した凍結した。ゲルのウェルにサンプル全体を分注する。また、非アデニル化制御の同一の量、及び低分子量サイズ標準を含む。
    5. ブロモフェノールブルーがゲルの底部への道の3/4になるまで、24 V / cmのでゲルを実行します。 1×TBE中の1x SYBR-金溶液と装置、ポストステインゲルを分解し、UV-イルミボックス（ 図2）上で可視化する。
      注： "は入力RNA」コントロールは、入力RNAのサンプルと比較して、PCR産物を多量に得られていない場合、ゲルは、上記と同様にアデニル化オリゴを精製する。

2.リンカライゲーションmiRNAの3 '末端に

  1. 3 'ライゲーション
    1. （w / v）のPEG 8000、0.5＆1.0μlの50％：リストの順に氷上で次のコンポーネントを組み立てる＃956; lの10倍のRNAリガーゼ緩衝液（500mMのトリス-HCl pH7.5で、100mMのMgCl 2を 、10mMのDTT）、1.0μlを、3 'リンカー（100μM）、0.5μlのRNアーゼ阻害剤、0.5〜8.0μgのトータルRNAをアデニル化0.5μlのT4 RNAリガーゼ2、5μlの最終体積にヌクレアーゼフリーのH 2 Oを。
    2. 解決策が原因で一度完全に混合し、PEG 8000の高濃度の渦に粘性が高すぎるようにピペッティングすることによって反応を混ぜ、加熱蓋付きサーマルサイクラーで反応を置く。 16℃にブロックを設定し、4時間インキュベートする。
      注：反応は、ライゲーション効率の損失なしに20μlの最終容量にスケールアップすることができる。本質的に同一のライゲーション効率を得るために、周囲温度でまたは一晩、4℃で4時間反応させる。
  2. ゲル精製
    1. 3 '連結後、2×RNAローディングバッファーを等量の反応混合する。 5分間70℃に加熱し、氷上でクールなスナップ。
    2. PAGE精製のために15％ポリアクリルアミドゲル上でサンプルを実行する。
      1. ステップ1.5で前に説明したのと同様の方法で、7 M尿素を含む15％ポリアクリルアミドゲルを調製。
      2. 少なくとも30分間ゲル幅の24 V / cmのでゲルを事前に実行します。電源、フラッシュ井戸、負荷サンプルをオフにして、実行前と同じ電圧でゲルを実行します。
      3. ブロモフェノールブルーがちょうどゲルを出るまで、サンプルをロードして、ページを実行します。所望の生成物をキシレンシアの近くに移行されます。
  3. 染色、可視化、および切除
    1. 15分間の1xランニングバッファー（TBE）、1X SYBR-金、岩クリーントレイにゲル装置と場所ゲルを分解します。
    2. 染色皿からゲルを取り出し、清潔なラップで覆われたUVトランスイルミボックスを視覚化する。ライゲーション産物は、長さが約45ヌクレオチドであるべきである。
    3. きれいなrazoでライゲーション産物を含む領域を切り出し0.5ミリリットルのマイクロ遠心管におけるrブレードと場所。
  4. 生成物の単離と降水
    1. ピアス30Gの針を0.5 mlマイクロチューブの底と第二クリーンで低リテンションにピアスチューブを配置し、1.5ミリリットルマイクロチューブ。 〜15000×gで5分間遠心する。
    2. 視覚的に全体のゲル切片は、内管の穴を通って移動したことを確認します。必要であれば、近い穴にいくつかのゲルフラグメントをプッシュするクリーンなピペットチップを使用しています。
    3. 空の0.5ミリリットルチューブを捨てるとアクリルアミドスラリーに高塩カラムバッファー（HSCB 400のNaCl、25mMのトリス塩酸pH7.5で、0.1％SDS）400μlのを追加します。 4℃で一晩ロック管（群）。
    4. ワイドボアピペットチップを用いて0.22ミクロンの酢酸セルローススピンカラムにスラリーを移す。離れアクリルアミドゲルマトリックスからすべての液体を収集する〜15000×gで室温で3分間遠心。
    5. クリーンで低保持力に液体を移す、1.5ミリリットルチューブ含める20 mg / mlのグリコーゲンを1μlる。等量のイソプロパノールおよび1/10体積の酢酸ナトリウムを加える。チューブを数回反転させることによって溶液を混合し、20分間℃の冷凍庫-80℃で沈殿する。
    6. 20分間、4℃でフルスピードで遠心機は、核酸をペレット化する。上清を除去し、70％エタノールで洗う。室温で10分間空気乾燥したペレットを、5 'ライゲーション工程に直接進む。

リンカハイブリッド3.リンカーライゲーション5 'へのmiRNA-3の終わり」

  1. ペレット化核酸に、次のコンポーネントを追加します。2μlのPEG 8000（50％w / v）の、0.5μlの10倍のRNAリガーゼバッファー、0.5μlのATP（10mM）を、0.5μlのNN-RNAオリゴ（100μM）、およびH 4μlの最終体積に2 Oの。
    NOTE：5'-反転ジデオキシTCUACAGUCCGACGAUCNN3は以下 'および製造業者によってHPLCで精製したように、「NN-RNAオリゴ'の組成物である。
  2. ミックス繰り返し上下にピペッティングすることによって、このサンプル。ペレットが完全に再可溶化されたことを確認するためにいくつかの時間（最大5分）のためにこれを行う。再可溶化は、問題がある場合は、37℃にサンプル短時間（3~5分）を加熱し、混合するためのピペッティングを再開する。
  3. RNase阻害剤およびT4 RNAリガーゼ1（5台）の1：1混合ペレットを溶液中に帰ってきたら、1の1μLを含むクリーンなPCRチューブに内容を転送。再び上下にピペッティングして混ぜる。
  4. 4時間、37℃でサーマルサイクラーで反応をインキュベートする。 cDNA合成に即座に進みます。

4.逆転写/ cDNA合成

  1. 5に次のコンポーネントを追加 'ライゲーション反応：2μlの5×RT緩衝液、0.75μlの100 mMのDTT、1μlのイルミナのRTプライマー5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'（1μM）、および0.5μlのdNTP類（10 mM）を。
  2. 5分間65℃にピペッティングし、熱で混ぜる。そして、ゆっくりとベンチtに冷やすオペアンプ。
  3. 反応物を氷の上で室温、場所管に冷却し、逆転写酵素およびRNase阻害剤のそれぞれ0.5μlを添加したら。メーカーの説明書に示された伸長工程のためのサーマルサイクラー中でピペッティングと場所によって混ぜる。
  4. 一度15μlの最大のcDNAライブラリの最終容量を持って来るためにヌクレアーゼフリーのH 2 O 5μlを添加完了。

5.ライブラリの準備

  1. インデクシングPCRに、氷上で以下の反応を組み立てる：6μlの5倍のPhusionバッファー、1μlのdNTPを（10 mM）を、0.9μlのDMSO、0.75μlの5 'プライマー（25μM）、0.75μlの3'プライマー（25μM）を、 3μlのcDNAライブラリー（入力の量に応じて可変濃度）、0.5μlののPhusionポリメラーゼ（1単位）、ヌクレアーゼフリーのH 2 O を 30μlの最終体積に。テンプレートとのシーケンシングプラットフォームとの互換性を確保するためのプライマー配列を選択してください選択肢。
    1. 最初の4サイクルの間、3分間98℃での初期変性、15秒間98℃の変性、15秒間50℃でのアニーリング、15秒間72℃、延長：以下の設定でPCR反応を実行。
      NOTE：入力材料の量に依存して、総PCRサイクル数を変化させる。典型的に、総RNAの1-2μgの入力のために、合計13回のPCRサイクルは、miR-配列のライブラリーを作製するのに十分である。
    2. アニーリングおよび伸長のサイクルを合わせて30秒の変性、70℃で実施される二段階の方法で、 例えばその後のサイクル、サイクル5-12を行うには、再び15秒間98℃である。
      注：反応容量は、PCRプログラムを一時停止可能にし、所望の生成物の出現をモニターするために予め定められたサイクル数での10μlのアリコートを除去し、30μlのである。典型的には、サイクル10、13、及び16は、全RNA試料からの試験のために選択される。
  2. 準備する40％アクリルアミド2mlの10×TBEを1ml、及びH 2 O 10 mlまで混合することによって、8％非変性アクリルアミドゲル。次いで10％のAPSを100μlとTEMED10μlのを追加します。ゲルを注ぎ、セットしてみましょう。
    1. 30分間のゲル幅の12 V / cmのでゲルを事前に実行します。 ·フラッシュ井戸。 （mMのEDTA、20mMトリス塩酸pH8.0で、0.1％（）​​はw / vの66、15％のフィコール-400、SDS、0.01％（v）のブロモフェノールブルー/ w）の10倍のローディングバッファーの1μlを加え、10μlのを追加寸法×15ミリメートル×1ミリメートル5ミリメートルの各ウェルにサンプル。一般的に、各ウェルは、サンプルの30μlにまで読み込むことができます。ブロモフェノールブルー色素がちょうどゲルの底部がなくなるまで1×TBE緩衝液中のゲル幅の10 V / cmのでサンプルゲルを実行します。
    2. ステップ2.3で説明したようにゲルを染色して可視化する。
    3. 146塩基対のバンドを切除し、セクション2.4に記載されているものと同様の方法でHSCB 0.25mlの中で一晩溶出する。等量のイソプロパノールおよび1/10体積の酢酸ナトリウムでDNAを沈殿。 70％Eの洗浄ペレットTE緩衝液中thanol再懸濁。
    4. 製造業者の推奨に従ってピコグリーンを使ってライブラリを定量化する。

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結果

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先行する方法のため、予想される結果は、最初に第M RNAリガーゼによるアデニル化（ 図2）に供したDNAオリゴヌクレオチドのサイズの単一のヌクレオチドシフト（増加）の観察である必要があります。 3 'ライゲーション後、アクリルアミドゲルの視覚化は、ゲルの100-300ヌクレオチド領域において明らか鋭い高分子量のバンド（ 図3参照）を示している。これは、使用中の総RNA試料は高品質であることを示している（劣化していない）。第二に1が過剰、ライゲーションされていない3 'リンカーであるゲルの25ヌクレオチド領域、で非常に明るい信号を観測する必要があります。それはまた、3 'ライゲーションにおける無入力RNA対照を含めることが役に立つかもしれません。これは、3 'リンカーの純度を示すであろうし、また非特異的なシグナルが問題となるときのサイクル数の表示のためのPCR工程を介して行うことができる。 5 'ライゲーションのための診断はありませんしかし、 図4に示す使用さPEG8000高濃度の重要性を示している放射性標識RNAを用い...

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ディスカッション

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本明細書中に記載される方法論は、ライゲーション効率を最大化するためにいくつかの重要な変数の使用、すなわち、高いPEG濃度の、ランダム化されたリンカーの使用、およびリンカー2,6,9-高濃度になる。このアプローチは、総RNAサンプル2から確実に定量的なシーケンシングライブラリーを可能にする。我々は、入力されたRNAの複数の滴定を実施しており、先行する方法は1-8μgの範囲（データは示していない）中の全RNAの量に最も適していると結論している。 10〜500 ngの範囲の量が使用される場合、読み取り領域の大部分は、アダプタコンカテマーおよびRNAリガーゼは、精製される細菌配列によって消費される。しかし、低中の番号を読み出しても、同一の高い入力サンプルと比較した場合に存在するmiR種は、まだ実際の量を反映しているこれらの低入力の実験で注目に値する。トータルRNAサンプルから観察されたmiRプロファイルは、実際の反射であることを保証するために異なる試料の反対尋問を許可する金額、および、我々は日常的に3合成キャリブレーターRNAを12の10倍希釈液が含まれています。 0.01：異な...

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、リンカーの設計と結紮効率に関する有意義な議論をしてくださったYi研究室のメンバー、特にZhaojie Zhangに感謝したいと思います。また、J.E.L.へのポスドクフェローシップ（#125209を通じてこの研究を支援してくださったAmerican Cancer Societyに感謝します。この出版物で報告された研究は、国立衛生研究所の国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所の賞番号でも支援されました。R01AR059697(R.Y.へ)とLinda Crnic Institute for Down Syndromeからの研究助成金。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3' リンカー (5' リン酸化、3' ブロック)Integrated DNA Technologiescustom
5' LinkerIntegrated DNA Technologiescustom5' blocked, HPLC purified
T4RNL2 (1-249 K227Q)New England BiolabsM0351SSpecialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters
10x Ligation buffer (without ATP)ニューイングランドM0351S
10x ライゲーションバッファー(ATP付き)バイオM0204L
RNaseOUTInvitrogen10777-019
ポリエチレングリコール(分子量8,000に含まれるニューイングランドバイオラボM0204L
ヌクレアーゼフリー水AmbionAM9937に含まれる蒸留装置から採取した水は、非常に質が高いことがわかりました。
T4RNL1New England BiolabsM0204L
Superscript III RT kitInvitrogen18080-051 
Phusion PCRキットNew England BiolabsM0530S
Illumina RP1 primerIntegrated DNA Technologiesカスタムシーケンス情報 Illumina
Illumina RT primerIntegrated DNA Technologiesカスタムシーケンス情報 Illumina
Illumina index primer(s)DNA TechnologiescustomIllumina
40% アクリルアミドフィッシャー サイエンティフィックBP14081
尿素Sigma AldrichU6504
過硫酸アンモニウムSigma AldrichA3678
テトラメチエチレンジアミン (TEMED)Sigma AldrichT9281
2x 変性 RNA ローディングバッファーニューイングランド バイオラボ付属M0351S
カミソリ刃付きVWR55411-050
SpinX Centricon チューブCostarCLS8161
低保持マイクロフュージチューブフィッシャーサイエンティフィック02-681-320
Sybr GoldInvitrogenS-11494
アデニル化キットニューイングランド バイオラボE2610L
に含まれるラボ)Integrated

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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RNA miR Seq RNA cDNA miRNA

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